实用电子显微镜技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实用电子显微镜技术,测试中心 陈义芳,2010,年,1,绪论 电子显微镜技术发展简史,第一节 电子显微镜发展简史,第二节 电子显微镜技术的发展与应用,第三节 其他显微技术的发展,2,第一节 电子显微镜发展简史,电子显微镜通常分为透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种类型。利用电子显微镜可对样品内部结构及样品表面形貌进行超微结构的观察与研究。,3,制造者,荷兰眼镜制造商Janssen,英国科学家和发明家罗伯特.胡克,荷兰业余科学家列文.虎克,德国物理学家Knoll和Ruska,Ardenne,德国Siemens公司,英国剑桥科学仪器有限公司,中国科学院长春光学精密机械与物理研究所,中国科学院北京科学仪器厂,瑞士科学家Binnig、Rohrer、Gerber和Weible,中国科学院白春礼,年代,1590,1665,1665,1932,1938,1939,1965,1959,1975,1981,1990,显微镜,发明了放大20-30倍的复式光学显微镜,自制复式显微镜。观察软木薄片，第一次描述植物细胞结构,利用小型高倍透镜制成简单显微镜，放大倍数达300倍，观察动植物活细胞与原生动物，第一次看到许多单细胞生物。,研制成功第一台透射电子显微镜,研制成功第一台扫描电子显微镜,生产了第一台商品用的透射电子显微镜,扫描电子显微镜作为商品问世,研制成功第一台透射电子显微镜,研制成功第一台扫描电子显微镜,发明扫描隧道显微镜,主持研制成功首台原子力显微镜,表,1-1,显微镜发展简史,4,电子显微镜之父,E.Ruska,世界上第一台电子显微镜,5,仪器名称：透射电子显微镜,生产厂家：荷兰,Philips,公司,仪器型号：,Tecnai 12,主要附件：,Gatan 792 CCD,性能指标：,最大放大倍数：,65,万倍,点分辨率：,0.24nm,线分辨率：,0.14nm,最高加速电压：,120KV,6,一、国外电子显微镜生产简况,1932年德国物理学家Knoll和Ruska研制成功第一台透射电子显微镜。,20世纪80年代末，商品透射电子显微镜普遍进入市场。,电镜厂家：日本日立（Hitachi）公司,日本电子光学实验室（JEOL),荷兰菲利浦公司（Philips）（即美国FEI公司）,德国蔡司（Zeiss）公司,捷克,英国剑桥,7,二、国内电子显微镜生产简况,1959,中国科学院长春光学精密机械与物理研究所研制成功第一台透射电子显微镜,10,万倍,100kv,重大科学技术成果,1975,中国科学院北京科学仪器厂研制成功第一台扫描电子显微镜,电镜厂家：中国科学院北京科学仪器厂研制中心,上海电子光学技术研究所,南京光学仪器厂,三、电子显微镜的发展,分辨率进一步提高，点分辨率优于,0.3nm,，晶格分辨率,0.1-0.2nm,放大倍数从十几倍提高到几十万甚至百万倍,种类不断增加，功能不断扩展。（,TEM、SEM、STEM,、分析电子显微镜、高压透射电子显微镜、低温透射电子显微镜等）,计算机技术开始用于电子显微镜,8,一、电子显微镜技术的发展,第一台电子显微镜问世后，面临的首要问题是如何将电子显微镜技术应用于生物学及其他学科研究。,电子显微镜结构的改进和功能的改善，样品制备技术的改进，使电子显微镜技术在生命科学研究中发挥了重要作用。,第二节 电子显微镜技术的发展与应用,9,表1-2 电子显微镜技术发展简史,年代,1934,1946,1947,1949,1950,1952,1956,1953,1955,1956,1956,1958,1959,1961,1957,1963,1939,1939,1962,1971,1974,1977,1978,研究者,Marotn,Williams和Wyckoff,Claude,Latta和Hartmann,Palade,Palade和Siekevitz,Porter和Blum,Moran,Hall和Huxley,Luft,Glauert,Watson,Moran,Luff,Steere,Sabatini及同事,Kauschehe和Ruska,Horisberger,Feldherr和Marshal,Faulk和Taylor,Romano及同事,Horisberger及同事,Rpth及Bendayan,电子显微镜技术,发表了第一张生物组织茅膏菜属植物叶切片的电子显微图,将金属投影用于增加电镜图象反差,开始使用铀固定剂,甲基丙烯酸酯被用作包埋介质,用玻璃刀进行组织切片,将缓冲液与锇酸混合，作为组织固定液,用电子显微镜分析细胞碎片,介绍切片机和切片技术,使用钻石刀进行超薄切片，并创立冷冻超薄切片术,以磷钨酸为负染色剂观察了灌木病毒及烟草花叶病毒的超微结构,高锰酸钾作为固定剂,环氧树脂作为包埋介质,介绍用重金属铅和铀对组织切片进行染色,采用冷冻置换技术制备生物样品,介绍Epon包埋介质,开始研究冷冻断裂技术,用戊二醛作预固定液保存细胞超微结构及活性，进行细胞化学方面研究,对蛋白质吸附于胶体金进行探讨,将蛋白质吸附于胶体金方法用于扫描电子显微镜,胶体金颗粒作为一种示踪物用于电子显微技术研究,胶体金作为抗血清特异标记物用于透射电子显微镜,首次制备蛋白质A-金复合物,建立了制备免疫球蛋白-金颗粒基本方法,提出包埋后免疫金标记技术,10,二、电子显微镜技术的应用,样品制备方法主要包括：超薄切片、负染色、金属投影、冷冻复型、快速冷冻深度蚀刻技术、免疫电子显微镜术、扫描电镜常规样品制备及扫描电镜冷冻断裂技术等。,利用多种样品制备方法和高性能的电子显微镜，在生命科学领域可以观察到细胞中各种细胞器的超微结构，并以此进一步研究细胞结构与功能的关系，深入探索细胞通讯与运输、分裂与分化、增殖与调控等生命活动的规律。在农林科学方面，电镜技术对植物各种疾病病因诊断与防治的研究越来越重要。利用电镜技术观察高分子、表面活性剂、碳纳米管及纳米粒子等结构形态，为化学及材料科学研究提供了有力的技术手段。,11,扫描隧道显微技术,(STM),原子力显微技术,(AFM),激光扫描共焦显微技术,第三节 其他显微技术的发展,12,扫描隧道显微,技术(STM),原子力显微技术(AFM),激光扫描共焦显微技术,利用量子力学中隧道效应产生隧道电流信号，获得反映样品表面原子形态结构和原子排列图象。,具有原子尺度的高分辨率。,可以观察单原子层的实时结构图象，并能在大气、真空甚至液体环境中观察自然状态下的样品表面结构，因而在半导体、金属、无机材料及生物学研究等方面有广阔的应用前景。,13,扫描隧道显微技术,(STM),原子力显微技术(AFM),激光扫描共焦显微技术,通过微悬臂上的针尖在样品表面扫描，使针尖与凹凸不平的样品表面的顶端原子相互摩擦产生原子力。在扫描过程中，微悬臂的上下起伏与等位面的样品形貌相互对应，所以可通过针尖与微悬臂之间的隧道电流变化，得到样品表面形貌信息。,其分辨率可与透射电镜相比拟。,AFM不但能通过探测原子间作用力观察绝缘体，还可在生物环境中直接观察生物样品表面结构。,14,扫描隧道显微技术,(STM),原子力显微技术,(AFM),激光扫描共焦显微技术,利用共焦光路及激光扫描，在观察较厚样品的内部结构或直接观察细胞时，可使所选定的不同层面每一焦点面影象清晰，从而得到细胞不同切面上的一系列图象，经计算机系统快速分析处理，即可重组出样品三维立体图象，展现细胞瞬间变化的形态结构。,15,第一章,超薄切片,技术,透射电镜的生物样品制备的常用方法包括超薄切片、冷冻复型、负染色等。透射电镜靠电子束穿透样品成像，对样品厚度有很高要求。超薄切片方法得到的样品切片厚度为60-100nm，冷冻复型膜厚度约为30nm。复型膜制备和样品负染色的实验过程简单、易于操作，而制备超薄切片的过程则比较繁杂。它分为普通超薄切片技术和冷冻超薄切片技术两大类。,16,第一节 普通超薄切片技术,普通超薄切片技术：不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。,包括：取材、固定、清洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等步骤。每一步都关系到实验成功与否，需步步谨慎认真。,具体步骤：,取材醛类固定液前固定几小时或更长时间0.1MPBS清洗数次1%锇酸后固定2h或过夜0.1MPBS清洗数次梯度乙醇或丙酮脱水（30、50、70、80、90、95、100、100）浸透（1：1、1：2、纯包埋剂）包埋聚合（3712h、60 48h）超薄切片染色（双重染色）,17,对超薄切片的基本要求,为了获得清晰的电镜图像，超薄切片应达到以下几点要求：,（,1,）细胞的超微结构得到良好的保存，没有人工假象；,（,2,）切片厚度一般为,50-70nm左右，较薄的切片分辨率较高，但反差较弱，而较厚的切片反差虽好，但分辨率则,稍差；,（,3,）切片的包埋介质不变形、不分解、不升华，可耐受电子束的照射；,（,4,）切片平展均匀，没有刀痕、皱褶、震颤及染色剂的沉淀污染；,（,5,）切片染色后，具有良好的反差并可获得清晰的图像,18,第二节 制样前的准备工作,一 实验设计的准备,二 实验器具和实验试剂的准备,三 实验材料的准备,19,一、实验设计的准备,应充分考虑电镜技术的复杂性和高消耗性等特点，在没有周全的实验设计之前不要轻易的动手进行实验。,应考虑实验是进行一般的超微结构观察还是进行细胞化学或免疫电镜观察，实验涉及的是哪些组织和器官，对取材的组织和器官的部位都要考虑周密。,根据实验目的采用合适的缓冲液、固定液和固定方法。如在细胞化学工作中，一般 要求选用二甲砷酸盐缓冲液，一些特定的离子细胞化学技术需要特定的缓冲液。,包埋介质有时也需要考虑，如在免疫电镜时需要低温包埋剂，这样抗原性可以保存得更好。,20,二 实验器具和实验试剂的准备,要考虑到各个环节所需要的玻璃器皿、实验器材以及实验试剂等。,三、实验材料的准备,应根据实验目的选择合适的实验材料,在实验时不仅要有正常组，还需设立与实验组相同条件的对照组,21,第三节 取材与固定,一 取 材,取材是超薄切片制样的第一步，也是非常关键的一步。,定义：从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物中取得所需材料的操作过程。,所需溶液主要有缓冲液、戊二醛等。,所需器材有吸管、封口膜、称量瓶、烧杯、双面刀片和医用剪刀、镊子、牙签、解剖镜等.,22,“快”：不管是从麻醉或处死动物身上取材，还是临床手术取材，都应注意保持样品的微细结构，使其最大限度的近于生活状态。一定要目标明确，操作迅速，而且使样品必须在离体半分钟或最多2分钟内浸入固定液，以免时间过长，出现细胞自溶。尤其在暑热情况下，还会出现微生物繁殖导致样品腐败，细胞的精细结构当然会全部破坏。,“准”：取材的部位一定要准确可靠，同时还应注意材料的方向性，例如选取肌组织时，就要考虑肌原纤维在将来切片时是纵断还是横断；其它组织当然也要考虑到定位和定向的问题。,“轻”：所谓“轻”，是指一切操作都应始终贯彻动作轻柔，不仅要避免对组织的挤压及钳拉，还要注意器械的锋利，否则将引起组织结构的人工损伤性变化。,“小”：固定液的穿透能力都比较弱，所以为了保持样品近于生活状态的微细结构，取材大小当然要与固定液的穿透速率相适应，一般,以1mm,3,为宜。样品过大时内部固定不良，过小时观察的目标又会受到局限。,“低”：低温操作，,4,，所用试剂、器具均需预冷。,23,取材方法：,1）动物：将动物麻醉或急性处死，在1-2分钟内解剖出所需要的组织器官，用锋利的解剖刀取小块材料，迅速投入冷的戊二醛固定液中。然后取出放在滴有预冷的戊二醛载玻片上，用新的锋利刀片把材料切成1mm,3,的小方块，再投入盛有冷的固定液的小瓶中，置4 条件下进行低温固定。对于某些特殊材料，如神经组织等，应先进行原位固定或灌流固定，待组织适度硬化后再取材。,2）植物：植物组织的取材较容易，离体后的变化不象动物材料那样迅速，但同样要求尽快投入冷的固定液。一般植物叶片常切成宽1mm、长3-4mm的小条。茎和根可切成小条，也可切成1mm,3,的小方块。表面有毛刺的植物材料，需先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片在50%乙醇溶液中浸泡几秒至几十秒进行脱蜡，取出后用双蒸水清洗数次，再切取。,24,3）体外培养细胞的取材：先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴条件下放置5-10min，弯头滴管吹打或用刀轻轻刮下贴壁的细胞。将含有细胞的固定液转移到离心管中，低速离心10-20分钟，使细胞聚成团块，用擦镜纸包好细胞团块，置于新鲜的固定液中固定。,4）野外取材：冰壶内放一瓶冷的戊二醛固定液，先切取比标准要求稍大的组织块，放入冰壶内保存的固定液中，带回实验室后，按要求切成标准小块或小条进行固定。对于田间植物材料，还可以采集植株保湿带回实验室，再进行取材。,5）骨组织取材：除某些鱼类骨组织可不脱钙，大部分骨组织均需脱钙。用锋利锯条将骨组织锯成约3mm碎骨片，放入固定液中固定过夜或更长时间，缓冲液漂洗后放入脱钙液中脱钙约3周后再切成小块。,25,二 固 定,定义：用化学或物理法迅速杀死细胞，,使所取材料各种细胞或大分子尽可能保持生活状态的结构，尽可能地减少细胞的死后变化，使细胞及其细胞器的精细结构完好无损地得以保存。,固定的目的：防止组织细胞的离体后变化，防止自溶，以保持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致,在固定以后的漂洗、脱水和包埋等样品处理过程中，保护样品使其物质不致溶解和流失,为以后样品的处理（包括染色和经受电子束轰击）作准备，并使组织适当地硬化,26,（一）、固定方法,物理固定法 是指用冷、热或微波等物理方法对生物组织进行固定。在超微结构研究中，冷冻固定和微波固定是较为常用的物理固定方法。,化学固定法 是采用一定的化学试剂对组织或细胞进行固定。这种化学试剂称“固定剂”。它能和细胞内的大分子物质，主要是蛋白质发生化学结合形成交联，使蛋白成分得以凝固稳定，与此同时也能保存糖类和脂肪，使其保持生活时的状态和位置，从而达到把细胞的精细形态结构保存下来的目的。,理想的固定剂，应具备以下条件：能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；可保存一定的酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。,27,在化学固定过程中，组织微细结构保存的质量不仅受到固定液特性的影响，而且还受到固定组织所使用方法的影响。,1.浸泡固定 是最常用的固定方法。组织块切小后，立即浸到大量固定液中。使用青霉素小瓶，每瓶放10块左右组织，固定液2-4ml，4固定2-4小时或更长时间。适用于各种实质性器官，如心、肝、肾、肌肉等。,2.原位固定,是指在保持实验动物血流不断的情况下，进行固定渗透，避免因为缺氧和死后的组织自溶引起微细结构的变化。将动物麻醉后暴露出所需器官的表面，剥开包膜，将冷的固定液滴加到被取器官上，直至组织达到适当的硬度。或将固定液直接注射到所需固定的组织中或者空腔器官的内部，最后将所需的组织取出作常规浸泡固定。适用于较软的组织（如脑、眼球等）。,3,血管灌注固定 利用血液循环的途径将固定液灌注到所要固定的组织中，其特点是固定迅速、均匀。将固定液注入特制的带有针头与皮管的容器中，而后选择到达要取材器官的最短循环途径，将固定液灌注到动物的相应部位。待被灌流的组织适度硬化后，再细致解剖取材，并按浸泡固定法操作。适用于解剖关系比较复杂的组织器官（如垂体、脊髓、甲状旁腺等）。,28,（二）常用固定液的性质,1,醛类,醛类固定剂包括戊二醛、丙烯醛、甲醛、多聚甲醛等。此类固定剂的特点是对样品的穿透力较强，能固定较大的组织块，既能很好地固定蛋白质和糖元等结构，也不易使酶丢失活性，且长时间固定不会使组织变脆，因此能较好的保存组织的超微结构。,（1）. 戊二醛 是电镜样品制备中，最常用的固定剂之一。它作为超薄切片术的固定剂是从,1963,年开始的，至今已得到广泛使用。戊二醛对细胞的精细结构有很强的亲和力，因此是一种良好的固定剂。商品多为,25,的戊二醛水溶液.,29,戊二醛作为生物样品的固定剂，具有以下优点：对组织的渗透力比锇酸大，而且能保存组织内某些酶活性；与蛋白质之间的反应较快，能较好地保存蛋白质的结构；对细胞内的微管及滑面内质网、线粒体等膜性结构保存较好；可以较好地固定和保存组织里的糖原，用大白鼠的肝脏可证明大约,有65,的糖原可被戊二醛保存下来；能够较好的固定植物组织。,戊二醛作为固定剂的主要缺点：没有电子染色作用，单独用它固定的生物样品电子反差不好；脂类及其他一些微细结构，在脱水时易被提取出来。,30,为充分发挥戊二醛固定效果，使用和储存过程中应注意：,pH和温度 中性或碱性均能使戊二醛聚合，失去醛基。PH降至3.5以下时固定效力也将大幅降低。PH为5时在4或更低温度可保持稳定状态几个月。,氧气和浓度 氧气对戊二醛溶液影响较大，应密封保存。浓度大于50时在室温下容易聚合成胶状，低于4的溶液较为稳妥。,杂质污染 可能产生白色沉淀物，应确保玻璃器皿及水的洁净。,31,（2）.丙烯醛 其渗透和反应速度均较快，稍大一些组织可用丙烯醛作固定液。丙烯醛和戊二醛混合液可较好保存微管。丙烯醛易燃，是危险化学品，可由呼吸系统吸入，或通过皮肤吸收，并对皮肤有强烈刺激作用。,（3）.甲醛 多用于光学显微镜技术研究。电镜样品固定多用纯化的多聚甲醛，为白色粉末。 分子较小，渗透组织的能力比强。但不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失。一般与戊二醛混合使用。,（4）.高锰酸钾 一种强氧化剂,主要用于保存细胞的膜性结构，对质膜、内质网及髓鞘等结构保存良好，其他结构则保存很差。只用于研究某些常用固定液难以固定的植物和酵母样品。,32,戊二醛的配制,戊二醛最终浓度,(%),1,1.5,2,2.5,3,4,5,0.2M,磷酸缓冲液,(ml),50,50,50,50,50,50,50,市售,25%,戊二醛,(ml),4,6,8,10,12,16,20,加双蒸水至,(ml),100,100,100,100,100,100,100,33,2,四氧化锇（,O,S,O,4,，锇酸）,四氧化锇是一种淡黄色、具有强烈刺激味的晶体，它的水溶液呈中性，故“锇酸”二字实为一种误称。强氧化剂，,具有强烈的挥发作用，挥发的蒸气具有一定毒性，对皮肤、呼吸道粘膜和角膜等都有固定损伤作用，所以在配制时应注意通风，最好在毒气橱中进行操作。,优点：能与不饱和脂肪酸反应，使脂肪酸得以固定，所以也是唯一能保存脂类的固定剂。,能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定；还可与变性,DNA,以及核蛋白起反应。,当经,O,S,O,4,固定后，金属锇可被结合在细胞结构里，因而在电镜观察时可以获得很好的图像反差，起到电子染色的辅助作用。,对缓冲液要求不高。,缺点：四氧化锇对糖类和天然,DNA,、,RNA,保存作用极差，因此单独用四氧化锇固定时，大部分碳水化合物包括糖原皆可被溶掉。,其分子较大，渗透能力较弱，在,l,1.5,小时内，仅渗透,0.1,0.5mm,，因此在取材时更应注意其大小，一般不应超过,0 .51.0mm,3,。,四氧化锇还是酶的钝化剂，因而不适于作细胞化学的固定。,34,经四氧化锇长时间的固定会造成脂蛋白复合体的溶解，使组织变脆，给切片带来困难，所以四氧化锇固定的时间不宜过长，一般应控制在,1,4,小时内（,4,）。四氧化锇还可与乙醇或醛类等发生氧化还原反应而产生沉淀，故用四氧化锇固定后的样品，必须用缓冲液或双蒸水彻底清洗后，才能进入乙醇溶液中脱水。,配好的四氧化锇储存液（2的水溶液），必须贮存于棕色带磨口塞子的试剂瓶中，用蜡封好，外包黑纸，置4冰箱中保存待用。存放锇酸溶液的容器不干净，或配制时间过久，锇酸就会被氧化还原为黑色的O,S,O,2,、深褐色的O,S,O,4,2H,2,O和O,S,(OH)，总称为“锇黑”，此时预先配制的四氧化锇水溶液逐渐失去原有的固定效力。因此，锇酸溶液最好在使用前配制.,35,3.四氧化钌,与锇酸性质相近，对细胞膜、核膜及胞质膜结构固定效果极佳。与蛋白质、糖原和单糖反应强烈。易分解，在冰箱中也极不稳定，其渗透速度比锇酸还要慢，因此只在样品需要时使用。,综上所述，各种固定剂均有其各自特点，要使组织达到良好的固定效果，常将两种固定剂配合使用，最常用的是戊二醛作前固定，锇酸作后固定。,36,（三）常用的缓冲液,磷酸盐缓冲液 仿效细胞外液成分配成，优点是便宜，无毒性作用；缺点是久放易产生沉淀并易遭到细菌的污染。PH会随温度的变化而稍有变化，在7.5以下缓冲能力很强，控制固定液的PH值比较有效。常用于配置戊二醛固定液和多聚甲醛固定液，并适于灌流固定。,二甲砷酸盐缓冲液 较稳定，能保存，不易被细菌污染，但有一定毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制。尽量不与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入。不像磷酸盐那样会与铅试剂起反应产生沉淀，因此在细胞化学中使用普遍。,37,（1）磷酸盐缓冲液(0.2M),储备液：甲液 0.2M磷酸氢二钠溶液,Na,2,HPO,4,2H,2,O 35.61g,(或Na,2,HPO,4,12H,2,O 71.64g),加蒸馏水溶解成 1000ml,乙液 0.2M磷酸二氢钠溶液,Na H,2,PO,4,H,2,O 27.60g),(或Na H,2,PO,4,2H,2,O 31.21g),加蒸馏水溶解成 1000ml,工作液：混合甲、乙二液，即可得到50ml所需pH值的缓冲液。,38,pH,6.4,6.6,6.8,7,7.2,7.4,甲液,(ml),13.3,18.8,24.5,30.5,36,40.5,乙液,(ml),36.7,31.2,25.5,19.5,14,9.5,不同pH值0.2M磷酸盐缓冲液的配制,按上表混合后，若将溶液稀释到100ml，则可配成0.1M缓冲液。,39,（2）二甲砷酸盐缓冲液(0.2M),储备液 甲液：二甲砷酸钠 4.28mg,蒸馏水加至 100ml,乙液：0.2N盐酸,pH,6.4,6.6,6.8,7,7.2,7.4,甲液,(ml),50,50,50,50,50,50,乙液,(ml),18.3,13.3,9.3,6.3,4.2,2.7,不同pH值二甲砷酸钠缓冲液的配制,按表82混合甲、乙液后，再加蒸馏水成200ml，即可得到不同pH的缓冲液。该液 稳定，可长期在4下保存。缺点是有臭味、有毒性，应在通风柜中配制。,40,（四）影响固定效果的因素,固定液的,pH值、渗透压、固定液的温度和时间，以及缓冲液的选择等因素，都会对固定效果产生直接影响。,1固定液的酸碱度（pH值）,固定液的酸碱度必须与被固定组织的酸碱度基本一致。大多数动物组织酸碱度的平均值是7.4，所以固定液的pH值在7.27.4之间，才能最好地保存动物组织的精细结构。动物组织适用pH7.4左右的固定液，植物细胞以pH6.87.1较好。,2渗透压及离子组成,低渗的固定液易引起组织肿胀，高渗引起收缩。在固定液内加入适量的非电解质或电解质类物质，调节其渗透压，使之成为等渗溶液。通常使用的试剂有钾、钠、钙盐等电解质或蔗糖、葡萄糖等非电解物质。,固定液中加有两价阳离子，可以减少细胞内物质的抽提。,41,3,固定液的浓度,较低浓度需要较长的固定时间，易引起酶的扩散、细胞物质的抽提及组织的肿胀。过高的浓度易毁坏酶的活性及细胞的精细结构。特别是锇酸和高锰酸钾，高浓度会造成蛋白质分子的断裂。戊二醛常用浓度为1-6，锇酸1-2。含水较多的组织，一般需要较高的固定浓度。,4,固定的时间、温度和样品块的大小,在任何情况下不管使用何种固定剂，都应在温度较低的情况下进行。当前采用的标准固定时间是,14,小时，固定温度,为04。由于组织样品是由表及里逐层固定的，存在着固定的梯度，所以样品的大小，直接关系到固定的均匀性.“小”的样品是实现均匀固定的最重要的条件。由于大多数固定剂，其穿透力每小时仅有0.250.5mm，所以在固定取材时，0.51.0 mm,3,应该是较理想的电镜样品尺寸。,42,第四节 漂洗与脱水,1.漂洗,前后固定之间的漂洗，固定后脱水前的漂洗。,对大多数样品，通常用与配制固定液相应的缓冲液漂洗组织2-3次，时间1h左右。植物或骨组织需要较长时间漂洗。脱水前的漂洗时间可短些。,2.脱水,脱水是指将组织内所含的游离水完全清除的过程，属于包埋前必经步骤。,现在常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，因此只有将生物样品中的游离水驱除干净，才能保证包埋剂完全深入生物样品内。,如果含有水分的生物样品进入电镜的高真空中，样品就会急骤收缩并放出水蒸气，这样就会使电镜的高真空遭到损坏，并且造成镜筒的污染。,43,常用的脱水剂为乙醇和丙酮。它们是既能与水相混溶，又能与包埋剂相混溶的有机溶剂。脱水过程宜缓和而有序地进行，原因是在脱水时组织内的水分和细胞内某些物质将被有机溶剂所抽提取代；若脱水急骤，常易引起组织块中渗透压等条件的剧烈变化，样品出现猛烈收缩，会导致样品结构的破坏。因此，要求脱水时必须逐级提高有机溶剂的浓度，而且每一级脱水的时间不应过长，一般以,1015分钟为宜。具体的脱水程序为：,50乙醇或丙酮 1015分钟,70乙醇或丙酮 1015分钟（可置4冰箱内过夜）,80乙醇或丙酮 1015分,90乙醇或丙酮 1015分钟,95乙醇或丙酮 1015分钟,100乙醇或丙酮 2次，每次30分钟。,游离和培养细胞的脱水时间可适当缩短。,44,脱水时的注意事项,1脱水一定要彻底，特别是100乙醇或丙酮应绝对保证无水，为此可事先加入吸水剂（如无水硫酸钠、无水硫酸铜等）进行吸水处理。,2如果当天完不成浸透、包埋操作时，应将样品停留在470脱水剂中保存过夜，因为一般认为70的浓度时所引起的组织块体积变化最小。高浓度的脱水剂、尤其100脱水剂中决不可停留过夜、不仅可引起组织内过多物质被抽提，而且会使组织块发脆造成切片困难。,3脱水操作时，动作要尽量迅速，特别是100脱水剂时，更要注意样品块不要在空气中停留时间过长，否则会造成样品干燥，使样品内产生小气泡致使包埋剂难以浸透。潮湿季节在空气中暴露时间过长也会吸水受潮。,45,第五节 浸透与包埋,1.浸透、包埋的目的要求,经过脱水处理后的样品，即可用包埋剂进行浸透，其目的是用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞内外所有空隙都被包埋剂所填充。在聚合过程中，包埋剂已由单体聚合成高分子物质，使样品内的各种结构得到坚固的支持，可承受超薄切片的切割和耐受电子束的轰击。包埋块的硬度和弹性应该适中，而且其中不能夹有气泡，否则切片易于变形，很难得到理想的切片。由此可见，浸透与包埋的好坏，是超薄切片成败的关键之一。,为了确保浸透与包埋的质量，选择好适当的包埋剂是十分必要的。理想的包埋剂应该具备以下条件：能与脱水剂（乙醇、丙酮等）完全混溶；粘度低、易操作、而且易于渗入样品内部；聚合后质地均匀，体积变化小。能耐受电于束的照射与轰击；在浸透包埋过程中，对细胞成分抽提少，可保存其微细结构；在电镜高倍放大下，不显示包埋剂本身的任何微细结构；包埋后具有良好的切片性能，包括均匀性、可塑性，硬度和弹性等；对人体无毒害作用，且材料来源丰富，操作简便，价格便宜。,46,2.包埋剂的种类,环氧树脂类：这是当前采用最多的包埋剂。它具有三维交联结构，包埋后可保存细胞内的微细结构，对组织损伤小，聚合后体积收缩率低（仅有2左右），耐受电子束轰击性能好。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。包埋块切片时的难易，与树脂、固化剂、增塑剂及催化剂之间的比例有关，而且还取决于聚合的温度、时间等因素。,Epon812,（低黏度环氧树脂，60 20hour以上）,Spurr,（低黏度环氧树脂，70 ，8hour）,国产618,（黏度大，60 ，48hour）,47,单体,Epon812,固化剂（或称硬化剂）,有十二烷基琥珀酸酐（简称DDSA）、六甲酸酐（简称MNA）等，它们参与树脂三维聚合中的交联反应，并被吸收到树脂链中。,增塑剂（不是必需的）,邻苯二甲酸二丁酯（简称DBP）其主要作用是提高包埋块的弹性和韧性，改善其切割性能。,催化剂,2.4.6三（二甲氨基甲基苯酚）简称为DMP30、其主要作用是可以催化聚合反应，但本身并不加入到树脂链中。,配方：,A液 Epon812 10ml B液 Epon812 10ml,DDSA 16ml MNA 8.9ml,48,水溶性包埋剂：是进行细胞化学研究较理想的包埋剂，由于这种包埋剂呈水溶性，所以组织标本可以在水洗后直接投入包埋剂中，避免因使用乙醇、丙酮等脱水剂对样品成分的抽提，同时也避免组织内酶活性的降低、破坏和人为扩散。另外，水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。如乙二醇甲基丙烯酸脂（简称,GMA,）、K4M等。,49,3.浸透与包埋的技术操作,浸透为了使包埋剂均匀地渗入样品内，脱水后的样品应经过逐级浸透的过程。,浸透的具体过程为：脱水后样品迅速移入丙酮、包埋剂等量混合液，,30,分钟或数小时。然后入纯包埋剂数小时或过夜，最后再进行包埋，另外，亦有用环氧丙烷作过渡溶剂，其浸透程序为：脱水后样品丙酮、环氧丙烷等量混合液（,15,分钟）环氧丙烷（,2,次，各,15,分钟）环氧丙烷、包埋剂等量混合液（数小时）纯包埋剂（数小时）包埋。,50,包埋,常规包埋法：一般包埋可在药用胶囊或特制的锥形薄塑料管内进行，近些年来大都采用特制的多孔（锥形）橡胶或硅胶包埋板。,常规包埋的具体做法，在包埋前先将包埋板放入60干燥箱烘干2小时左右，用吸管吸取配好的包埋剂灌满胶囊或包埋板，在其一侧放入用硫酸纸写好的样品标签小纸条（包括课题号、日期、包埋块号别等），再用牙签挑起组织块，放入上述胶囊中央，静放数小时后样品会自然下落到底部。然后将上述包埋板放入恒温箱内加温聚合。加温时先入3745（24小时），而后60恒温箱（24小时）。如直接以60恒温箱加温聚合48小时亦可。,51,VHIC,52,4.包埋时注意事项,浸透、包埋用注射器、吸管、烧杯、胶囊、牙签及其它器皿，均应在用前烘干，不能有任何水分；用后要及时清洗盛过包埋剂的容器，否则树脂固化后难以清洗。清洗时先用废纸擦净剩余的包埋剂，而后再用丙酮洗净。,所用药品均应注意防潮，药品应在干燥器中存放或在冰箱里保存。但从冰箱中取出的药品必须等到恢复至室温时才允许打开盖子，否则水分会进入药品内。,包埋时动作要轻巧，避免产生气泡影响切片。,操作时皮肤切勿接触包埋剂，以防引起皮炎，有的包埋剂有致癌作用，应注意防护。,制好的包埋块应放在带盖的小瓶里，存放在干燥器中，以防止包埋块吸潮变软影响切片。,53,第六节 超薄切片,超薄切片是将固化的包埋块在超薄切片机上切为薄片的过程（厚度约为50nm），它是整个制样程序的中心环节。超薄切片的好坏与切片机的性能、切片刀的质量、包埋块的切割性能以及操作者的技术经验等因素密切相关。当进行超薄切片前，必须做好一切准备工作，如制备支持膜、制备玻璃刀、修整包埋块等，开始切片时必须心境平稳，精力集中，避免任何干扰（如随意离位、各种振动、人员往来、尘粒污染等）。,54,一、选择与清洗载网,超薄切片的操作过程与石蜡切片基本相似，但承载切片的不是载玻片，而是具有透明支持膜的圆形铜网，特殊切片还需用镍网、不锈钢网或银丝网。铜网大都以电解法制成，直径3mm（少数为2mm），网孔的形状有园形、方形、单孔形、狭缝形等，网孔的数目有50400目多种规格。,超薄切片时一般选用200目铜网，网孔大者观察的有效面积亦大，但其对切片的支持稳定性能较差。因此如果观察分辨率要求高的样品时，则选用200目以上的铜网，以增强样品的稳定性能。,55,铜网的洗涤处理因新旧而有不同，方法如下：,1新铜网 可先用丙酮清洗数遍，而后再以无水乙醇清洗几次，待干燥后使用。清洗的目的是去除铜网上的油污，以便支持膜与铜网得以牢固的贴附。,2旧铜网 凡使用过的铜网，均可经下法清洗以后，重复使用：,（1）酸洗法：放入盛有浓硫酸的小烧杯或锥形瓶内轻轻摇动，约经13分钟后即可清洗干净。倒出硫酸，水洗数次后，再用氨水清洗一次，用蒸馏水反复洗涤数次。最后在无水乙醇或丙酮内清洗两遍，取出平铺于滤纸上自然凉干待用。,（2）超声清洗法：先将旧铜网放入小烧杯内，以醋酸异戊酯或二氯乙烷溶去火棉胶膜和Formavar膜，浸泡时间约半小时。然后再放入盛有95乙醇或丙酮的小烧杯内，将超声波探头插入其内超声清洗，时间约510分钟，超声波频率8Hz。,56,二、制备支持膜,取清洗干净的铜网，向它的表面制备一层透明而无结构的支持膜，以便承载有关的切片样品。此膜宜薄厚适中，过薄时样品易有漂移或被电子束打破，过厚时则降低图像的分辨力，一般厚度约为20nm。用做支持膜的原料有Formvar、火棉胶和喷碳等。,57,1Formvar膜 该膜的化学成分为聚乙烯醇缩甲醛（Polyvinyl formal，简称PVF）。首先制备02.-0.5%的氯仿（或二氯乙烯）溶液，然后用洗净的玻璃片伸入到该溶液中停留片刻，平稳取出，自然干燥后玻片上形成一层薄膜，再用刀片沿玻片边缘将膜划破，继将该玻片的一端浸入玻璃平皿的蒸馏水中，待玻片上的薄膜完全漂在水面，把玻片轻轻下压取出。再将铜网排列在膜上，用滤纸与铜网完全贴附后，用镊子夹住滤纸的一角轻轻将其取出放于培养皿中，待自然干燥后使用。,制膜时玻璃片一定要光洁干净，否则Formvar膜不能从玻片上脱落飘起；制膜时室内湿度不能太大（60），否则易在膜上出现微孔；另外，溶剂中不能混有水分与杂质，操作时应注意防止，否则膜上会有许多斑点。Formvar膜具有良好的透明度与机械强度，不易被电子束击破，因此为当前电镜制样最普遍采用的支持膜。,58,2火棉胶膜 常用12火棉胶醋酸异戊酯溶液。取市售的6火棉胶溶液，加入等量的醋酸异戊酯，即成3溶液。制膜时先取直径912cm的培养皿，盛满双重蒸馏水，在水面上轻轻滴12滴上述溶液，醋酸异戊酯很快挥发后，即可在水面上形成一层均匀的火棉胶薄膜。此时将洗净的铜网排列在膜上，然后在铜网上放上一张滤纸，待滤纸浸湿后轻轻提起，将贴有铜网的滤纸取出水面，放于培养皿中，在5060温箱中烘干待用。,3碳膜的机械强度和化学稳定性能均优于其它支持膜，因此多用来观察高分辨样品。其制作方法如下：取此直径为3或5mm的两根碳棒，一根作固定极，将顶端磨平，另一极作推进极，将一端磨成细尖。取上述磨制好的碳棒装在真空喷镀仪的电极柱上，使推进极的尖端与固定极的平端相接触，并调整碳极喷发点至样品的距离1214cm。将已带有火棉胶膜或Formvar膜的铜网数个，放在喷发点的下方，盖好真空罩，抽真空至110,5,托，连接电源使碳极通电，加大电流至2030A，使两碳棒接触点产生弧光放电，碳棒喷发出极细的颗粒，约喷发5秒钟左右即可获得足够厚度的碳加强膜，其厚度要求为10nm左右。,为了判断碳膜的喷发厚度，可在铜网旁边放一小块白瓷板作为指标板，瓷板上滴一滴真空油，当碳喷发时，若油滴周围呈现出淡褐色，而油滴表面仍为透明白色，则此时碳膜的厚度正好符合要求。,59,三、包埋块的修整,制作好的包埋块，应将其尖端修成适当的形状和大小，除去组织周围多余的包埋介质。使包埋于其中的组织露于包埋块的尖端，才能用于切片。包埋块的顶端表面形状，一般修成梯形、长方形或正方形、面积约为1平方mm。包埋块顶端的四周则修成锥体状。,修整时先将包埋块夹在专用的夹持器中，先用单面刀片倾斜45，角向外粗修出四个斜面，使包埋块顶端呈锥体状；然后在立体显微镜下进行细修，此时用双面刀片将包埋块顶端修平，使其露出组织（注意不要修及组织）。修好的包埋块，其面最好为梯形，因为梯形既有利于切片脱离刀锋，避免切片粘附，同时也可连续成带，有利于判断前后顺序。,60,修块定位,粗修,（可用刀片完成）,细修,（玻璃刀或钻石刀完成）,最终形成一个小、扁平、四边的金字塔保证上下两条边互相平行,61,62,63,四、切片刀,切片刀的制备与选择是超薄切片成败的关键之一。超薄切片时，大都选用玻璃刀，在切比较坚硬的样品或想获得较大切片时，可选用钻石刀。玻璃刀制作简便，价格低廉，但刀刃脆不耐用，而且不能切割硬质材料。钻石刀质地坚硬，经久耐用，但价格昂贵。,64,1玻璃刀 制作玻璃刀所用的玻璃，必须为不含杂质的硬质玻璃，其厚度要求为56mm。,（1）手工制刀法,（2）机械制刀法 机械制刀大都选用瑞典LKB7800型制刀机或国产型号，其主要部件包括：玻璃划割器、夹持器（压紧玻璃用）、断裂旋钮（产生向上的顶力、与夹持器的压力相反，使玻璃断开）、导板（选用刀尖角的角度）、调节盘（调节划割线偏离对角线的程度）。,Step 1 : 玻璃刀的制作过程 (a),65,Potential Knife Edge,锋利的刀口,Tip: For cryo-ultramicrotomy knives, this shelf should be 0.2mm or less in width (for maximum sharpness of the knives). For room temperature plastic sectioning, the shelf may be 0.5 1.0mm wide (for a more robust knife edge).,Step 2：玻璃刀的制作过程(b),Potential Knife Edge,Potential Knife Edge,66,玻璃刀的检查,Best Area,67,玻璃刀水槽制作示意图,VHIC,68,2钻石刀 钻石刀又称金刚刀；它具有以下优点：（1）其刀口在室温下不存在氧化和分子重新排列问题，可反复使用，节约了制取玻璃刀的大量时间；（2）可切割各种软硬度的样品，尤其适用于特别硬的材料；（3）刀口范围大，可切割出较大的切片；（4）刀锋不易损伤，故可用于连续切片；（5）刀锋锐利，一般无刻痕，可得到1020nm平整满意的切片。,钻石刀是用沿晶体面裂开的金刚石制成，其刀刃角度为4060，刀口的宽度为15mm。将磨好的钻石装在长约10mm、宽约5mm、厚2mm的黄铜条上，再装在用压铸法制得的铝架上，铝架的外形与玻璃刀相同，铝架的上方为一水槽。3,69,由于钻石刀价格昂贵，且易碰撞受损，所以使用时务需注意以下事项：（1）缺少熟练使用玻璃刀经验者，不要使用钻石刀；（2）可用玻璃刀切片的样品，尽量不用或少用钻石刀；（3）钻石刀的刀刃切勿手摸，安装时要用特制的刀架，其刀刃不能碰及硬物；（4）包埋块游离端的表面积，不得大于1mm,2,；（5）切硬度较大的样品时，其切片厚度应小于100nm；（6）切速选择一般为1mm秒，最大不要高于2mm秒（切速是指刀锋通过包埋游离端的速率）；（7）用完后要立即清洗，滤纸吸干后妥善保存。清洗时可用软木棒或牙签削成薄片或用特制的软纸浸上乙醇，在立体显微镜下边观察边沿着与刀刃平行的方向小心、轻轻地擦洗刀刃的全长。,70,五、切片,一般透射电镜观察样品时，电子束无法穿过0.1m以上的切片，所以需将样品切成1050nm的薄片才能观察，与光镜观察的37m切片对比而言，常将透射电镜的切片称为超薄切片。为制取此类切片而设计的切片机称超薄切片机（ultrotome）。,1,超薄切片机,目前超薄切片机的生产国和机器型号很多，按其设计的推进原理，可将超薄切片机分为机械推进式和热膨胀推进式两类。不同型号的超薄切片机虽然操作方式各不相同，但其切片原理都基本相同。所有切片机在切片过程中，都是使一个装有样品块的活动臂上下运动并通过刀刃，在活动臂每次下降切片之前均对着刀刃作微小的推进，这样便使一极薄的切片从样品块表面被切割下来。刀上有一装有液体的小水槽、脱落下来的切片悬浮在小水槽的液面上。,71,2超薄切片的基本步骤,（1）安装包埋块 将修好的包埋块夹在样品夹中，顶端露出约2mm；锁住样品臂样品夹固定在“样品定向头”中。,（2）安放玻璃刀 将带有水槽的玻璃刀放在刀夹中夹紧，并与刀夹旁的标尺等高。,（3）调好组织块与玻璃刀的位置 用粗、中调进刀，使刀尽量拉近组织块的切面；调节定向头的高度，使组织块的切面下缘与刀口等高。水平移动刀台，使刀刃平直无缺口处对准组织块切面。松开样品臂固定锁，一手转动样品臂升降钮使样品臂上下运动，一手调节中调或微调钮，在立体显微镜观察下调至刀刃刚好切到组织为止。,72,（4）调节水槽液面及灯光位置 用注射器向水槽中加入蒸馏水，直至液面略低于刀刃。调好灯光位置，使刀刃下方的液面上出现较大亮斑，以便看清切片的干涉颜色。,（5）选定切片速度 切片速度是指切片刀的刀锋通过样品块切割面时每秒行走的距离而言。玻璃刀超薄切片的切片速度通常为25mm秒，包埋块偏软时应选择较高的切片速度，例如每秒1020mm，如包埋块较硬时则应选较慢的切速，如0.110mm秒。,（6）选择合适的切片厚度，开始切片。,73,74,3,切片厚度的判断,切片表面的反射光和切片下面的折射光之间，会产生一种光学干涉的呈色现象，切片厚度呈现的干涉颜色亦因之有别，根据这一原理就可以判断切片的大致厚度。一般情况下灰色及暗灰色的切片较薄，其分辨力较高，但反差较弱且易于破裂；金黄色或紫色的切片较厚，其反差较好，但分辨力较低；一般认为，银白色的切片较符合理想，反差和分辨力均适中。,干涉 厚度,颜色,(nm),灰色 60,银色 60-90 金色 90-150,紫色 150-190 蓝色 190-240 绿色 240-280 黄色 280-320,75,4,捞片,飘浮在水槽液面上的切片，需捞于铜网上才适于在电镜下观察。因为切片很薄，极易重叠和起皱褶，故在捞片之前先用镊子夹一块沾有二甲苯或氯仿的滤纸靠近刀槽液面，借溶剂挥发的蒸气将切片稍加软化，并使切片上的皱褶展平，这一过程叫展片。长时间的展片会损伤样品的微细结构，故展片时间不能过长，以,3,4,秒钟为宜；而且展片时，要防止溶剂距切片过近或接触切片。展片后用一根睫毛针（将一根睫毛或一小段头发，绑在小木棍上制成），在立体显微镜下将平展于水面上的切片带轻轻拨成几段，再以专用镊子夹住铜网边缘，使带有支持膜的一面对准切片轻轻沾取，即可将切片沾附于铜网之上。而后，用滤纸角吸掉铜网上多余的水分，放入培养皿的滤纸上等待染色。,如进行细胞化学的研究时，因某些试剂可与铜网产生化学反应，可改用金网、镍网或不锈钢网。,76,77,78,第七节,染,色,一、电镜图像反差的形成,超薄切片需经染色后，才能在电镜下显示出清晰的结构图像。超薄切片的染色是一种“电子染色”，其目的是增强样品中各种结构图像之间的反差。,电子束照射到样品以后，与组成样品物质中的原子及核外电子产生弹性散射与非弹性散射作用，并产生带有样品信息的其他各种讯号。弹性散射特别是非弹性散射，为电镜成像的最重要因素。样品中质量密度高的区域，可散射较多的电子，其透过的电子量较少，在荧光屏上呈现出电子致密的暗区；相反，在质量密度低的区域，散射的电子较少透过的电子较多，故可呈现为电子透明的亮区。这样，即可形成一个具有明暗反差对比的容易辨认的电镜图像。因此，电镜图像的反差是由样品不同部位电子散射力的差异所决定的，也反映了样品不同部位电子密度的差异。,79,二、切片的电子染色,生物组织系由碳、氢、氧、氮等轻元素所组成，由于这些元素的原子序数较低、散射电子的能力较弱，所以未经染色的超薄切片反差很低，在电镜下几乎看不清生物组织的微细结构。重金属化合物有较强的电子散射能力，超薄切片多采用铀、铅、锇、钨等重金属盐类作为染色剂。经浸染重金属化合物的超薄切片，不同结构成分会吸附不同数量的重金属原子，吸附重金属较多的部分有较强的电子散射力，在电镜图像中可呈现电子致密的黑色；相反，结合重金属较少的部位电子散射力较弱，在电镜图像中呈现的颜色较浅；没有吸附重金属原子的部分，则透过的电子最多，故在荧光屏电镜图像上呈现为无色透明的区域。所以重金属盐染色是一种提高样品结构反差、增强图像清晰度的“电子染色”。,80,三、常用的电子染色剂,1醋酸铀 醋酸铀（醋酸双氧铀）是广泛采用的染色剂。它可与细胞内大多数分子结合，以提高核酸、蛋白质和结缔组织纤维成分的反差为主，对膜的染色效果较差；它具有一定放射性及化学毒性，对光和高温具有不稳定性，所以其配液需贮藏于棕色瓶和4的冰箱内。常用浓度为2 饱和液，切片染色可在室温或37环境里进行，时间为1530分钟或更长。,2铅盐类染色剂 铅盐最常使用，有全能染色剂之称。它可以与细胞内的核蛋白及糖元结合，亦可大大提高细胞膜系统与脂类物质的反差，几乎可以浸染细胞内的所有成分。铅盐的缺点是具有一定的毒性，极易与空气中的CO,2,结合产生碳酸铅沉淀而污染切片，后者在电镜下呈现黑色致密的圆形及不定形颗粒。配制铅盐溶夜所使用的双蒸水，最好先加热煮沸，以除去水里的CO,2,；配制好的溶液，可在其表面滴加一层液体石腊或密封于注射器中保存，使之与空气隔离；染色前最好先将染色剂离心，以除去沉淀部分：染色时要选用小的平皿，或采取其他密封措施，以减少与空气接触的机会；染色后用水洗去染液，立即烘干待用。,铅盐类染色剂包括柠檬酸铅、醋酸铅、氢氧化铅、酒石酸铅等，以柠檬酸铅最为常用。,81,四、染色的方法,1块染法 多在脱水之前进行。样品块经锇酸固定后，可用醋酸铀50乙醇饱和液整块染色，时间为30分钟，这样，不仅可以提高切片的反差，而且还可以增强组织成分的稳定性，降低脱水所造成的磷脂丢失。,2切片染色法 最常用醋酸铀柠檬酸铅双染色法，是当前增强切片反差的常规染色技术。醋酸铀主要用以显示细胞核与结缔组织，柠檬酸铅主要可以提高细胞质内各种成分的反差。其操作步骤如下：,82,（1）醋酸铀染色 将铜载网以适当的间隔放置于蜡盘上，用毛细滴管吸取醋酸铀染液，滴加在每一个铜网上，再翻转铜网使其切片面向下，并漂浮于滴液上。为防止氧化和污染，宜盖好蜡盘，染色30分钟。,（2）清洗 用切片镊子将铜网从醋酸铀染色液中取出，经蒸馏水洗涤三次以上，用滤纸吸去水分，自然晾干。,（3）柠檬酸铅滴注染色 将上述铜网置于另一蜡盘里（蜡盘中放固体氢氧化钠，吸附盘中的CO,2,，以防