免疫细胞化学多媒体

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章,免疫细胞化学技术,（免疫组化）,( immunocytochemistry ),是利用免疫反应来定位组织和,细胞中特异大分子的一类技术,1,第一节 免疫细胞化学原理,第二节 免疫细胞化学方法,免疫细胞化学技术,2,一、免疫反应的特异性,二、免疫细胞化学反应,三、抗原,四、抗体,五、标记物及其在光镜和电镜下可见性,第一节 免疫细胞化学原理,3,免疫反应的特异性表现在：,抗原,作为一类结构复杂的大分子能刺激机体,产生对其特异的抗体并与抗体发生反应,抗体,针对某种抗原分子而产生的，特异地识,别该抗原并与其结合,一、免疫反应的特异性,4,免疫细胞化学反应的原理,：,把组织细胞中的特异分,子作为抗原,用在显微镜下可,见的标记物标记特异抗体(或,者标记抗原抗体复合物)使特,异的免疫化学反应具有可见,性,从而间接地显示抗原,达,到在细胞或细胞器水平定位,特异分子的目的,二、免疫细胞化学反应,5,组织抗原,抗体,标记物,标记抗体,1 荧光,2 酶,3 亲和技术,4 金标,6,抗原,免疫细胞化学反应过程为：,标记物,7,间接法,直接法,两种免疫反应方法,8,9,抗 原：,凡能刺激机体产生抗体并能与,抗体特异结合的物质称为抗原,抗原性：,物质所具有的这种特性称为抗原性,三、抗原,10,细胞中具有抗原性的化学成分有：,蛋白质 多肽 脂蛋白 多糖,脂多糖 糖蛋白 核蛋白,这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗?,从生物学功能来看都包括了哪些物质?,11,酶、 受体、 抗体、 细胞外基质,激素、 细胞结构蛋白、病原体,等,具有抗原性的物质包括：,12,四、抗体,C,C,Fc,Fab,N,N,N,N,C,C,13,Fab片段,具有抗体活性，决定某种抗体,与抗原结合的能力和特异性,Fc片段,决定该抗体本身作为抗原刺激,机体产生抗体的能力和特异性,决定其本身抗原性,抗体的结构,14,免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：,抗 血 清 多克隆抗体，是用提纯的抗原,免疫动物后从动物血清制备得,到的,单克隆抗体 是指由单个产生特异抗体的,淋巴细胞分化增殖形成的,细胞克隆产生的抗,体,15,1 免疫荧光技术,2 免疫酶技,术,3 免疫亲和技,术,4 胶体金技,术,五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性,标记物,使抗体或抗原,抗体复合物在,各种显微镜下,可的物质,16,免疫荧光技术将,荧光素作为标记物,使组织细胞中形成的抗原抗体复合,物在,荧光显微镜,下可见，从而显示,抗原物质的定位,（,一） 免疫荧光技术,17,.异硫氰酸荧光素 .四乙基罗达明,.四甲基异硫氰酸罗达明 .藻红蛋白,分子量不同,最大吸收光谱不同,最大发射光谱不同,与蛋白结合方式不同,呈现不同的荧光：,黄绿色荧光,橙色荧光,橙红色荧光,等,荧光素,能产生荧光并能作为染料的一类化合物,18,荧 光,：,在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失,荧光,显微镜,：,荧光显微镜的光源提供各种,激发光,，如,紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）,使受检标本内的荧光物质发光,19,是将,酶作为标记,物,使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位,（二） 免疫酶技术,20,1.反应产物定位准确，颜色对比清晰,2.反应后标本材料可长期保存,3.能用于电镜观察,免疫酶技术,优点：,21,酶,抗原,一抗,二抗,酶标二抗,酶抗酶抗体复合物,抗酶抗体,22,酶标抗体法,抗酶抗体法,复合物法,酶标记的三种形式,23,用交联剂将酶与抗体联接成酶标抗体,用于直接法和间接法,酶标抗体法,24,用酶免疫动物获得抗酶抗体，通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接在一抗上,再加入酶及其底物，达到用酶标记抗原抗体反应的效果,由于产生抗酶抗体的动物与产生第一抗体的动物是同一种属，两种抗体具有相同的免疫源性，所以在反应中本来针对一抗的二抗也能与抗酶抗体结合,抗酶抗体法或称酶桥法,25,先获得抗酶抗体并将抗酶抗体与酶一起预先制成酶抗酶抗体复合物,在反应中，由二抗的桥梁作用把复合物与一抗连接在一起,最后加入底物，从而达到用酶标记抗原抗体反应的效果,优点: 1、抗体活性高,2、灵敏度高,酶抗酶抗体复合物法,26,常用的标记酶：,1.,辣根过氧化物酶,2,.碱性磷酸酶,常用的两种方法是：,（1）过氧化物酶标记抗体法,（2）过氧化物,酶,-,抗,过氧化物,酶复合物法,（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）,一抗与组织抗原特异结合,二抗又将PAP复合物与第一抗体连接在一起,然后加入HRP的天然底物H,2,O,2,和捕捉底物DAB,光镜-,棕黄色反应产物,(组织抗原的定位),.辣根过氧化物酶,（hoseradish peroxidase, HRP）,27,.碱性磷酸酶,（Alkaline phosphotase, AKP）,碱性磷酸酶技术常用的两种方法：,(1),碱性磷酸酶标记抗体,(2),碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP）,（,A,lkaline,p,hosphotase,A,nti,a,lkaline,p,hosphotase）,APAAP法的原理：,以碱性磷酸酶为标记物,再通过与其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见,常用的底物是萘酚,偶联剂是固蓝、固红等,常用于标记的酶：,1.,辣根过氧化物酶,2,.碱性磷酸酶,28,利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子,亲和物质,具有多价能力的物质，与亲和物质有高,度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标,记物(荧光素、酶、胶体金等)结合,最常用的亲和物质系统：,1、,生物素,（biotin）与,亲和素,（avidin）,两者结合能力为不可逆的,2、,葡萄球菌A蛋白,与,免疫球蛋白IgG,（三） 亲和细胞化学技术,29,(1),标记亲和素生物素技术,（Labeled avidin biotin, LAB）,(2),桥式亲和素生物素技术,（Bridged avidin biotin,BAB）,(3),亲和素生物素-酶复合物技术,（,A,vidin-,b,iotin peroxidase,c,omplex,method，,ABC,）,1.,生物素系统标记技术的基本方法,30,生物素化酶,生物素化抗体,亲和素生物素,酶复合物,生物素,亲和素,31,生物素与抗体共价偶联后加入与过氧化物酶（或荧光素）结合的亲和素,利用生物素亲和素之间的结合，间接显示组织细胞中的抗原,标记亲和素生物素法,32,利用亲和素为桥梁,连接生物素化的抗,体和生物素化的酶,桥式亲和素生物素法,33,亲和素生物素 - 酶复合物技术,亲和素与生物素偶联的过氧化物酶组合成亲和素生物素,酶复合物,特异性抗体（一抗）先与组织细胞中的抗原结合，,生物素化抗体（二抗）再与一抗结合,复合物与生物素化抗体结合,34,葡萄球菌A蛋,(Staphylocal protein A, SPA),是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白,简称为A蛋白或蛋白A,SPA,能与人及多种哺乳动物血清中,IgG,呈,非特异性结合又能与标记物结合,经标记的,SPA,可代替相应标记的二抗,2.,葡萄球菌A蛋白与IgG系统,亲和素,35,（四） 免疫胶体金技术,免疫胶体金技术是以光镜和电镜下都可见的胶体金作为抗体或蛋白的标记物，间接显示组织细胞中特异分子的技术,胶体金颗粒大小一般在5-60nm,36,胶体金颗粒表面带负电荷，蛋白质表面带正电荷，蛋白质在等电点或偏碱时被吸附于金颗粒表面,形成一个蛋白层阻止了金颗粒的相互接触，使免疫金处于稳定状态,胶体金对蛋白质的标记:,胶体金,A,蛋白,37,1. 免疫金法,(Immunogold staining IGS),2. 免疫金银法,（Immunogold silver staining, IGSS),3. 彩色免疫金银法,（Coloured IGSS, CIGSS）,免疫胶体金技术常用方法,38,免疫金法,一抗与抗原结合,金标抗体或金标A蛋作为二,抗与抗原抗体复合物结合,抗原抗体反应部位在光镜,下呈现红色，在电镜下呈,高电子密度,39,1、,采用不同大小的金颗粒(通常5-20nm),标记不同抗体或A蛋白，达到,双重,甚至,多,重,标记定位多种抗原的目的,2、,金颗粒便于计数，可对反应作,定量分析,3、,可用于透射、扫描电镜和冷冻蚀刻标本,可将结果与光镜免疫金技术结果进行对,照,免疫交体金体金,优点：,40,免疫细胞化学技术是在原位检测细胞中抗原,基本过程: 抗原固定,抗原与抗体结合反应,标记系统反应,第二节 免疫细胞化学方法,41,一、样品制备,二、抗体准备,三、基本实验过程,四、一些关键问题,42,固定,光镜 醛类固定,常规石蜡包埋和切片,(冷冻切片化学固定免疫细胞化学反应),电镜 4多聚甲醛为首选固定剂,( 多聚甲醛混合0.05-0.5%戊二醛 ),包埋前技术 免疫细胞化学反应在未经,包埋的组织片上进行,包埋后技术 免疫细胞化学反应在超薄,切片上进行,一、样品制备,43,抗体制备：特异抗体主要从购买获得,(也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体),抗体标记:,直接法,对每种一抗进行标记，很少用,间接法,对二抗进行标记,(标记二抗使用十分普遍),标记抗体的方法： 1. 荧光素标记抗体方法,2. 酶标记抗体,3. 生物素化抗体,4. 胶体金标记抗体或A蛋白,二、抗体准备,44,免疫细胞化学方法有: 直接法、间接法,间接法中有: 二抗、三抗或复合物,标记系统有: 荧光素、酶、亲和素 胶体金,观察方法有: 荧光显微镜、普通光镜、电镜,三、基本实验过程,45,切片,丙酮固定，石蜡切片,脱蜡,复水,1%H,2,O,2,/,甲醇,阻断,内源性过氧化物酶,正常羊血清(二抗的正常血清),1:20,室温,封闭,适当稀释,一抗,(兔抗体)孵育,适当稀释,二抗,(羊抗体)孵育,适当稀释兔,PAP复合物,孵育,0.04%DAB+0.03%H,2,O,2,显色,，充分水洗终止反应,苏木素衬染,封片,光镜观察,棕褐色阳性,反应沉淀物,过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（PAP法）,46,80nm,左右厚度超薄切片置于镍网上,1-10%H,2,O,2,蚀刻,1%BSA,室温封闭,适当稀释一抗孵育室温,1%BSA,室温封闭,适当稀释的,10-20nm,金标A,含,2%,戊二醛/,3%,多聚甲醛固定,铀、铅染色,电镜观察高电子密度的金颗粒,电镜包埋后胶体金细胞化学反应,47,(,一),样品固定：抗原和结构的保存,(二),抗体、标记物以及方法选择：,单抗、多抗 种属关系,(三),通透处理：蛋白酶、表面活性剂,(四),对照设定：阴性、阳性、自身对照,(五),非特异反应的鉴别和抑制：封闭、稀释 阻断,四、一些关键问题,48,第六章 重点,一、免疫细胞化学反应原理,把组织细胞中的特异分子作为抗原, 用在显微镜下的可见标记物(或标记抗原抗体复合物)标记特异抗体,使特异的免疫化学反应具有可见性,从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的,49,二、简述免疫细胞化学的直接法和间接法,直接法,：组织抗原直接与标记的特异抗体反应,间接法,：,抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应,一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应,50,三、何谓标记物，包括哪几种？,标记物：使抗体或抗原抗体复合物在各种显微,镜下可见的物质,包括：,1、 免疫荧光技术,2、 免疫酶技术,3 免疫亲和技术,4、 胶体金技术,51,52,五、,简述,PAP,法,（,P,eroxidase-,A,nti,p,eroxidase,PAP）,过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法,一抗与组织抗原特异结合,二抗又将PAP复合物与一抗连接在一起,然后加入HRP的天然底物H,2,O,2,和捕捉底物DAB,光镜-,棕黄色反应产物,(组织抗原的定位),电镜-与锇酸反应，呈,高电子密度锇黑,（超微结构,定位抗原）,53,