膜片钳与LTP

*,25,25,*,*,*,*,膜片钳与,LTP,天津中医药大学第二附属医院,王凯,2014.5,来源和机理,细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。,离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构。,带电离子在膜内外的不同分布态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础。,细胞膜的结构和离子通道,1.,结构研究：,分子生物学方法确定蛋白质序列；,X,光绕射方法确定其三维立体结构。,2.,功能研究：,电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。,3.,结构和功能相结合：,利用基因突变技术在一级结构的特定部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变。,如何研究离子通道,美国的两位科学家,彼得,阿格雷,罗德里克,麦金农,利用,X,光绕射方法得到了,K,离子通道的三维结构，二位因此获得,2003,年诺贝尔化学奖。,结构研究,采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术,电压钳,(Voltage clamp),技术,膜片钳,(patch clamp),技术,离子通道功能观察,20,世纪初由,Cole,发明，,Hodgkin,和,Huxley,完善，目的是为了证明,动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。,但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性。,电压钳技术,(Voltage Clamp),cole,K,+,电流,Na,+,电流,电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点：,微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性。,不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。,对体积小的细胞,(,如哺乳类中枢神经元，直径在,10,30m,之间,),进行电压钳实验，技术上有更大的困难。,电压钳的缺点,为了弄清,膜电导变化的机制,和,离子通道,的存在，也为了克服电压钳的缺点，,Erwin,Neher,和,Bert,Sakmann,在电压钳的基础上发明了膜片钳，并利用该技术首次在蛙肌膜上记录到,PA,级,(10,-12,A),的乙酰胆碱激动的单通道电流,首次证明了离子通道的存在。并证明在完整细胞膜上记录到的膜电流是许多单通道电流总和的结果。这一技术被誉为与分子克隆技术并驾齐驱的划时代的伟大发明。二人因此而获得诺贝尔生理或医学奖。,(,Neher,),(,Sakmann,),膜片钳（,Patch Clamp),基本原理,利用尖端直径,0.5-1um,的玻璃电极吸附到细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端和细胞膜形成紧密封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（,patch,）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定膜电位,(clamp),，然后对电极尖端下面积仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。,核心部分是一场效应管运算放大器构成的,I-V,转换器，它的正负输入端子为等电位。向正输入端子施加指令电位（,Vc,）时，经过短路负端子可使膜片等电位，从而达到电位钳制的目的。离子通道电流可作为,I-V,转换器内的高阻抗反馈电阻的电压降而被检测出。,电子学部件,:,放大器；计算机接口，数据采集、分析系统。,光学部件和光电接口,：,显微镜；监视器等。,机械系统,:,防震台等。,辅助系统,：,电极拉制器；切片机；孵育槽；灌流系统等,膜片钳实验系统组成,膜片钳的几种记录模式,膜电位或膜电流,单通道电流,1.,液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。,2.,标本制备,3.,记录,4.,资料分析：,（,1,）一般电学性质：,通过,I-V,关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型,。,（,2,）动力学：,开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型（簇状猝发样开放与闪动样短暂关闭），化学门控性通道的开、关速率常数等,。,（,3,）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，,可得到半数激活或失活电压,Vh,及斜率因子,K,。,（,4,）药理学：,阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。,（,5,）综合分析得到最后结论。,膜片钳实验的基本过程,250 ms,400,pA,mEPSC,sEPSC,、,mEPSC,突触电流,此项技术首先要使电极和细胞形成高阻封接，而要成功形成高阻封接，除了制备合符要求的电极外，制备活性好的细胞是必须的，要求细胞表面光滑，有弹性，表面无麻斑。,如果有关实验要在脑片上进行，就涉及到脑片制作，适用于膜片钳研究的脑片制作尤其是成年动物的脑片制作尤其难，因此，有人说膜片钳的成功,80%,在于标本的制备。,传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个过程都需人工操着，任何一个环节都有可能失败，而如果细胞质量不好，成功率更低，因此，对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，即使有经验的人员，一天也只能成功记录,10-20,个细胞，而脑片实验往往每天只能得到,1-2,个实验数据，一个实验课题往往要几个月时间才能完成，因此要求实验者要有充裕的时间进行此项工作。,膜片钳实验的难点,膜片钳技术的应用,细胞特性的研究,离子通道的鉴别,电压门控性离子通道的动力学特性研究,突触联系、突触传递的研究,疾病机制研究,药物筛选,其他,长时程增强（,LTP,）是评价学习记忆及其突触可塑的常用的电生理指标。目前，海马脑片离体实验己经广泛用于学习记忆方面的研究，利用膜片钳技术记录脑片,LTP,，可在细胞水平研究学习记忆的机制。,当今从不同方面对突触,LTP,与学习记忆的关系进行了大量的研究，其结果大致可概括为：,影响,LTP,的因素确实对学习研究过程产生明显的影响,影响学习过程的因素也影响,LTP,形成,诱导海马脑区的,LTP,形成可提高学习记忆活动，学习过程中伴有海马脑区,LTP,的形成。,突触可塑、学习记忆及其机制的研究,膜片钳技术的联合应用,膜片钳和钙图像技术的联合应用,Ca,2+,是重要的信使物质，,Ca,2+,的信使功能是通过调控细胞内游离,Ca,2+,浓度来实现的。,Ca,2+,信号的产生和终止是细胞内,Ca,2+,增减、波动的结果。因此测定细胞溶质中的,Ca,2+,浓度是十分重要的。,钙荧光指示剂法是目前应用最广泛的,也是较好的测定胞内,Ca,2+,浓度的方法。目前常用孵育法将荧光指示剂如,Fura-2/AM,导入细胞。因为荧光指示剂被酯化后,很容易跨过质膜进入细胞内。在胞内,酯形式指示剂被非特异性酯酶水解,重新与,Ca,2+,结合，在,340nm,380nm,的荧光强度比值能够很好的反映,Ca,2+,浓度。,应用酯类的荧光物质负载进入细胞的方法尽管较为简便,但是,荧光染料会累积在胞内的酸性细胞器中,(,称为隔室效应,) ,而不是与细胞胞浆内的游离,Ca,2 +,相结合,因此会导致测量上的误差,且这种方法不适用于植物细胞，因为植物细胞的质膜存在非特异性酯酶，导致指示剂未进入胞内即被水解，利用膜片钳的全细胞技术，可将荧光探针直接导入细胞，从而避免隔室效应，也可通过膜片钳电极将细胞内的荧光探针抽吸稀释掉，从而测定细胞器（线粒体，内质网等）内的游离钙离子浓度。将膜片钳和钙图像技术联合应用可在测定细胞内游离,Ca,2+,离子浓度的同时检测离子通道的功能改变。,学习记忆的主要研究手段,行为学,：,水迷宫，八臂迷宫，,fear conditioning,，跳台，穿梭箱,突触可塑性,：,主要包括长时程增强（,long-term,potentiation,LTP,）和长时程抑制（,long-term depression,，,LTD,）,分子生物学,：,钙调蛋白激酶,II,（,CaMKII,），,CREB,，,PKA,等,LTP,LTP,学习记忆的细胞学基础,在突触前给予高频电刺激后，随后的单个刺激引起的突触后诱发电位的幅度将显著增大，诱发电位的潜伏期缩短，这种现象可持续很长时间，在活体动物可持续几天到几个星期，在离体标本可持续几个小时，这就是,LTP,现象。,LTP,诱导机制,已经肯定有突触前谷氨酸递质和突触后谷氨酸受体（尤其是,NMDA,受体）、细胞内游离钙离子的参与。,LTP,突触可塑性是学习记忆研究方面近年来进展最快、成果最大的研究领域。很多脑区都发现了突触可塑性现象，如小脑、海马、皮层以及伏隔核等。,海马区主要有三个突触回路，包括：,（,1,）,前穿质纤维,-,齿状回通路，即,PP-DG pathway,（,2,）苔状纤维,-,海马,CA3,通路，即,MF-CA3 pathway,（,3,）,Schaffer,纤维,-CA1,通路，即,SCCP-CA1 pathway,LTP,高频刺激突触前纤维引起突触前神经元去极化，引发谷氨酸类神经递质大量释放；,谷氨酸类神经递质作用于突触后的,AMPA,受体，引起细胞膜的去极化，解除镁离子对,NMDA,受体的阻滞使该受体激活并进一步引起大量的钙离子内流；,电生理记录上反映为,EPSP,或,EPSC,幅度的增加，即,LTP,。,钙内流引发一系列胞内信号通路激活和生化反应发生，使突触后反应能力增加；,LTP,原理,海马脑片,LTP,记录电极,海马脑片上电极的放置,在体,LTP,刺激电极,:,采用针灸针，多为双极电极,定位坐标,(mm),：,AP 8,，,LM 4,，,DV 3.2-3.5,记录电极：采用针灸针，为单极电极,定位坐标,(mm),：,AP 4,，,LM 2,，,DV 3.2-3.5,AP,anteroposterior,前囟前后,LM,lambda,人字缝尖,DV,dorsoventral,颅骨（硬脑膜）平面向下,大鼠体重：,180-240g,在体,LTP,和膜片钳脑片,LTP,的区别,在体海马,LTP,的优势在于能较真实的反映生理状态下神经突触活动的情况，在整体条件下观察神经突触活动的变化，利于宏观角度研究和探讨相关机理。脑片标本可提供与在体相似的突触结构和神经环路，其优势在于排除活体血压、温度、电解质、血脑屏障等干扰因素，按照不同的实验目的可改变脑片灌流液的成分和条件。,25,