【生物课件】植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物,DNA,、,RNA,及蛋白的提取与分析,植物,DNA,提取,DNA,提取原则,保证,DNA,结构的完整性,排除有机溶剂和金属离子的污染,排除其它核酸分子的污染,蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度,纯化后不应存在对酶抑制性的物质,植物,DNA,提取的方法,CTAB,法,SDS,法,煮提法,-,植物,DNA,提取的经典方法,DNA,提取的基本步骤,材料的准备（新鲜或冷冻保存）,细胞的裂解（液氮研磨，释放内容物）,DNA,的分离与纯化（酚氯仿抽提）,DNA,的沉淀与洗涤（,2V,无水乙醇或,2/3V,异丙醇）,DNA,的干燥与溶解（,ddH,2,O,或,TE,）,CTAB,法流程,离心洗涤,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽,提,细胞裂解,干燥溶解,沉,淀,CTAB,提取液主要成分,CTAB,： 十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。,Tris-HCl,(,pH8.0):,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。,EDTA,:,螯合,Mg2+,或,Mn2+,离子，抑制,DNase,活性。,NaCl,:,提供一个高盐环境，使,DNP,充分溶解，存在于液相中。,1.,取约,0.1g,的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适 量的粉末材料转移至,1.5mlEP,管中。,2.,加入,600,l,预热（,95,）的,1.5,CTAB,缓冲液，然后,65,温浴,2060min,。,3.,取出,EP,管，冷却后加入,600,l,氯仿,:,异戊醇（,24:1,）混合均匀，然后,10000rpm,离心,10min,，取出后吸取上清液到另一新的,EP,管中。,4.,加入,2/3V,异丙醇或,2V,无水乙醇混合均匀，冰浴至,DNA,丝状物出现。,5.,稍微离心沉淀,DNA,，倒掉上清液。,6.,加入,600,l75%,乙醇洗涤，放置,30min,。,7.,倒掉上清液，室温下吹干,DNA,。,8.,加入,100,lTE,溶解,DNA,。,9.,取,5-10ul,电泳检测提取效果,10.-20,下 贮存备用,CTAB,法步骤,注意事项,1.,所有用品均需要高温高压，以灭活残余的,DNA,酶。,2.,所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。,3.,在提取过程，应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚,/,氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的,DNA,。,DNA,的质量检测,电泳,带型单一无拖尾现象,点样孔无残留杂质,OD,值测定,DNA,纯品的,OD260/OD280,为,1.8,，若比值较高说明含有,RNA,，比值较低说明有残余蛋白质存在。,OD230/OD260,的比值应在,0.4-0.5,之间，若比值较高说明有残余的盐存在。,植物,RNA,提取,分离,RNA,的目的,RT-PCR,Northern blot,构建,cDNA,文库,Gene Chips,体外翻译,RNA,提取的关键,-,防止,RNase,降解,RNA,实验失败的主要原因是,RNA,酶的污染。,RNA,酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。研究人员的手、唾液、灰尘、器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、各种试剂及各种组织和细胞中。,RNA,酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。,RNA,制剂中只要存在少量的,RNA,酶就会引起,RNA,在制备与分析过程中的降解，而所制备的,RNA,的纯度和完整性又可直接影响,RNA,分析的结果，所以,RNA,的制备与分析操作难度极大。,在实验中，一方面要严格控制外源性,RNA,酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的,RNA,酶。,1.,耐高温的器具（如玻璃制品、研钵、剪刀、镊子 等）于,180 ,下干烤,8h,2.,塑料耗材（,Tip,、,EP,管等）用,0.1%,的,DEPC,水浸泡过夜，然后高压，再烤干备用,3.,实验用的氯仿、乙醇为,RNA,专用，水为,DEPC,处理水,4.,使用有效的,RNase,抑制剂：如异硫氢酸胍、,RNasin,5.,配制的溶液应尽可能的用,0.1% DEPC,，在,37,处理,12hr,以上。然后用高压灭菌除去残留的,DEPC,。不能高压灭菌的试剂，应当用,DEPC,处理过的无菌双蒸水配制,6.,实验过程需带一次性塑料手套且经常更换,7.,设置,RNA,操作专用实验室，所有器械等应为专用。,注意：,DEPC,有致癌之嫌 ，必须小心操作，防止接触与吸入 ！,防止,RNase,污染的措施,常用的,RNase,抑制剂,DEPC(,焦磷酸二乙酯,):,是一种强烈但不彻底的,RNA,酶抑制剂。它通过和,RNA,酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。,异硫氢酸胍目前被认为是最有效的,RNA,酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使,RNA,酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对,RNA,酶有强烈的变性作用。,RNasin(RNA,酶的蛋白质抑制剂）一种非竞争性抑制剂，可以和多种,RNA,酶结合，使其失活,氧钒核糖核苷复合物,:,由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和,RNA,酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制,RNA,酶的活性。,其它：,SDS,、尿素、硅藻土等对,RNA,酶也有一定抑制作用。,1.,胍盐法：用,异硫氰酸胍,或盐酸胍和,-,巯基乙醇变性蛋白，并抑制,RNase,的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀。,2.,氯化锂沉淀法：因为锂在在一定,pH,下能使,RNA,相对特异地沉淀，但容易使小分子,RNA,损失，而且残留的锂离子对,mRNA,有抑制作用。,3.,苯酚法：用,SDS,变性蛋白并抑制,RNase,活性，经多次酚,/,氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用,NaAC,和乙醇沉淀,RNA,。,分离总,RNA,的方法,TRIReagent,提取总,RNA,TRI Reagent,含有异硫氰酸胍和苯酚，能够有效溶解,RNA,，,DNA,和蛋白质。在加入氯仿并离心后，上层水相中含有,RNA,。水相的,RNA,经过沉淀和洗涤后几乎没有,DNA,或者蛋白质污染,TRI,Reagent,提取步骤,1.,研钵研杵预冷后,加入少量样品用液,N,迅速研磨成冰粉状,2.,将样品（样品量不超过,100mg),移入,1.5mlEP,管中,迅速加入,1mlTRI Reagent,混匀,室温静置,5min,3.,加,0.2ml,氯仿,剧烈振荡,15S,室温静置,10min,4. 4,12000g,15min;,取上清于另一,EP,管中，加,0.5ml,异丙醇混匀，室温静置,10min,5. 4,12000g,8min,；去上清，加,1ml75%,乙醇，涡漩沉 淀,6.,去,75%,乙醇，室温晾干,510min,7.,加,3050ulDEPC-H2O,溶解,8.,电泳检测提取的,RNA,质量,注意事项,材料新鲜，冷冻材料切忌反复冻融，如要多次提取，分成多份保存（液氮长期保存，,70,短期保存）,先用液氮研磨植物材料，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮,研磨后立即加裂解液裂解，样品与裂解液充分接触前避免融化,样品量适当，保证充分裂解，样品量过多会使内源性,RNase,的抑制不完全，导致,RNA,降解,在使用氯仿抽提纯化时，要充分混匀，动作快速,RNA,晾干时不要过干，会导致难溶,实验过程必须严格防止,RNsae,的污染,电泳试验,吸光度测定,保温试验,质量分析,电泳的目的是在于检测,28S,和,18S,条带的完整性和他们的比值如果,28S,和,18S,条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且,28S,的亮度在,18S,条带的两倍以上，认为,RNA,的质量好的,电泳试验,吸光度测定,保温试验,质量分析,280,、,320,、,230,、,260nm,下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般只看,A,260,/A,280,（,R,）。,R =1.82.0,，说明提取的,RNA,可用，,R2.2,时，说明,RNA,已经水解成单核酸了。 如果,RNA,的量够，可在,260nm,（,A260,）用分光光度法测定,RNA,的得率，,1,个单位等于,40ug/mlssRNA,。纯,RNA,的,A260/A280,的比值为,2.0,。,电泳试验,吸光度测定,保温试验,质量分析,检测极残留的少量,RNase,污染,按照样品浓度，从,RNA,溶液中吸取两份,1000,ng,的,RNA,加入至,0.5 ml,的离心管中,并且用,pH7.0,的,Tris,缓冲液补充到,10,ul,的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入,70,的恒温水浴中,保温,1 h,。另一份放置在,-20,冰箱中保存,1 h,。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别，则说明,RNA,溶液中没有残留的,RNA,酶污染，,RNA,的质量很好。相反的，如果,70,保温的样本有明显的降解，则说明,RNA,溶液中有,RNA,酶污染,植物蛋白的提取,蛋白的制备,1.,选择材料和预处理,2.,细胞的破碎及细胞器的分离,3.,提取和纯化,4.,浓细、干燥和保存,蛋白提取方法,（一）水溶液提取法,稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的,1-5,倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取,蛋白质一般采用低温（,5,度以下）操作。,为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。,1,、,pH,值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的,pH,值应选择在偏离等电点两侧的,pH,范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。,2,、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量,NaCl,等中性盐，一般以,0.15,摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用,0.02-0.05M,磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。,（二）有机溶剂提取法,一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为,10%,，,40,度为,6.6%,）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的,pH,及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。,蛋白提取方法,我们实验室的方法,(1),取,100mg,植物叶片,加提取缓冲液,PBS1ml,和少量石英沙研成匀浆，转移到,1.5mlEP,管中。,(2)10,000g/min 4,度离心,15min,取上清液放置,4,度冰箱备用。,总蛋白的测定,Bradford,法： 配制考马斯亮兰,G-250,蛋白显色液，其组成为：,0.01,(w,v),考马斯亮兰,G-250,，,4,7,(w,v),乙醇，,8,5,(w,v),磷酸。以标准蛋白做蛋白浓度与,OD,值间标准曲线，取待分析的蛋白溶液于考马斯亮兰,G-250,显色液中，测其,OD,值，根据标准曲线即知待分析蛋白液中蛋白的浓度,。,讨论？,1,、样品不纯,2,、样品降解,3,、样品得率低,4,、样品电泳时检测不到条带,一、,DNA,样品不纯,1. DNA,中含有蛋白、糖类、酚类杂质,2. DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,3. DNA,中残留有金属离子,1.,重新抽提,DNA,，,去除蛋白、糖类、酚类等杂质,2.,重新沉淀,DNA,，,让酒精充分挥发后再溶解,3.,增加,70,乙醇洗涤的次数（,2-3,次）,原因,对,策,二、,DNA,降解,1.,材料不新鲜或反复冻,融,2.,未很好抑制内源核,酶的活性,3.,提取过程操作过于,烈，,DNA,被机械打断,4.,外源核酸酶污染,5. DNA,反复冻融,1.,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免,反复冻融,2.,液氮研磨组织后，应在解冻前加入裂,解缓冲液；提取内源核酸酶含量丰富,材料的,DNA,时，可增加裂解液中螯合,剂含量,3.,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,4.,所有试剂用无菌水配制，耗材经高,灭菌,5.,将,DNA,分装保存于缓冲液中，避免,复冻融,对,策,原因,1.,实验材料不佳或量少,2.,破壁或裂解不充分,3.,沉淀不完全,4.,洗涤时,DNA,丢失,1.,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,2.,液氮研磨充分，适当延长裂解时间,3. -20,下低温沉淀；延长沉淀时间；加辅助物（,NaAC,或,NaCl,),，促进沉淀,4.,洗涤时要小心,对,策,原因,三、,DNA,提取量少,四、,RNA,易降解,1.,样品不新鲜或样品保存不当，,RNA,降解,2.,污染了,RNase,1.,尽量取新鲜样品，取,后立即放入液氮中保存,2.,认真处理相应的器具,和试剂，严格地操作,原因,对,策,五、,RNA,样品不纯,1.,抽提过程不彻底，存在蛋白等杂质的污染,2. DNA,的污染,3.,离子浓度过高,1.,保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次数,2.,抽提后取上清时勿吸取中间相，加入不含,RNase,的,DNase,处理,3.,增加,70,乙醇洗涤的次数,原因,对,策,六、,RNA,得率低,1.,样品过量或样品裂解和研磨不彻底,2. RNA,未有效沉淀,1.,减少样品用量，充分研磨样品，增加裂解液的用量和裂解时间,2.,延长沉淀时间和提高离心转速和离心时间,原因,对,策,七、,RNA,电泳检测不到条带,1. RNA,没溶解好,2.,高电压电泳，产生较高的热量，使胶的温度过高,1. RNA,晾干时不要过干，会导致难溶,2.,把胶放到冷水中冷却后再观察,原因,对策,谢谢！,我劝一个草率结婚的朋友离婚。她平静的告诉我，如果说当初鲁莽结婚是个错误。那么，现在草率离婚是一错再错。这位朋友后来还是离婚了，大家一致认为她的行为很理性。同样的故事正在互联网搜索巨头谷歌身上发生，但是谷歌选择了草率“离婚”。饮鸩止渴由于急于抑制苹果,iphone,手机翻天覆地的产业冲击，谷歌采取急功近利的粗糙型开放策略。饮鸩止渴的策略一时取得了成果。市场研究公司尼尔森最近公布的数据显示，在通过,Verizon Wireless,、,AT&T,和,Sprint Nextel,三大运营商经销后，谷歌,Android,手机在美国市场上的销售量已经超过,iPhone,。另一家市场研究公司,iSuppli,甚至认为，全球范围内使用,Android,操作系统的手机数量将在,2012,年超过苹果,iPhone,。 表面繁华的背后，是,Android,生态系统的一团糟，谷歌正在为自己的粗放型开放策略买单。用户对谷歌手机的态度从开始的好奇、后来的犹豫，变成强烈的批评。“大多,Android,手机程序都是垃圾，乱七八糟的”，一位手机发烧友迅速投奔了,iphone,的阵营：“同样的植物人大战僵尸游戏，在谷歌手机和,iphone,手机上的体验简直没法比”混乱，还是混乱。一切一切的乱象，折射出谷歌已经失去对,Android,生态系统的控制。这一切的根源，我的判断是开放策略初期过于宽松，导致失去控制权。混乱的生态系统表现在用户手机上，就是应用程序的混乱和粗燥。一错再错为此，谷歌开始采取对策。最近，有国内厂商称新的,Android3.0,开始关闭应用程序的,API(,应用程序编程接口,),，统一,Android,界面。这意味着，谷歌将放弃其初始开放策略，开始封闭管理。粗看之下，谷歌认识到自己的错误。既然是过度开放导致的错误，那么收紧开放尺度是很自然的逻辑，无懈可击。但我认为，谷歌仓促收紧开放策略仍然是个错误。打个比喻。如果过度开放的政策是草率结婚，那么草率的封闭就是草率离婚。这么判断的原因很简单，谷歌把,Android,开放出去的那一天，,Android,已经不属于谷歌。谷歌没有认识到这一点，还以为,Android,只是自己的。合作伙伴对谷歌封闭政策的反应加强了我的判断结论。经济观察报报道，国内第一家生产基于,Android,平台手机的设计公司创杨通信，近日已经被迫出售。创杨通信负责人给出的出售理由是，“因为不愿意甘当炮灰而选择放弃。”按照目前,Android3.0,将统一界面的想法，未来的手机市场将出现毫无差异化的产品。这对于企业来说，几乎意味着不可避免的价格战。利润空间的微薄，导致合作伙伴生存环境恶劣。于是大量退出几乎是一种必然。除了为合作伙伴找到新的利益空间，谷歌还将面临开放阵营精神层面的声讨，这对谷歌的挑战会更大。如果说谷歌为了自己竞争的私利利用了开放，赢得了名声。那么，谷歌不能一脚把开放踢开，他现在还需要为这种名声买单。如果只顾自己收网，谷歌会被面临铺天盖地的道德谴责。谷歌，希望你准备好了，三思而行。,木桶效应就是指一个水桶无论有多高，它盛水的高度取决于其中最低的那块木板。这在选购手机的时候也同样适用。尤其是很多用户在购买手机的时候， 都会专注于某一个参数，比如要求处理器主频要高达1GHz，但一部手机的整机表现是由多个因素组成，所以在购买手机的时候一定要从整体的角度上来看一部手 机的性,除了处理器主频以外，其实还有很多影响整机表现的元素，比如运行内存,(RAM),、机身内存,(ROM),、操作系统、厂商对系统的优化都会有所影 响。不过在很多用户眼中，这几项却远没有处理器主频重要。而如果忽略这几项的话，可能买到一个主频很高，但整机性能却仍然不令人满意的机型。用户在选机过程中切勿只关注一个硬件参数，这样很可能并不能买到一款理想的机型，就算买的手机主频再高，运行内存低的话仍然无法同时运行数个程 序、机身内存小的话则无法把太多的软件安装到机器上，这对整机耗电和运行速度方面都有所影响、而厂商优化更是决定着一部手机的稳定性和部分运行速度。综上 所述，大家在选购手机的时候一定要综合考虑一款手机的硬件规格。除此之外，也不要把硬件看的太过重要，就比如苹果,iPhone,3GS,在硬件配置上并不出众，但却在操控手感以及软件资源上目前难有机型企及。更高分辨率能获得更为逼真细腻的显示效果，所以对于屏幕的分辨率绝大多数人都会偏向于分辨率更高的机型。但对于笔者 所说的高分辨率未必是好事会有所怀疑。其实这里说的高分辨率“不好”更多是指采用非主流的高分辨率机型。在此前，就有几款“悲情”机型在分辨率上吃了不小 的亏。大名鼎鼎的,HTC Diamond,就是一款颇具代表意义的机型，,Diamond,上市的手机市场还处于,QVGA,时代、只有少数旗舰机皇采用,WVGA,这样级别的屏幕，由于,HTC Diamond,却采用了,VGA,这一过渡型的分辨率，而也正是因为这一点，,Diamond,很多软件都未有支持或无法完美运行，可谓是一个不小的遗憾。除此之 外，曾经非常经典的,附赠人生心语,人生太短，聪明太晚,人生太短，聪明太晚,(1),我们都老得太快却聪明得太迟,把钱省下来，等待退休后再去享受,结果退休后，因为年纪大，身体差，行动不方便，哪里也去不成。钱存下来等养老，结果孩子长大了，要出国留学，要创业做生意，要花钱娶老婆，自己的退休金都被拗走了。,人生太短，聪明太晚,(2),当自己有足够的能力善待自己时，就立刻去做，老年人有时候是无法做中年人或是青少年人可以做的事，年纪和健康就是一大因素。小孩子从小就告诉他，养你到高中，大学以后就要自立更生，要留学，创业，娶老婆，自己想办法，自己要留多一点钱，不要为了小孩子而活我们都老得太快却聪明得太迟，我的学长去年丧妻。这突如其来的事故，实在叫人难以接受，但是死亡的到来不总是如此。学长说他太太最希望他能送鲜花给他，但是他觉得太浪费，总推说等到下次再买，结果却是在她死后，用鲜花布置她的灵堂。这不是太蠢愚了吗？！,等到,.,、等到,.,，似乎我们所有的生命，都用在等待。,人生太短，聪明太晚,(3),等到我大学毕业以后，我就会如何如何我们对自己说,等到我买房子以后！,等我最小的孩子结婚之后！,等我把这笔生意谈成之后！,等到我死了以后,人人都很愿意牺牲当下，去换取未知的等待；牺牲今生今世的辛苦钱，去购买后世的安逸,在台湾只要往有山的道路上走一走，就随处都可看到农舍变精舍，山坡地变灵塔，无非也是为了等到死后，能图个保障，不必再受苦。许多人认为必须等到某时或某事完成之后再采取行动。明天我就开始运动，明天我就会对他好一点，下星期我们就找时间出去走走；退休后，我们就要好好享受一下。,人生太短，聪明太晚,(4),然而，生活总是一直变动，环境总是不可预知，现实生活中，各种突发状况总是层出不穷。身为一个医生，我所见过的死人，比一般人要来得多。这些人早上醒来时，原本预期过的是另一个平凡无奇的日子，没想到一个意料之外的事；交通意外、脑溢血、心脏病发作等等。剎那间生命的巨轮倾覆离轨，突然闯进一片黑暗之中。那么我们要如何面对生命呢？我们毋需等到生活完美无瑕，也毋需等到一切都平稳，想做什么，现在就可以开始做起。,一个人永远也无法预料未来，所以不要延缓想过的生活，不要吝于表达心中的话，因为生命只在一瞬间。,人生太短，聪明太晚,(5),记住！,给活人送一朵鲜花，强过给死人送贵重的花圈，每个人的生命都有尽头，许多人经常在生命即将结束时，才发现自己还有很多事没有做，有许多话来不及说，这实在是人生最大的遗憾。,别让自己徒留为时已晚的空余恨。逝者不可追，来者犹未卜，最珍贵、最需要实时掌握的当下，往往在这两者蹉跎间，转眼错失。,人生太短，聪明太晚,(6),人生短暂飘忽，包得有一首小诗这样写：,高天与原地，悠悠人生路；,行行向何方，转眼即长暮。,正是道尽了人生如寄，转眼即逝的惶恐。,有许多事，在你还不懂得珍惜之前已成旧事；有许多人，在你还来不及用心之前已成旧人。,遗憾的事一再发生，但过后再追悔早知道如何如何是没有用的，那时候已经过去，你追念的人也已走过了你。,人生太短，聪明太晚,(7),一句瑞典格言说：我们老得太快，却聪明得太迟。 不管你是否察觉，生命都一直在前进。,人生并未售来回票，失去的便永远不再得到。,将希望寄予等到方便的时间才享受,人生太短，聪明太晚,(8),我们不知失去了多少可能的幸福,不要再等待有一天你可以松口气，或是麻烦都过去了。,生命中大部分的美好事物都是短暂易逝的，,享受它们、品尝它们，,善待你周围的每一个人，,别把时间浪费在等待所有难题的完满结局上。,找回迷失的生命,死亡也许是免费的 但是，却要付出生命的代价。,劝大家一句话：把握当下，莫等待。,成功人生的十堂课,人生成功第,1,课,做一个终生学习的人，离开学校并不意味着学习就结束了。学习可以成为一种生活方式，帮助你发挥最大的潜能。我们从未停止学习，总会有新的，有趣的东西等待我们去发现。学习新的技能可能让人感到有一点恐惧，但每当我们在个人学习上停滞不前时，我们都需要去学习新的东西。积极地寻求支援和建议，突破停滞期。,【,大学课件,】,出品版权归原作者所有,!,参加一些培训，进修，夜校任何新的兴趣都将会有助于发展你的优势。多看，多听，让你的头脑保持活跃。活到老，学到老。,人生成功第,2,课,令自己感到沮丧的秘诀就是用空闲时间去烦恼自己是否快乐。所以不要费事去想它！摩拳擦掌干起来吧。你将热血沸腾，你会头脑清醒。很快，在你身体中的这种高涨的积极人生观将把烦恼从你的头脑中赶出去。行动起来，忙碌起来。这是世界上最便宜的一种药，也是最好的一种。,人生成功第,3,课,在困境中寻找成功的希望逆境是一所最好的学校。每一次失败，每一次打击，每一次损失，都蕴育着成功的萌芽，都教会我在下一次有更出色的表现。我再也不会逃避现实，也不会拒绝从以往的错误中获取经验，我不再因此而促成自己的失败。因为我知道，宝玉不经磨砺就不能发光，没有，我也不能完善自我。现在我知道，灵魂倍受煎熬的时刻，也正是生命中最多选择与机会的时刻。任何事情的成败取决于我在寻求帮助时是抬起头还是低下头。无论何时，当我被可怕的失败击倒，在最初的阵痛过去之后，我都要想方设法将苦难变成好事。伟大的机遇就在这一刻闪现这苦涩的根必将迎来满园芬芳！,我将一直在困境中寻找成功的希望。,人生成功第,4,课,没有人可以使你感到自卑我选择自我感觉良好，这样我能更加开放地学习。如果人们给我负面的回应或是批评我做的事情，我不会认为他们所说的就表明我是一个“差劲的”人。我坚信自尊由我掌控，这让我毫无戒心地去听取别人的反馈，想看看是否有我可以学习的东西。我们每天都有两种选择。我们可以感到自己很棒，也可以感到自己很差劲。难道有人会选择后者吗？,人生成功第,5,课,紧紧抓住梦想我们每个人都有梦想。我们每个人都希望能发自内心地相信自已有一种特殊的天赋，相信自己能发挥重要的作用，相信自己能以一种特殊的方式感动他人，相信自己能够把世界变得更加美好。在一生中，我们都曾经对自己渴望并追求的生活品质抱有憧憬。然而，对我们大多数人来说，这些憧憬在日常生活的成规和挫败中已经变得如此渺茫，以到于我们甚至不再努力去实现它们。对太多人来说，梦想已经远离，随之远离的还有塑造我们命运的意愿。很多人已经推动了坚定的信念，而正是坚定的信念为胜利者创造了优势。我们所要做的就是重拴梦想，并实现梦想，让我们每个人都记住，并去运用深藏在自己身上的无限潜能。,人生成功第,6,课,毅力无法替代世界上没有任何东西可以替代毅力。才干不可以，无所作为的能人十分普遍；天分不可以，碌碌无为的天才尽人皆知,;,教育不可以，受过良好教育的没落者更是随处可见。只要有毅力和决心，就是无所不能的。毅力并不总是意味着永远坚持做同一件事。它意味着无论你做任何事情，你都要立刻全心投入，竭尽全力；它意味着先做艰苦的工作，再去期待随之而来的满足和回报。它意味着开心地工作，渴望更多的知识和进步。它意味着多打几个电话，多夏装几里路，多除草，早起床，意味着总是寻求更好的方式去做你在做的事情。毅力就是经历考验和过失的成功。,人生成功第,7,课,驻足片刻闻花香在现代生活的忙忙碌碌中，人们很少会停下来欣赏自然的美。问问自己，你有多少次倾听过鸟儿的歌唱。你最近一次抬头仰望闪耀的星空又是在什么时候？时光飞逝，人生苦短。不要忘记驻足闻闻花香。我们在急于谋生的过程中，往往忽视了我们生活的品质。多少次，你听见人们为这为那说“我忙死了。”多可惜啊！有一天，当他们真的找到时间能够驻足片刻闻花香时，可能已经太迟了。,人生成功第,8,课,加入到微笑者和赞美者的行列来当你对别人，别人也会对你报以，你自然会感觉很棒。即使他有对你报以，你也会感觉很棒，因为你认识到世界上最贫穷的人就是从不微笑的人，当你对那个人微笑，你立刻变得更加富有。赞美也是这个道理。当你真诚地毛病抑或恭维一个人时，他将立刻受益，更喜欢自己。当你让别人感觉更好时，你自己也会感觉更好。,人生成功第,9,课,让自己快乐。调查表明，我们当中,70%,的人在生活中时间有临床性的抑郁现象。如今我们有这么多的机遇，为什么我们还这么不快乐呢？人们尝试各种东西：金钱，权利，事业，婚姻，离婚，酒精，摇滚甚至毒品，但我们大多数人只是想要得到一样东西快乐。快乐是人的一种自然的身心状态；我们只要去相信快乐，让自己感受快乐。要宣称：我应当得到快乐。,说出来，唱出来，喊出来。优先考虑快乐，让快乐成为你最重要的事情。对你所拥有的一切抱以感激之情吧。,人生成功第,10,课,我拥有无与伦比的想象力现在我将通过这种神奇的力量得到我想要的。,如果我害怕发表演讲，我就想象自己在公众场合无所畏惧，充满信心；,如果我在病魔的煎熬，我就想象我以前健康的样子；,如果我感到贫穷，我就想象我将要富有。,现在我明白了：,人类惟一的限制就是想象力。我之所以没有成功，原因就在于我不知道如何使用我的想象力。现在，我精通这个技巧，我将从中受益。最大的回报将是成功和愈加快乐。,你会管理时间吗,?,如何让自己一天的时间不止,24,小时呢,?,这里有一些总结,:,你会管理时间吗,?,（,1,）,1.,对目标、任务、会议等事件分别按优先级进行排序；,2.,从优先级最高的事物着手；,3.,和拖延做斗争，如果事情重要，从现在开始做；,4.,把大的、艰难的任务细分为小的、容易的部分；,5.,为自己创造一小时的宁静，哪怕这需要很强的意志力，或者有时不起作用；,你会管理时间吗,?,（,2,）,6.,找到一个隐蔽的地方，如图书馆或空闲的办公室；,7.,当你有重要的事情要处理时，学会对别人说“不”；,8.,学会委派别人做事；,9.,归纳相似的事情，把它们放在一起处理；,10.,减少例行事务：它们不值得花费过多时间。缩短低价值的事件。抛开没有价值的信件和文书工作。委派别人完成、减少或推迟优先级很低的任务；,你会管理时间吗,?,（,3,）,11.,避免完美主义。记住,80/20,定律；,12.,避免做出过多许诺。对你在有限时间内能完成的工作持现实态度；,13.,不要把时间表排得满满的，为自己留下一定机动时间应付突发事件；,14.,设置时间限制。例如，做某些决定时，不应超过,3,分钟；,15.,聚精会神地做手头的事情；,你会管理时间吗,?,（,4,）,16.,处理重要事情时，使用大块的时间；,17.,迅速处理困难的事情，等待和拖延不会使它们变容易；,18.,文书工作争取只处理一次；,19.,在行动以前，彻底地思索整件工作；,20.,第一次就做好。,成功是一种习惯，习惯是需要培养的,成功是一种习惯，习惯是需要培养的（,1,）,1,：找方法，不找借口。,2,：遇到挫折时，对自己说“太棒了”。,3,：不说消极的话，不落入消极的情绪，一旦出现立即正面处理。,4,：随时用零碎时间做零碎的事。,5,：写下来，不要太依靠脑袋记忆。,6,：随时记录灵感。,7,：守时,8,：把重要的观念方法写下来，并随时提醒自己。,9,：走路时，比平时快,30%,，肢体语言要健康，有力，不懒惰，不萎靡。,10,：每天自我反省一次。,11,：每天坚持一次运动。,12,：开会坐在前排。,13,：微笑。,14,：说话时，声音有力。,15,：说话之前，先考虑对方的感受,16,：每天有意识或真诚地赞美别人,3,次,17:,不要用训斥 指责的口吻跟别人说话,.,18:,每天做一件分外事,.,19:,节俭,.,20:,恪守诚信,说到做到,.,成功是一种习惯，习惯是需要培养的（,2,）,“好的习惯让人立于不败之地，坏的习惯则让人从成功的宝座上跌下来”。拿破仑希尔认为，,如侵权，请告知，吾即删！联系,QQ,：,910670854,保罗,盖蒂的这句话很有道理。,有一段时期，盖蒂抽烟抽得很凶。一天，他去法国度假的途中，在一个小旅馆投宿。晚上下起了大雨，地面特别泥泞，开了好几个钟头的车之后，盖蒂实在是累极了。吃过晚饭，他就回到自己的房间里，睡着了。但是清晨时分盖蒂突然醒了过来，他很想抽支烟，于是他就打开了灯，很自然的伸手去摸他一般都会放在床头的烟，但是没有。他下了床，到衣服的口袋里去找，也没有。于是他又在行李袋里找，结果他又一次失望了。他知道这个时候旅馆的酒吧和餐厅早就关门了。他想，这个时候把不耐烦的门房叫过来，实在是不可能。现在他唯一能得到香烟的方法就是穿好衣服，到火车站去，但是那还在,6,条街之外呢。,成功是一种习惯，习惯是需要培养的（,3,）,看来情形并不乐观，外面还下着雨。他的汽车也停在离旅馆还有一段距离的车房里。而且，在他住店的时候，别人也提醒过他了。车房的门是午夜关，第二天早上,6,点才开门，现在能叫到出租车的机率也相当于零。,显然，要是他真的迫切地需要一支烟，那么他只能在雨里走到黑暗中。抽烟的欲望不断地折磨着他。于是，他下了床，脱下睡衣，穿好衣服，准备出去。正在他伸手拿雨衣的时候，他突然笑了起来，笑自己傻。他突然觉得，自己的行为多荒唐可笑。,盖蒂站在那里，心里不停地想着，一个所谓的知识分子，一个商人，一个认为自己有足够的智慧可以对别人下命令的人，居然在三更半夜要离开舒适的旅馆，冒着大雨走上好几条街去买香烟。,盖蒂也是生平第一次注意到，他现在早就养成了一个坏习惯，那就是为了一个不好的习惯，他可以放弃极大的舒适。看来，这个习惯对他并没有什么好处，于是，他的头脑立刻就清醒了过来，很快他就做出了决定。,成功是一种习惯，习惯是需要培养的（,4,）,他已经决定好了，就走到桌子旁边把那个烟盒团起来扔出去，然后重新换上睡衣，回到舒服的床上。心里怀着一种解脱，甚至是一种胜利的感觉，很满足地关上灯，合上了眼睛。在窗外的雨声里，他进入了一个从来没有过的深沉的睡眠。自从那个晚上之后，他再也没抽过一根烟，也再没有想过要抽烟。,盖蒂说，他并不是想用这件事来指责那些有抽烟习惯的人。但是他经常回忆那天晚上的情形，他只是为了表示，按照他当时的情况，他差点被一种恶习俘虏。,经常做一件事就会形成习惯，而习惯的力量是难以抗拒的。但是人类还有一种潜藏的缓冲能力，也不容小觑。既然人有可能养成一种习惯，那肯定他也有能力改掉这种习惯。,还有些人说，奇怪的是，养成好习惯很难，但是一个坏习惯却在不知不觉中就已经形成了。但是，事实并非如此，这还要看一个人的毅力。不管怎么说，习惯终归是习惯，并没有合理的理论说坏习惯要比好习惯更容易养成。,成功是一种习惯，习惯是需要培养的（,5,）,动作敏捷或迟缓只是个时间的问题，一个人要么习惯了准时，要么他就会习惯迟到。,一个准时的人，总会体会到这种习惯给他带来的好处，无论是约会，会议，还是什么别的方面的承诺。如果别人请你吃饭，你迟到了，那就会给主人和其他的客人造成不便。你可能会因此而变得很不受欢迎，以后人家都不会再请你吃饭了。,拿破仑 希尔认为，对商人来说，准时是一项特别宝贵的资产。俗话说得好，“时间就是金钱”，这句话永远是正确的，现在这个时代里，这个原则比以前更加重要。现代企业的步调是一日千里，分秒必争。主管和高级职员的每日安排都是满满的，因为他们可没有多余的时间可以浪费，就像生产线不能耽搁一样。,守信对生意人来说，是个难得的品德，最有希望成功的商人和公司，他们一定是准时接受定单，准时回复并交货，提供服务，准时付款，准时还债。如果等时间已过去了，订货还没到，那顾客下次可能就不找你了。,成功是一种习惯，习惯是需要培养的（,6,）,节俭是另外一种可以养成的习惯，对天生节俭的人来说，这个习惯给他带来的成功的机会要比别人多。而习惯了节俭的人，他只知道在乎时就要注意节减开支和成本。,受用一生的教诲：职场,10,只魔戒,N,条箴言,第只魔戒,第一条箴言：习惯仿佛像一根缆绳，我们每天给它缠上一股新索，要不了多久，它就会变得 牢不可破。,第二条箴言：人类所有优点都要变成习惯才有价值，即使,爱,这样一个永恒的主题，你也 必须通过不断的修炼，变成你的习惯，才真正会化为你的行动。,第三条箴言：很多好的观念、原则，我们,知道,是一回事，但知道了是否能,做到,是另 一码事。这中间必须架起一座桥，这桥便是习惯。,第四条箴言：科学家研究发现，一个习惯的养成需要天的时间，这天是个平均数， 但习惯一旦养成就将终生受用。,第五条箴言：任何一个习惯的培养都不会是轻而易举的，因此一定要遵循循序渐进、由浅入 深、由近及远、由渐变到突变的原则。,第只魔戒,第一条箴言： 人生来是简单的，和文明打交道之后变得复杂了，陷入了某种复杂的旋涡中 无法自拔，这些羁绊使人忘记人性的最终追求是平静、简单、自由。第二条箴言：不经过复杂的简单是一种苍白，我曾经很人为地把金钱放在一边它却不安分， 但今天当我驾驭了金钱，它就能很安分地呆在一边。,第三条箴言：要锻炼一个人的财商，让他具有富人心态，首先他确实要学会放弃，同时也要 学会克服，要学会走出很多障碍和阴影。,第四条箴言：财商教育的根本目的是让人们获得自由，增加收入、减少财务问题的初衷是减 少人们在金钱上的虚荣心和攀比风。,第五条箴言：财商教育要解决人类面对金钱的两大问题：恐惧与贪婪。而为了生活稳定这个 假象，人们常常沦为金钱的奴隶。,第六条箴言：对于金钱，不是说你要成为它的主人，而是要做到与之和谐、平等，因为它反 映的是你自己，所以对它要多一分宽容。,第只魔戒,第一条箴言：成功的实质就是获得自由度，就是当你想当的人，做你想做的事，去你想去的 地方，说你想说的话。,第二条箴言：世上没有懒惰的人，只有没有目标的人。世界上最贫穷的人就是没有目标的人 ，因为连,梦想,都没有，还会拥有什么？,第三条箴言：只有明确而具体的目标才可衡量，而只有可衡量的目标才可能达到。,第四条箴言：付出就表示富有，索取就是贫穷，快行动起来，用行动表现你的,富有,。,第五条箴言：心态、目标、时间管理三者的集中点就是在行动上，三者的表现特征也是,行 动,。它们共同形成,知行合一,的统一体。,第只魔戒,第一条箴言：人的一生就是不断地闯入一个又一个圈子并不断争取承认的过程。,第二条箴言：在西方社会，特别是在北美，只有那些树立自我推销和成功意识的人，才有可 能赢得机会与成功。第三条箴言：国际化人才不是一个地理意义上的概念，而是文化、心理层面的概念。是否是 国际化人才取决于一个人的涵养、知识构成和思维模式。,第四条箴言：创业的失败率是非常高的，在美国，每年有几十万人开公司，每年也有几十万 家公司倒闭，所以创业只适合一部分人。,第五条箴言：我时常摸着跳动的心口，数着那一下一下的脉搏，计算着我的生命长河究竟能 卷起多少浪花。我要让短暂的生命，爆发出火花。,第六条箴言：命运不是机遇，而是一种选择。命运从来都不是一种可以等到的东西，而是一 件需要去完成的事情。,第只魔戒,第一条箴言：不管你对成功如何定义，积极总是有价值的。积极不一定成功，但消极肯定失败。,第二条箴言：成功学的最大的特征就是强调标准化和量化，把认为说不清楚、不可琢磨的东 西都变成可琢磨、可操作的东西。,第三条箴言：成功绝对有捷径，当然它的捷径绝对不是整个过程，这个捷径告诉我们的是必 须按照最有效的成功策略去做，否则你就会越忙越出错。,第四条箴言：人的改变会遵循一定的轨迹，即：结果决定于行为，行为决定于态度，态度决 定于信念，信念决定于自我期望。,第五条箴言：人对环境有四种反应：第一是离开环境；第二是改变环境；第三是适应环境； 第四是抱怨环境。前三种反应都有可能从中找到新的生机，只是千万不要选择第四种反应。,第六条箴言：成功的秘诀第一个是坚持到底，永不放弃；第二个就是当你想放弃的时候，再 照着第一个秘诀去做：坚持到底，永不放弃。,第只魔戒,第一条箴言：人们总是感到自己是对的，别人和世界都是不对的；所以人们总想改变世界、 改变别人，很少想到改变自己。其实，改变世界应该先从改变自己开始。,第二条箴言：不少老板都恨不得把员工改造成跟自己一样的人，其实最不像你的人、你最不 喜欢的人，或许正是你的团队最需要的人。,第三条箴言：性格本身并没有好坏之分，也没有谁对谁错。乐观和悲观对这个世界都有贡献 ，前者发明了飞机，后者发明了降落伞。,第四条箴言：这是一个充斥着个性的时代，这是一个峥嵘着个性的社会，许多个性相差甚远 的人都在适于自己的路上找到了自己最好的归宿。,第五条箴言：个性是半个生命，丧失个性就是半个死亡。,第只魔戒,第一条箴言：中国人的问题是更重视历史，但缺少前瞻性的思维。其实我们更应该具有未来 决定现在这样一种思考。,第二条箴言：如果中国只变成一个世界工厂是不行的，我们的最大优势是人，但现在还只是 重视数量而没重视质量。,第三条箴言：社会认可是动态的，历史上有很多人就是生前不被社会认可的，像梵高的画， 像马克思的思想。,第四条箴言：个性化发展强调的是你自己的个性，是适合自己的途径，我切身的体会不是学 识上的成长，而是精神上的成长。,第五条箴言：科技发展的日新月异、信息的爆炸，使本领的地位比任何时代都高，本领恐慌 比任何时代都更可怕。,第六条箴言：在世纪，拥有创造性学习能力是最根本的应变之道。,第只魔戒,第一条箴言：在生活中所极力追求的，应该是按自己内心深处确认的人类的永恒价值，而不 是流行的市场价值。,第二条箴言：人的智慧力、道德力和意志力，是重要的“人格三要素”。这三种力量越强的 人，越容易达到自我实现的最高境界。,第三条箴言：高峰体验既是一种最佳状态，又是一种终极体验。经历了这种高峰体验的人， 也就会产生这辈子没有白活的感觉。,第四条箴言：物质需要属于匮乏性需要，它的满足引起的感觉是短暂的、肤浅的；自我实现 需要是成长性需要，它的满足才会产生持久的、深刻的感觉。,第五条箴言：第一流的菜汤比第二流的绘画更具有创造性。,第只魔戒,第一条箴言：任何职业生涯规划都不能对未来进行非常精确的预测，但人们可以进行环境分 析、个人条件分析，然后在此基础上确定自己的目标。,第二条箴言：评判职业成功与否没有统一的标准，这里有一个标准可做参考，即在实现目标 的过程中快乐一定要多于痛苦。,第三条箴言：人的自我实现就是人的创造性潜能的充分发挥，求知是自我实现的前提，求美 是自我实现的过程。,第四条箴言：职业生涯开发与管理讲求的是：只要开始，永远不晚；只要进步，总有空间。 重要的不是目前所处的位置，而是迈出下一步的方向。,第五条箴言：当你还没有把一件工作做好的时候，就没有资格说不喜欢；只有把工作做好了 ，甚至超过了领导的期望，你才有资格谈离开的问题。,第只魔戒,第一条箴言：职场革命引发了新的学习革命，所以我们需要对学习进行新的理解。,第二条箴言：我们通常把学习当做传统教育的一部分，而不是把它当做工作的一部分，其实 大多数人是一边工作一边学习的。,第三条箴言：有好文凭就有好工作的观念正在受到质疑，人事主管们对学历并不特别看重， 他们更看重的是有无经验、品质才能如何以及有没有创造性。,第四条箴言：当你为自己的成功担负起责任时，工作之于人就变成了一次历险。我开始把生 命看做是自己经营的一项事业。,第五条箴言：教育应该提供的是一个市场，让每个人在里面找到相应的资源。要有多种多样 的特点，而不能按一套模式进行。,第六条箴言：不少专家谈起理论头头是道，可在培养自己孩子的问题上却一塌糊涂。对于培 养孩子来说，没有人掌握了完美的方法。,办公室白领经典描述,1,：自我感觉最牛的人,-,财务部员工,老子不求人，人人求老子！于是乎，这帮狗屎们天天拽得好像自己是救世主是其他员工的再生父母一样，牛！超级牛！,100,牛！我活这么大了还真没看到过不牛的财务，这帮人其实在公司是同事们最不敢得罪、但更是最让人看不起，人际关系最差的一群人，当然，据我观察，也是离婚率最高的一类人。,2,：最有城府最有心计的人,-,人力资源部员工,每天的工作就是算计如何搞出用最小代价换取最大回报的提议来讨好老板，看谁不顺眼就想方设法算计如何在考核、薪酬奖金分配方面给他穿小鞋的鸟人。,3,：智商最高情商最差的人,-,研发部员工,技术过硬，为人木衲。上台发言三分钟 搞不出一句话来，向领导汇报工作结结巴巴没,更多精品文档请访问我的个人主页, 脑、一张桌子、一小叠钞票就是工作的全部。每天,75,的时间上网聊,QQ,，,15,的时间琢磨晚上的活动偷偷照镜子化妆、挤青春痘，,5,的时间在工作，,5,的时间在传播小道消息。晚上到的厅转转，在那蹦的的女孩，除了,15,是学生,MM,，,10,是打工妹外，剩下的基本上都是这些文员了，即便现在不是，但以前肯定是。,7,：最没分量最窝囊的人,-,行政部员工,天天累得跟猪爬树一样，琐事最多，功劳最小，批评最多，所以导致牢骚也最多，因心情郁闷所以传播小道消息也最热衷，因不被承认，被人看不起，所以这群人内心最畸形。行政部经理表现最明显，行政助理和文员说白了就是他们蹂躏和发泄的极好对象。,8,：最计较最不安好心的人,-,司机,如果你得罪他们了，从此你申请派车急着外出时，司机告诉你车正巧坏了要去修；从此你在车上发的丁点牢骚，不出半天就会被添油加醋的传到老板耳里,这还不算什么，最让人受不了的是，掐公司的汽油倒卖，和车修所的串通吃回扣，闲的时候借口修车外出陪女老乡，呵呵，龌龊的事情不少呢。,9,：最蚕古的员工,-,客服部员工,对客户要客客气气，对同事也得客客气气，有气只能哑巴吃黄连,