叶绿体的分离与荧光观察

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,叶绿体的分离与荧光观察,NO. 1,2016.3. 28,细胞生物学实验,1,实验目的,通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。,观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。,2,实验原理,将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。,低速离心,中速离心,高速离心,超高速离心,细胞匀浆,细胞,核仁,细胞骨架,大细胞器,小细胞器,核糖体,大分子,叶绿体的分离应在等渗溶液中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。,因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。,3,实验用品,材料 新鲜菠菜。,试剂,0.35mol/L,氯化钠溶液，,0.01%,吖啶橙,(,acridine,orange),。,器材,(1),主要设备,:,普通离心机、组织捣碎机、,粗天平、荧光显微镜。,(2),小型器材,:,烧杯,量筒,滴管,刻度离心管,纱布，,无荧光载片和盖片。,4,实验方法,一、叶绿体的分离与观察,1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。,2. 低速匀浆35min。,3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。,4.,每组,取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。,5. 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。,6. 将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。,7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。,(1)在普通光镜下观察。,(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。,(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。,5,实验方法,二、菠菜叶,手撕片,观察,轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。,(1)在普通光镜下观察。,(2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。,(3) 观察其间接荧光：向所制手撕片上滴加12滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光。,6,实验结果,一、叶绿体的分离和观察,二、菠菜叶手撕片观察,7,作业,1. 在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？,2. 游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，其颜色和强度有无差异？为什么？,8,9,10,11,12,