微生物实验常识

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,表,1,我国各主要土壤的含菌量(万/克干土),土类 地点细菌放线菌真菌,暗棕壤 黑龙江呼玛2,32761213,棕壤 辽宁沈阳1,2843936,黄棕壤 江苏南京1,4062716,红壤 浙江杭州1,1031234,砖红壤 广东徐闻5073911,磷质石灰土 西沙群岛2,2291,10515,黑土 黑龙江哈尔滨2,1111,02419,黑钙土 黑龙江安达1,0743192,棕钙土 宁夏宁武 140 11 4,草甸土 黑龙江亚沟7,8632923,嵝土 陕西武功9511,0324,白浆土 吉林皎河1,598553,滨海盐土 江苏连云港466410.4,1,1、取土样,选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约,2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取210cm处的土壤。,盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎,石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取10-,15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，,计算含水量。,四、土壤微生物的分离和计数,2,2、 倒平板,熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平,板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。,3,4,8. 计数,选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀,释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30300,之间的平皿，霉菌选菌落数在10100之间的平皿，最后换,算成每克干土所含菌数。,同一稀释度的平均菌落数稀释倍数,每克干土含菌数 =,1土壤含水量,5,一、水样采集,6,自来水水样,：,先将自来水龙头用火焰,烧灼3min灭菌,，再开放水龙头使水流5 min（经常用水的水龙头放水1,3min）后，采集水样于,无菌锥形瓶,，约,占瓶容量80%,，以便摇匀水样。,水源水水样,：,选有,代表性的地点,及可疑地方，一般,距水面下10,15cm采样,。采样后，将,瓶塞盖好，再从水中取出,。,7,注意事项,严格无菌操作,。,做好标记,：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目。,从速送检,。水样从采集到检验不应超过2h，在04下保存不应超过24h。,8,二、菌落总数的测定, 平板菌落计数法,9,方法,稀释水样,：,无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。,取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000, 1:10000水样。,10,方法,倾注培养,：,用1ml无菌吸管吸取,23个适当浓度的稀释液,1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。,菌落计数,：方法同饮用水。,11,菌落总数测定,12,结果分析与报告,计算,不同稀释度,的平均菌落数：,稀释度的选择,和菌落总数报告方式：,首先选择平均菌落在30,300之间者进行计算。,计算方法和报告方式如表1所示。,13,由表2可判定水质被污染的程度。,表2 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系,水的类别,最清洁水,清洁水,不太清洁水,不清洁水,极不清洁水,菌落总数,cfu,m1,10100,100,1000,1000,10000,10000,100000,100000,14,1.9灭菌与消毒,消毒,：是指应用物理或化学方法杀死物体表面和内部的病原微生物，而对非病原微生物 及其芽孢并不严格要求全部杀死。用于消毒的化学物质，称为消毒剂。,灭菌,：是指杀死一切病原菌和非病原菌及其芽孢，使物体上无任何存活的微生物,15,消毒与灭菌的区别,消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体.,灭菌是指杀灭一切微生物的营养体,芽孢和孢子.,16,干热灭菌法,灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品灭菌。,干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至,160,，恒温,1,小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。,17,湿热灭菌法:,在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。,18,19,图412 细菌菌落形态。（a）肉眼观察的细菌菌落形态的多变性。菌落总体形状和边缘状况可由菌落上方俯视观察。而菌落高度则由平板边缘水平观察。,20,1、简单染色,(四）实验方法：,制片染色水洗干燥镜检,（,1,）制片：,取菌种培养物,常规涂片,、自然干燥、加热固定；,注意无菌操作,21,芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。,22,中央芽孢,偏端芽孢,游离芽孢,末端芽孢,23,荚膜,是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。,荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬,。,24,荚膜染色结果,背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。,25,（二）实验原理,放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体带一类革兰氏阳性细菌。,26,放线菌菌落形态,27,（二）实验原理,酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物。,无性繁殖主要是,出芽生殖,。,28,本实验通过用,美蓝染色浸片,来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。,29,美蓝（氧化型）,蓝色,美蓝（还原型）,无色,还原剂,氧化剂,美蓝,是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色。,30,死活细胞鉴别原理,美蓝（氧化型）,蓝色,美蓝（还原型）,无色,酵母活细胞,新陈代谢,还原能力,31,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）实验作业,培 养 基 的 制 备 与 灭 菌,实验五,32,（一）实验目的,1、明确培养基的配制原则；,2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；,3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；,4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。,33,（二）实验原理,培养基,是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基.,培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基,34,常用加热灭菌法,：,1、干热灭菌：,用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌,2、湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,间歇灭菌法,煮沸消毒法,灭菌,是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。,35,（三）实验器材,1.药品和试剂：,牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10NaOH溶液、10盐酸溶液。,2.器材：,天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。,36,1.,称量,按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。,配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂20.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。,（四）实验方法,培养基的制备过程,称量-溶解-调节pH值-过滤-分装及包扎-灭菌-灭菌后试管摆放斜面,37,2.溶解,向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。,3.调节pH值,用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH。,38,4.过滤,用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。,5.分装及包扎,根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。,39,6.,灭菌：,高压蒸汽灭菌，,121,0,C,灭菌,20,分钟。,40,7.,灭菌后试管摆放斜面,41,42,43,注 意 事 项,1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；,2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；,2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；,4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2 ；,5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。,返 回,44,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）实验作业,微 生 物 的 分 离 与 纯 化,实验六,45,（四）实验方法,（一）、稀释混合平板法,图14-1 从土壤中分离微生物操作过程,46,47,（三）平板划线分离法,交叉划线法 连续划线法,48,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）实验作业,微生物数量的测定,实验七,49,（二）实验原理,利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。,50,实验,内容,3,（微生物的分离平板划线法）,制平板。,凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10,-1,）在平板上划线。,1.连续划线法：,将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于2830,0,C温室培养。,2.分区划线法：,用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约60,0,C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。,挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。,51,52,平板划线菌落分离效果图,53,土壤里的微生物,54,土壤中的微生物主要有,细菌,、,放线菌,、,真菌,等。,它们能够,分解,植物的枯枝烂叶、动物的遗骸等，,使土壤,变得更加肥沃。,阅读课本P102，回答下列问题：,1、土壤里的微生物主要有哪些,种类,？,3、微生物的,作用,有哪些？,55,认识细菌,细菌的三种形态,球形、杆形、螺旋形,56,细菌的基本结构,观看动画,57,动物细胞和植物细胞,58,讨论：,细菌,细胞与,植物,细胞、,动物,细胞的异同处,细菌,的细胞结构由细胞,壁,、细胞,膜,、细胞,质,、,没,有成形的细胞,核,、,鞭毛,（有的细菌有）组成。,与植物细胞、动物细胞相比较，它们,都,具有细胞,质,、细胞,膜,；植物细胞和细菌细胞具有细胞,壁,，动物细胞没有；细菌细胞具有,没有成形,的细胞核，植物细胞和动物细胞,有成形,的细胞核。,59,认识放线菌,放线菌是一种具有,分枝,的,丝状体,。由于菌丝内没有横隔，也,没有成形,的细胞,核,，所以一般认为放线菌是一种特殊的,细菌,。,60,61,放线菌的菌丝分为,营养菌丝、气生菌丝和孢子丝,。,营养菌丝,生长在营养物质内，吸收其中的营养。,气生菌丝,生长在空气中。,当放线菌生长发育到一定阶段，气生菌丝的顶端形成,孢子丝,。,孢子丝生长到一定阶段就产生,孢子,。孢子在适宜的条件下萌发，形成新的,菌丝体,。,62,认识真菌,酵母菌,、,霉菌,和,蘑菇,都是一些常见的真菌。,霉菌,的种类很多，最常见的有,青霉,和,匍枝根霉,。,63,观察青霉和匍枝根霉,橘皮上的青霉,64,青霉的形态,65,青霉,的种类很多，从有些青霉中可以提取,青霉素,。,青霉素是一种常用的,抗生素,，对治疗,肺炎、脑膜炎,等疾病具有显著效果。,阅读,P111,资料“青霉素和弗莱明”,66,馒头上的匍枝根霉,67,匍枝根霉的形态,68,P105讨论：,青霉和匍枝根霉在形态上,呈丝状,，它们依靠,孢子,进行,繁殖,。,青霉的直立菌丝内,有,横隔,，顶端呈,扫帚,状,，成熟的孢子呈,青绿,色,；,匍枝根霉的直立菌丝内,无,横隔，,顶端呈,球,状,，成熟的孢子呈,黑,色,。,它们细胞内,没有,叶绿体。是通过,营养菌丝,从营养物质内吸收水分和获得有机养料，进行,腐生,生活。,69,香茹,70,平菇,71,食用菌,名贵中药材,名贵食用菌,剧毒真菌,72,真菌的主要特征,真菌的菌体,没有,根、茎、叶，大多数种类是,多细胞,个体；细胞里,不含有,叶绿体，,不能,进行光合作用制造有机物，只能进行,腐生或寄生,的生活，依靠,孢子,进行,繁殖,。真菌是一类,低等,的生物。,73,寄生,腐生,生活在一起的两种生物，一方获,利,，而另一方遭受损,害,。寄居在别种生物上并获利的一方称,寄生物,，被寄居并受害的一方被称为,寄主,。如寄生在人体内,血吸虫、蛔虫,。,抗生,指一个物种通过分泌化学物质,抑制,另一个物种的生长和生存。,青霉,就是著名的一例。,指动植物以,腐烂,的动植物尸体为,生,，如,蛆,。,74,微生物与人类的关系,75,作为,分解者,参与自然界,物质循环,，微生物能将动植物的尸体,分解,，回归自然界，,供植物,直接,利用,。,76,用于,酿酒、制作食品,等。如用,乳酸杆菌,制作酸奶、泡菜等，用,酵母菌,酿酒、蒸馒头等。,77,用于,制药,。已发现的,抗生素,中约,85%,来自,放线菌,。,78,引起,动植物,和,人,患病,。如玉米的黑粉病等是由,霉菌,引起的。,79,微生物与人类的关系,在,食品加工,、,制药,、,农业病虫害防治,以及,环境污染的治理,等方面，微生物有着,重要,的,作用,。,此外，有些微生物也会使,人体,或,动物,致病,。,80,1、菌落,81,