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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,人教版选修,1,专题,5 DNA,和蛋白质技术,课题,3,血红蛋白的提取和分离,一、基础知识,：,（一）,蛋白质提取和分离原理,（二）蛋白质提取和分离的方法,1,、凝胶色谱法,：又称分配色谱法,2,、电泳,法,（三,）缓冲溶液,二、实验操作实验步骤,血液组成成分,1.,洗 涤,红 细 胞,2.,释放,血红蛋白,3.,分离,血红蛋白,4.,透析,血红蛋白,样品处理,和粗分离,纯 化,纯度鉴定,蛋白质提取与分离的依据,蛋白质的物理化学性质差异：,1.分子的形状、大小,2.电荷性质和多少,3.溶解度,4.吸附性质,5.对其他分子亲和力,1.,凝胶色谱法,1,）原理：,2,）材料：凝胶,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；,小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶是,微小的多孔性球体,，如,葡聚糖或琼脂糖,。内部有许多贯穿的,通道,.,根据相对,分子质量的大小,分离蛋白质的方法,概念：,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，,促使蛋白质分子的差速流动。,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,2,凝胶电泳法：,1,）原理：,不同蛋白质的,带电性质,（正电荷或负电荷）,、电量、形状和大小,不同，在电场中受到的作用力,大小、方向、阻力,不同，导致不同蛋白质在电场中的,运动方向,和,运动速度,不同。,2,）,影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考,：,蛋白质为什么带有电荷？,在一定的,PH,下,，蛋白质可解离的基团会带上电荷,影响蛋白质分子运动速度的因素,决定,运动方向,电场,作用,力,形成,阻力,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,3）,常用,电泳,方法,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,加入带负电荷多的,SDS,，形成,“,蛋白质,SDS,复合物,”,，使蛋白质,迁移速率仅取决于分子大小,。,由,弱酸,和相应的,强碱弱酸盐,溶解于,水,中。,如,H,2,CO,3,/NaHCO,3,，,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,等,缓冲溶液洗脱剂,1,） 作用：,2,）配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同,pH,的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液,pH,的干扰而保持,pH,稳定,从而维持蛋白质空间结构。,思考：如何配制不同,PH,值不同的缓冲液？,血液组成成分,阅读思考：,血液由,_,和,_,两部分组成。,血细胞中,_,细胞数量最多，细胞的含量最高的,有机,化合物是,_,。,该化合物是由,_,和,_,构成的，其中每个亚基中都含有一个能与,O,2,和,CO,2,结合的,_,基团。,血浆,血细胞,红细胞,血红蛋白,2,条,-,肽链,2,条,-,肽链,亚铁血红素,1.,洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的,目的,是什么？洗涤的,方法,是什么？,洗涤干净,的标志是什么？,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，,直至上清液没有黄色,其他血细胞,2.,释放血红蛋白,阅读思考：,释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？,为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：,蒸馏水,的作用是,_,。,加入,甲苯,的作用是,_,。,充分搅拌的目的是,_,。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？,滤纸,过滤,脂类物质,3.,分离血红蛋白,分离过程,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,烧杯,有机溶剂,血红蛋白,20mmol/L,磷酸缓冲液,4,、透析血红蛋白,透析的目的是什么？,1mL,1mL,1mL,去除血红蛋白中的小分子杂质,纯化方法本实验采用,凝胶色谱法,1.,凝胶色谱柱的制作：,2.,凝胶色谱柱的装填：,3.,样品的加入和洗脱,步骤,操作要求,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：,交联葡聚糖凝胶G-75,20mmol/L磷酸缓冲液,“,G,”,表示,什么？,75,代表什么？,2,、凝胶色谱柱的装填,3,、样品的加入和洗脱,1.,调液面,2.,加样,3.,再调液面,4.,洗脱,5.,收集,缓冲液,凝胶,注意事项,注意事项,1,、红细胞的洗涤：,洗涤次数不能过少；低速、短时离心。,2,、色谱柱的装填：,装完后，立即用缓冲液洗涤、平衡凝胶使,装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。,3,、,凝胶的预处理：,沸水浴时间短，还能除去微生物和气泡,4,、色谱柱成功标志：,红色区带均匀一致地移动。,否则容易使白细胞、血小板、淋巴细胞等,其他血细胞,同,红细胞,一块儿沉淀，而无法将红细胞分离！,纯度鉴定,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断纯化的蛋白质是否达到要求，需进行蛋白质纯度鉴定，使用最多的是,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,知识总结,血红蛋白的提取和分离,蛋白质分子的差异性,凝胶色谱法,原 理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组 成,作 用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度鉴定,
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