同工酶实验ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,同工酶实验,*,垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶,（活性染色鉴定法）,1,同工酶实验,实验目的,：,理解同工酶的概念及遗传学意义,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术,掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色,2,同工酶实验,同工酶,是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫,学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达,的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同。,本实验做的是乳酸脱氢酶（,LDH,）的分离鉴定。,3,同工酶实验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理,天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带,净电荷,、,分子质量,、,形状,的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。,多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为,阳极电泳,；,对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为,阴极电泳,。,4,同工酶实验,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的样品,分子量小,分子量大,电源,5,同工酶实验,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒,。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,6,同工酶实验,聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型,相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的,主要靠电荷,和,分子筛效应,进行分离。,不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，,浓缩效应，,然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在,电荷效应,，也有,分子筛效应,。,不连续系统,连续系统,7,同工酶实验,一,、动物组织的样品的获取,二、试剂的配制、仪器的准备,三、分离胶（30分钟）,四、浓缩胶（20分钟）,五、电泳（2-3小时）,六、染色（30分钟）,七、观察结果,实验流程,8,同工酶实验,1.凝胶储备液,：,A,储备液,：,pH8.9 TrisHCl,缓冲液：,1 M HCl 48ml，36.6g Tris,，加 双蒸水到,80ml,，调节,pH,到,8.9,定容到,100ml,。,B储备液,：,pH6.7 TrisHCl,缓冲液：,1 M HCl 48ml，5.98g Tris,，加双蒸水到,80ml,，调节,pH,到,6.7,定容到,100ml,。,C储备液,： 分离胶储备液,（30% Acr/Bis）,：,30g Acr,，,0.8g Bis,，用双蒸水定容到,100ml,，备用，,4,存放可以保存1个月。,D,储备液,： 浓缩胶储备液：,16g Acr，4g Bis，,用双蒸水定容到,100ml,，备用，,4,可以保存,1,个月。,E,储备液,：,10% Aps（W/V）,：,1g,定容到,10ml，-20,保存。,F,储备液,：,40%,蔗糖：,40g,蔗糖溶解到,60ml,双蒸水中。,TEMED,一、试剂：,9,同工酶实验,2.电泳缓冲液：,Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用 时稀释10倍。,3.乳酸脱氢酶染色剂的配制,1M,乳酸钠,0.5ml,NAD 25mg,PMS 2mg,NBT 15mg,0. 2M TrisHcl,溶液,（PH8.0）2ml,去离子水定容至,50ml,10,同工酶实验,器材,：,夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL），培养皿,11,同工酶实验,1.电泳槽,2.梳子,3.制胶器,4.夹胶框,封胶条,1,2,3,4,12,同工酶实验,取材：鲫鱼若干条，解剖取,眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、心脏,，放入冰箱保存。,提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液,Tris-Hcl,(,pH=7.0,) 此溶液需,4,预冷，组织重量（,g,）与缓冲液体积（,mL,）之比为,：5,。用研钵研磨充分。浆液,4,离心约,30,分钟，,15000,转分钟。,取上清液至新管，吸取其中,150ul,样品，加,100ul,甘油和,10ul,溴酚蓝，混匀之后即可点样。,二、样品的制备,13,同工酶实验,三、分离胶的制备,储备液,A储备液,C储备液,双蒸水,E储备液,TEMED,总体积,用量（ml）,2.5,5.0,12.5,100ul,10ul,20,配方表,TEMED,最后一个加入，轻轻混匀，,操作迅速,。胶高度距样品凹玻璃板下缘约,1cm,，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，并使胶面平整。,水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。,14,同工酶实验,四、浓缩胶的制备,TEMED,最后一个加入，轻轻混匀，,操作迅速,。浓缩胶液高度到凹玻璃板下缘,0.5cm,左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约30分钟后，凝胶完全。,小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。,储备液,B储备液,D储备液,双蒸水,F储备液,E储备液,TEMED,总体积,用量（ml）,1.25,2.5,1.2,5,60ul,16ul,10,配方表,15,同工酶实验,点样,加样,样品迁移方向,16,同工酶实验,五、电 泳,电压和电流：电压180V， 电流流1830mA；,溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。,17,同工酶实验,六、染色与观察,揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。,观察拍照,18,同工酶实验,m：肌肉（muscle）；l：肝脏（liver）；k：肾脏（kidney）；s：脾脏（spleen）；h：心（heart）； e：眼睛（eye）；f：鳍（fin）；g：鳃（gill）；b：脑（brain）,19,同工酶实验,思考题：,根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？,为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和,甘油,溶液？分别有何用途？,20,同工酶实验,谢谢,21,同工酶实验,附：,分离胶、浓缩胶配方,储备液,A储备液,C储备液,双蒸水,E储备液,(APS),TEMED,总体积,用量（ml）,2.5,5.0,12.5,100ul,10ul,20,储备液,B储备液,D储备液,双蒸水,F储备液,E储备液,(APS),TEMED,总体积,用量（ml）,1.25,2.5,1.2,5,60ul,16ul,10,22,同工酶实验,