生化chapter+03-07+amino+acids+and+proteins-2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章,氨基酸与蛋白质,教材 第,3-7,章,What is the structure, chemistry, and biological function of amino acids,，,peptides,，,proteins?,1,结构,性质,结构,性质,分离,纯化,测定,氨基酸,肽,蛋白质,概念,分类,功能,2,3,第二章 蛋白质的共价结构,1,、蛋白质通论,3,、蛋白质一级结构,2,、肽,4,、一级结构生物学意义,5,、人工合成,4,蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物；,蛋白质是生命的物质基础；,英文名称,protein,，是“最原初的” “第一重要的”意思，是由,20,种,L,型,-,氨基酸组成,的生物大分子；,占人体干中的,45,；最简单的单细胞（大肠杆菌）每个菌体约有,3000,种不同的蛋白质；,机体的新陈代谢的全部化学反应均有蛋白质（酶）的参与；,1.1,蛋白质的化学组成,5,多数蛋白质含,:,碳,(C)50,56%,氢,(H)6,8%,氧,(O)19,24%,氮,(N)13,19%,硫,(S)0,4%,有些蛋白质含有磷，少数含铁、铜、锰、锌、钴、钼等，个别还含有碘,各种蛋白质的含氮量平均为,16,1.1,蛋白质的化学组成,凯氏,(Kjedahl),定氮法,每克样品含氮的克数, 6.25100,=100,克样品中蛋白质的含量,(,克,%),6,帮助构建肌肉的巨型蛋白,titin,7,含氮量很高，生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大地利益驱动,;,有人估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的,1/5;,三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因,;,1994,年,国际化学品安全手册,表明,:,长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。,为什么要用三聚氰胺呢？,1.1,蛋白质的化学组成,8,根据蛋白质分子的组成成分分类,根据溶解度分类,根据分子形状分类,根据蛋白质的生物学功能分类,1.2,蛋白质的分类,9,蛋白质,功能,形状,球蛋白：球形、易溶解。,组成,溶解性,纤维蛋白,：,形似纤维、不溶于水,单纯蛋白：只有,氨基酸，多数蛋白,清蛋白（白蛋白）：溶于水,球蛋白：微溶于水，溶于稀盐,醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇,缀合蛋白：与非蛋白质物质结合，如核蛋白、糖蛋白和脂蛋白,活性蛋白：如酶、激素，受体、膜蛋白,非活性蛋白：胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白,1.2,蛋白质的分类,10,Three basic classes according to shape and solubility,1.2,蛋白质的分类,11,12,此外，还可以根据蛋白质的特定结构域或氨基酸模体特性分类；,根据结构与功能的关系，将具有相同或类似结构域或模体的蛋白质（同源蛋白质）归为一大类、一类或一组，分别称为超家族、家族或亚家族；,1.2,蛋白质的分类,13,胶原蛋白的结构,1.2,蛋白质的分类,14,1.2,蛋白质的分类,胶原蛋白的结构,15,生物体内胶原蛋白网,1.2,蛋白质的分类,16,球状蛋白,1.2,蛋白质的分类,17,1.3,蛋白质的结构层次,18,1.3,蛋白质的结构层次,19,20,1,生物催化,功能,2,结构,功能,3,转运,功能,4,运动,功能,5,营养和贮存,功能,6,调控,功能,7,保护和防御,功能,8,接受和传递,信息,功能,1.4,蛋白质的功能,21,22,23,酶,生物催化,1.4,蛋白质的功能,24,人体的毛发、蜘蛛网的网丝等都是,结构,蛋白,1.4,蛋白质的功能,25,血红蛋白属于,运输,蛋白,1.4,蛋白质的功能,26,伸缩蛋白与结构蛋白可共同完成肌肉的,运动,1.4,蛋白质的功能,27,西非丛林地区的黑人擅长短跑、跳远、篮球等需要强爆发力的项目；,合成,辅肌动蛋白的,ACTN3,基因的某种变异体在西非裔黑人的基因库中频率很高；,这些变体所合成的肌动蛋白恰恰提高了肌肉快速运动能力；,关于奥运会上的牙买加选手,1.4,蛋白质的功能,28,卵清蛋白属于,贮藏,蛋白,1.4,蛋白质的功能,29,胰岛素,调控,1.4,蛋白质的功能,30,免疫球蛋白属于,保护,蛋白,1.4,蛋白质的功能,31,某些蛋白可在细胞内和细胞间进行,信号传递,1.4,蛋白质的功能,32,Chymotrypsin,胰凝乳蛋白酶,with its active site,1.5,典型蛋白质,33,钾电位门通道,1.5,典型蛋白质,34,四种,ATP,驱动的离子泵,1.5,典型蛋白质,35,Aquaporin(,水通道蛋白,),大肠杆菌水通道蛋白,Z,（,AQP Z,）是大肠杆菌细胞的一个非常重要的水通道蛋白质，由,693,个氨基酸残基组成，与哺乳动物水通道蛋白具有,30%,的同源性，预测具有,6,个跨膜区域，通常以四聚体形式存在，并具有极强的水渗透功能，具有典型的,“,漏沙,”,水渗透机理。在,1,个渗透梯度条件下，它的水渗透能力是（,2-10,）,10-14 cm3/sec.subunit,且活化能很低（,3.7kcal/mol,）。以这个速率，在,1,个渗透梯度条件下（大概,25,个大气压），大概,0.14,微克大肠杆菌水通道蛋白,Z,就能回收一个人一天产生的废水。假定水通道蛋白表面密度为,10%,，,1.3cm2,的过滤膜就可以完成一个人一天废水的回收。由于水通道蛋白非常稳定，对蛋白酶具有抗性，而且不被其他的生物大分子抑制，所以水通道蛋白为基础的水回收技术在宇宙空间飞行和多种陆地应用等方面都具有潜在的重要应用。,1.5,典型蛋白质,36,The protein keratin is the chief structural components of hair, scales, horn, wool, nails and feathers.,1.5,典型蛋白质,37,38,Acetylcholine receptor,1.5,典型蛋白质,39,2.1,肽键,肽键就是由氨基酸的,-,羧基与相邻的氨基酸的,-,氨基脱水缩合起来的键。,40,肽,:,氨基酸通过肽键连结起来的化合物。,二肽,:,两个氨基酸形成的肽。,三肽,:,三个氨基酸形成的肽。,多肽,:,许多氨基酸形成的肽。,蛋白质,:,多是组成氨基酸超过,100,个的多肽。,氨基酸残基,:,氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整。,末端氨基和末端羧基：,缩合后的氨基酸，只在肽的两端有自由的,-,氨基和,-,羧基，简称,N-,端和,C-,端。,2.2,肽,41,肽链的命名：,根据组成的氨基酸残基来确定。规定从肽链的,N-,端残基开始，依次称为某氨基酰、氨基酰,某氨基酸。如：,2.2,肽,42,2.2,肽,43,反式构型的肽键,2.3,肽的结构,44,由于肽键不能自由旋转，组成肽基的,4,个原子和与之相连的,2,个,-,碳原子都处于一个平面内，此刚性结构的平面称为肽平面或酰胺平面,2.3,肽的结构,45,46,许多短肽的晶体，均为离子晶格，熔点很高，在水溶液中以偶极离子存在；,肽的酸碱性质主要来自游离末端,-NH,2,、,-COOH,以及侧链,R,基上可解离的基团；,小肽的很多性质与游离的氨基酸相似；,每一种肽也有其等电点，其中小肽的计算方法与氨基酸相同；,肽的游离,-NH,2,、,-COOH,以及侧链,R,基也可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。,2.4,肽的理化性质,47,48,谷胱甘肽（,GSH,）：,多肽类激素：催产素（,Oxytocin,）等,脑啡肽（,enkephalin,）：,多肽类抗生素：短杆菌肽,S,（,Gramicidin S,）等,肽类毒素：,-,鹅膏蕈碱（,-,amanitin,）,GSH,Oxytocin,Enkephalin,Gramicidin S,-,amanitin,2.5,天然存在的活性肽,49,蛋白质的一级结构,就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，又被称为,氨基酸序列；,在有二硫键的蛋白质中，一级结构也包括二硫键和其配对方式。,3.1,蛋白质的一级结构,50,3.1,蛋白质的一级结构,51,我国,1965,年在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质就是这种牛胰岛素。,3.1,蛋白质的一级结构,52,1,测定氨基酸的组成,2,蛋白质的,N-,末端和,C-,末端的测定,3,二硫键的拆开和肽链的分离,4,肽链的部分水解和肽段的分离,5,肽段氨基酸顺序的测定,6,二硫键位置的确定,3.2,蛋白质的一级结构测定,53,确定蛋白质所含氨基酸的种类，并明确每种氨基酸有多少。,目前较为成功的是将蛋白质经,6 mol/L HCl,在,110,下水解,24 h,后，用氨基酸自动分析仪进行测定。,3.2.1,氨基酸组成,54,55,Sanger,法。,2,4-,二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链,N-,端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（,DNP,）。,在酸性条件下水解，得到黄色,DNP-,氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的,DNP-,氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,2,4-,二硝基氟苯法,3.2.2 N-,末端氨基酸测定,56,氰酸盐法,此法最大优点是除去,N,末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。因此，可以用来一步步地测定多肽链,N,末端的氨基酸顺序。氨基酸分析仪就是根据此原理制成的。,3.2.2 N-,末端氨基酸测定,57,丹磺酰氯法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与,N-,端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰,-,氨基酸。,此法的优点是丹磺酰,-,氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到,1,10,-9,mol,。,3.2.2 N-,末端氨基酸测定,58,氨肽酶法,从多肽链的,N-,端逐个的向里水解,。,可根据,不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的,N-,末端残基顺序,。,最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为,N-,末端的肽键速度最大,。,3.2.2 N-,末端氨基酸测定,59,多肽与肼在无水条件下加热，,C-,端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与,C-,端氨基酸分离。,肼解法,3.2.3 C-,末端氨基酸测定,60,羧肽酶水解法,能从多肽链的,C-,端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的,C-,末端残基顺序,。,目前常用的羧肽酶有四种：,A,B,C,和,Y,。,A,和,B,来自胰脏；,C,来自柑桔叶；,Y,来自面包酵母,。,羧肽酶,A,能水解除,Pro,Arg,和,Lys,以外的所有,C-,末端氨基酸残基；,B,只能水解,Arg,和,Lys,为,C-,末端残基的肽键,。,但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结果不好分析。,3.2.3 C-,末端氨基酸测定,61,羧肽酶水解法,3.2.3 C-,末端氨基酸测定,62,氨基酸的释放量（摩尔数）,反应时间,Gly,Ser,Val,判断序列,-Val-Ser-Gly-COOH,羧肽酶水解法,3.2.3 C-,末端氨基酸测定,63,最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸巯基，以防它重新被氧化。,二硫键拆开后形成的个别肽链，可能用纸层析、离子交换柱层析、逆流分溶、区带电泳等方法进行分离。,3.2.4,二硫键拆开和肽链分离,64,SH +SH,S S,HOCH,2,CH,2,SH,ICH,2,COOH,涉及反应,pH8.09.0,室温,S CH,2,COO,3.2.4,二硫键拆开和肽链分离,65,化学法,有溴化氰法、部分酸水解法、羟胺法和,N-,溴代琥珀酰亚胺法等。,酶解法,有较强专一性，水解产率也较高。,常用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等。,处理后得到的肽段，主要通过凝胶过滤法分离，常辅以离子交换层析法。,3.2.5,肽链部分水解和分离,66,67,68,主要是,Edman,降解法。,P. Edman,于,1950,年首先提出。,Edman,降解试剂（,PITC,）与多肽链的游离末端氨基作用，降解反应分偶联、环化断裂和转化三个步骤。,3.2.6,肽段氨基酸顺序测定,69,酶解法,主要是肽谱重迭法，是在化学法所得结果的前期下进行的氨基酸序列分析。,测定多肽链中分离出来的各个小肽段，可以应用化学方法或酶学方法测出其中的氨基酸顺序。然后比较用不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此有重叠的部分，确定每个肽段的适当位置。拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。,3.2.6,肽段氨基酸顺序测定,70,71,肽,顺序,A,1,B,1,A,2,B,2,A,3,B,3,A,4,Ala.Phe(,丙,-,苯丙,),Ala.Phe.Gly.Lys(,甘,-,赖,),Gly.Lys.Asn.Tyr(-,天冬酰,-,酪,),Asn.Tyr.Arg(-,精,),Arg.Trp(-,色,),Trp.His(-,组,),His.Val(-,缬,),十肽顺序,Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Trp.His.Val,3.2.6,肽段氨基酸顺序测定,72,73,一般可用蛋白酶或酸直接水解原来的蛋白质，从部分水解产物中分离出含有二硫键的肽段，所得到的肽段混合物可用,Brown,及,Harltay,的对角线电泳技术进行分离，确定二硫键位置。,一般用胃蛋白酶水解原来的含二硫链的蛋白质。因为胃蛋白酶专一性较低，切点多，这样生成的肽段（包括含有二硫桥的肽段）都比较小，后面的分离、鉴定工作均比较容易进行。其次是胃蛋白酶的,pH,在酸性范围（,1,2,），有利于防止二硫键发生交换反应而造成麻烦。,3.2.7,二硫键位置测定,74,3.2.7,二硫键位置测定,75,Brown,和,Hartlay,对角线电泳图解,+,-,+,-,第二向,第一向,a,b,pH6.5,图中,a,、,b,两个斑点是,由一个二硫键断裂产生的肽段。,3.2.7,二硫键位置测定,76,77,4.1,一级结构的生物学意义,78,79,80,81,生物形态与分子结构在进化过程中是向着多样化和专一化方向发展的。,蛋白质的合成是受核酸控制的，但是随着生物环境的变化，,DNA,也会发生偶然的突变，这将必然影响蛋白质的生物合成，引起蛋白质某些氨基酸的变化。,氨基酸的改变可能导致蛋白质的生物学功能丧失或更加完善。,4.2,一级结构的进化,82,半乳糖苷酶是一种催化半乳糖水解为单糖的水解酶蛋白，在细菌、真菌、动物和人体内均被发现。,来源于细菌中的,半乳糖苷酶为四聚体。,每个亚基又有五个不同的结构域组成。,在第三个结构域中存在,/,或称为“,TIM”,桶的结构，酶的活性中心就存在于该结构的,C,末端。因此，该酶蛋白具有四个活性中心。,4.3,蛋白质的一级结构与高级结构,83,半乳糖苷酶的立体结构,4.3,蛋白质的一级结构与高级结构,84,血红蛋白是高等动物体内负责运载氧的一种蛋白质。,人体血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个,亚基（,141,个残基）和两个,亚基（,146,个残基），可以自动组装成,22,的形态。,每个亚基的血红素结合,1,分子氧，血红蛋白四聚体可结合,4,分子氧。,4.3,蛋白质的一级结构与高级结构,85,分子病是指由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，从而造成生物体生理功能变化而引起的疾病，镰刀形红细胞贫血病的血红细胞成镰刀状，容易发生溶血，从而造成严重贫血。,原因是患者血红蛋白（,HbS,）与正常人血红蛋白（,HbA,）,亚基中有一个氨基酸残基不同。,链,N,端氨基酸序列,1 2 3 4 5 6 7 8,HbS,（患者）,Val,His,Leu,Thr,Pro,Val,Glu,Lys,HbA,（正常人）,Val,His,Leu,Thr,Pro,Glu,Glu,Lys,4.3,蛋白质的一级结构与高级结构,86,正常红细胞（左）与镰刀形红细胞（右）,4.3,蛋白质的一级结构与高级结构,87,9-fluorenyl(,芴基,),-methoxycarbobyl (Fmoc) Group,5.,蛋白质或多肽的人工合成,多肽合成就是把氨基酸按一定的顺序排列起来，利用氨基和羧基的脱水形成肽键，进而得到人们所需要结构的多肽。,88,5.,蛋白质或多肽的人工合成,89,