chapter 4 enzyme

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 4 Enzymes,酶的基本性质,酶的分类与命名,酶的反应动力学,酶作用的机理,酶活性调节,1,4.1,酶的基本性质,一、酶的概念及基本特征,酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。,Enzymes have four basic features 酶的三个基本特征,2,Powerful Catalytic power 强的催化力,Increase reaction rate up to 10,16,fold,Make reaction taken place under relatively mild conditions of temperature and pH,High specificity 高的特异性,To,the substrates,that they act on,and the products,they form,Enzyme activity can be regulated 酶活性可以被调控,3,二、,酶的化学本质,（一）大多数酶是蛋白质,1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出,脲酶,结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。,4,1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA,ribozyme,（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。,（二）核酶,核酶的,发现不仅表明酶不一定都是蛋白质， 还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。,5,（三）抗体酶,抗体是免疫球蛋白。具有酶催化活性的抗体称为,抗体酶,（,abzyme,）,6,三、酶的组成,1. 酶,单体酶,结合酶,（,全酶,）= 酶蛋白 + 辅因子,辅因子,辅酶,：与酶蛋白结合得,比较松,的,小分子,有机物,。,辅基,：与酶蛋白,共价结合,的辅酶或金属离子。,酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。,7,2.（几个术语）单体酶、寡聚酶和多酶复合物,Proteoenzyme蛋白酶Holoenzyme全酶,单体酶（monomeric enzyme),：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。,寡聚酶 (oligomeric enzyme),：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。,8,丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（E,）、硫辛酰转乙酰酶（E,）和二氢硫辛酰脱氢酶（E,）。,E,E,E,碱性,E,E,E,+,E,E,+,脲,多酶复合物 (multienzyme system),：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。,9,3. 活性部位和必需基团,必需基团,：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性部位,：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,10,4.2,酶的分类与命名,1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,1. 氧化还原酶类,：,主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。,A,H,2,+,B,（O,2,）,A + BH,2,（H,2,O,2,，H,2,O）,（1）脱氢酶类,：催化直接从底物上脱氢的反应,A,H,2,+,B,A +BH,2,（需辅酶或辅酶）,11,（2）氧化酶类,催化底物脱氢，氧化生成,H,2,O,2,：,AH,2,+ O,2,A +,H,2,O,2,（需FAD或FMN）,催化底物脱氢，氧化生成,H,2,O,：,2AH,2,+ O,2,2A + 2,H,2,O,（3）过氧化物酶,ROO + H,2,O,2,RO + H,2,O + O,2,（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）,O,2,+,OH,OH,C=O,C=O,OH,OH,（顺，顺-已二烯二酸）,12,R,H,+,O,2,+ 还原型辅助因子,R,O,H,+ H,2,O,+ 氧化型辅助因子,（又称,羟化酶,）,2. 转移酶类,：,催化化合物中某些基团的转移。,A,X,+ B,A +B,X,根据,X,分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。,3. 水解酶类,：,催化加水分解作用。,AB +,H,2,O,A,O,H,+ B,H,13,4. 裂解酶类：,催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。,CH,3,C,=O,C,OOH,CC,键,CH,3,C,=O,H,+,C,O,2,CO,键,C,H,2,COOH,H,OC,HCOOH,HCCOOH,HOOC,C,H,+,H,2,O,14,CN,键,COOH,C,H,N,H,2,C,H,2,COOH,COOH,C,H,HC,COOH,+,N,H,3,5. 异构酶,：催化 各种异构体之间的互变。,A,B,常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类,。,15,6. 合成酶类,：,催化有ATP参加的合成反应。,A + B + ATP,AB + ADP +Pi,乳酸脱氢酶,EC 1. 1. 1. 27,第1大类，氧化还原酶,第1亚类，氧化基团CHOH,第1亚亚类，H受体为NAD,+,该酶在亚亚类中的流水编号,16,Enzymes are classified into six classes based on the type of reaction catalyzed,Name,Type of reaction catalyzed,Example,Oxido-,reductases,Transfer of electrons,A,-,+ B,A + B,-,Alcohol dehydrogenase,Transfer-ases,Transfer of functional groups,A-B +C,A + B-C,Hexokinase,Hydrolases,Hydrolysis reactions,A-B + H,2,O,A-H + B-OH,Trypsin,Lyases,Cleavage of C-C, C-O, C-N etc., often forming a double bond,Pyruvate decarboxylase,Isomerases,Transfer of groups within a molecule,Maleate isomase,Ligases (or synthases),Bond formation coupled to ATP hydrolysis,Pyruvate carboxylase,A + B,A-B,X-A-B-Y, Y-,A-B-X,X-A-B-Y,A=B + Y-X,17,酶的命名有两种方法：,系统名,、,惯用名,。,系统名,：包括所有底物的名称和反应类型。,乳酸 + NAD,+,丙酮酸 + NADH + H,+,乳酸：NAD,+,氧化还原酶,惯用名,：只取一个较重要的底物名称和反应类型。,乳酸：NAD,+,氧化还原酶,乳酸脱氢酶,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,18,4.3,酶反应动力学,一、酶促反应动力学（单底物模型）,（一）米氏方程,（,Michaelis-Menten equation）,v,= ,V,max, ,S,k,m,+ ,S,19,20,21,（二） 米氏常数的意义及测定,v,= V,max,/2，,则：,k,m,= S,意义,：,1.,k,m,是酶的一个基本的特征常数,。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。,2. 从,k,m,可判断酶的专一性和天然底物,。,K,m,最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。,3. 当,k,1,k,2,时，,k,m,的大小可以表示酶与底物的亲和性,。,22,4. 从,k,m,的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度,。,S,v,1000,k,m,0.999V,100,k,m,0.99V,10,k,m,0.91V,3,k,m,0.75V,1,k,m,0.50V,0.33,k,m,0.25V,0.10,k,m,0.091V,23,从米氏方程中求得：,当反应速度达到最大反应速度的90%，则,90%V =100%VS/(,k,m,+S),v,= ,V,max, ,S,k,m,+ ,S,即 S = 9,k,m,在进行酶活力测定时，通常用,4,k,m,的底物浓度即可。,24,5.,k,m,还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径,。,丙酮酸,乳酸,乙酰CoA,乙醛,乳酸脱氢酶（1.710,-5,）,丙酮酸脱氢酶（1.310,-3,）,丙酮酸脱羧酶（1.010,-3,）,当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于,k,m,最小的酶。,25,（三）K,m,的求解,米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从,v,与S的关系曲线求得,V,，然后再从1/2,V,求得相应的S即为,k,m,（近似值）。,通常用,Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）,1,v,= ,k,m,V,m, ,S,1,+ ,V,m,1,（,y,= a,x,+ b）,斜率=,k,m,/,V,max,1/ S,1/,v,1/,V,max,-1/,k,m,26,（四）酶的活力,1. 酶活力,是指酶催化某一化学反应的能力（activity）,3. 在最适的反应条件（25）下,，,每分钟,内催化,一微摩尔,底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即,1IU=1mol/min,4. 在最适条件下,，,每秒钟,内使,一摩尔,底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即,1kat=1mol/s,1kat = 610,7,IU,2.,酶（活力）单位,：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）,27,5. 酶的纯度,：,比活力,= 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）,纯化倍数,= ,每次比活力,第一次比活力,产率%（回收率）,= 100,每次总活力,第一次总活力,酶的纯化鉴定,：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法,28,（五）转换数（Turnover number）,K,cat,的定义为：当酶被底物饱和时，每分子的酶在单位时间内催化底物分子转变成产物的数量。 K,cat,V,max,/E,t,代表酶的动力学效应,29,（六） Kcat/Km,Kcat:反映的是一种酶被底物饱和时的酶性质。,在低S下,， Kcat则失去了意义。,当skm，,Kcat/Km,是一个比较酶催化效率较好的一个动力学参数，是一个二级速率常数，有一个上限（扩散控制限制）：108109 molL-1S-1。,30,（七）pH对酶活性的影响,pH,v,最适pH,（ pH optimum ）,1.,最适pH,：表现出酶最大活力的pH值,2.pH稳定性：在一定的pH范围内酶是稳定的,pH对酶作用的影响机制,：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。,31,Effect of pH,Pepsin,胃蛋白酶,Papain木瓜蛋白酶,Trypsin,胰蛋白酶,Cholinesterase,胆碱酯酶,过氧化氢酶,32,（八）温度对酶作用的影响,两种不同影响：,1.温度升高，反应速度加快,；,2.温度升高，热变性速度加快,。,T,v,最适温度,33,Effect of temperature,50,C, decrease due to denaturation of enzyme,B,A,Typically,34,二、多底物酶促动力学（只作了解）,双底物反应：A+B P+Q,两种可能的反应机制：,（一）顺次反应（Sequential reaction）,1.有序顺次反应（Ordered reaction）,2. 随机顺次反应（Random reaction）,（二）乒乓反应（Ping Pong reaction）,35,4.4,酶的抑制作用,能同酶结合，阻止ES复合物的形成或阻止ES复合物转变成EP反应的化合物（Inhibitor）。,一、可逆抑制作用,：抑制剂与酶的结合都是非共价的，是可逆的；可以通过透析或凝胶过滤层析将可逆抑制剂去掉。,有三种类型的可逆抑制剂,竞争性抑制剂（,Competitive inhibitor,）,：,只同,自由酶,结合，是底物类似物。,36,竞争性抑制剂对酶动力学影响：,K,m,增大,V,max,不变,37,2. 反竞争性抑制剂（Uncompetitive inhibitor）,：只能同ES结合，出现在多底物反应中，结构上同底物不类似。,反竞争性抑制剂对酶动力学影响：,K,m,和V,max,降低， K,m,/V,max,比值不变。,38,3. 非竞争性抑制剂（Noncompetitive inhibitor）,：既能同自由酶结合又能同ES结合，结构上同底物不相似。,39,有两种类型：,（1）纯粹非竞争性抑制剂,：抑制剂同E和ES具有相同的亲和力（,K,i,= K,i,/,），,V,max,降低,，但,K,m,不变,。,40,（2）混合非竞争性抑制作用：,抑制剂同E和ES亲和力不相等时，,V,max,降低,，但,K,m,的变化决定于,K,i,和K,i,/,之间的大小：,K,i, K,i,/,时，K,m,减小,42,二、可逆抑制剂在酶学研究及临床上的应用,酶活性部位研究,：,乙酰胆碱酯酶的活性部位有两个：,底物结合部位,（阴离子结合部位）和,催化部位,（酯部位）。,2.,新药物的研制,：两个要求,（,1,）生物相容性；,（,2,）选择性毒性：,HIV,的逆转录酶的专一性抑制剂,AZT(3,/,-,叠氮,-2,/, 3,/,-,脱氧胸嘧啶核苷,),43,三、不可逆抑制剂与酶共价结合,不可逆抑制剂：与酶的某些基团,共价结合,，不能与酶自行分解，,使酶失活,。,动力学：,与非竞争可逆抑制作用类似,，因为都是使酶活性丧失，但有区别：,1.,酶活性随时间减少,；而非竞争可逆抑制作用，可达到,稳态水平,2.,不能通过透析或稀释使EI解离，酶活性恢复,。,应用：对于酶活性部位的组成，如必须基团的确定，不可逆抑制剂是一种很好的研究手段。,44,4.5,酶的作用机制,Two questions,：,1. How can enzymes be so specific ？,2. Where is the lowered part of the free energy of activation,(,G),？,45,两个基本原理：,1. 酶的催化效率最终来自酶与底物之间弱的相互作用所释放的自由能；,2. 酶的活性部位与,反应转换态,互补。,46,一、酶的底物专一性,酶作用的专一性,几何专一性（结构专一性）,立体异构专一性,族（基团）专一性,绝对专一性,47,族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。,R,COO,-,+,R,OH + H,+,酯酶,：,R,CO,R,+ H,2,O,O,O,CH,2,OH,OH,OH,OH,1,5,-葡萄糖苷酶,O,R,+H,2,O,O,CH,2,OH,OH,OH,OH,OH,1,5,+,R,OH,绝对专一性：只能作用于某一底物。,脲酶,：H,2,NCNH,2,+ H,2,O,O,2NH,3,+ CO,2,48,二、酶的作用机理,（一）酶的催化作用与分子活化能,化学反应自由能方程式,G,=,H,-,TS,（,G,是总自由能的变化，,H,是总热能的变化，,S,是熵的变化）,当,G,0，反应不能自发进行。,当,G,0，反应能自发进行。,活化能,：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。,49,50,51,促使化学反应进行的途径：,用加热或光照给反应体系提供能量。,使用催化剂降低反应活化能。,52,酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。,53,（二）中间产物学说,E +,S,ES,E +,P,中间产物存在的证据：1.同位素,32,P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。,54,55,（三）分子识别,“锁-钥”模型,：,Loch and key hypothesis by Emil Fischer，1894,“诱导契合”模型,（Koshland，1958）：,Induced Fit Hypothesis,56,The induced fit model (ex. of hexokinase),Before glucose binding,After glucose binding,57,Question:,Please compare the difference in mechanism of specificity among the serine proteases trypsin, chymotrypsin and elastase.,58,（四）酶使转换态稳定,Induced Fit favors formation of the transition-state intermediate.,所涉及到的弱相互作用力：,静电作用、氢鍵、疏水作用和范德华力。,在,非极性环境,中，,静电相互作用,比在水中,强,。,59,（五）使酶具有高催化效率的因素,邻近效应（,Proximity effect,）,：,Proximity,Orientation,60,2. Acid-Base Catalysis,：通过向反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）夺取质子来达到加速反应的一类催化。（广义酸碱催化，,Bronsted,的酸碱定义）,蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有,氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基,。,影响酸碱催化反应速度的两种因素：,（,1,）酸或碱的强度（,pK,）；（,2,）,质子传递的速度。,His,的,咪唑基,最活跃,。,广义酸碱催化：使反应速率提高,10,100,倍。,61,3. Covalent Catalysis,：底物分子与酶分子上的活性基团间,瞬间共价结合,而形成中间物，快速完成反应。,共价催化又称亲核或亲电子催化。实际上也是酸碱催化。,Ser-OH,CH,2,S, ,：,H,CH,2,O, ,：,H,Cys-SH,CH,2,C=CH,HN,N,CH,：,His-咪唑基,亲核物质,亲电物质,62,4. Metal Ion Catalysis,几乎1/3的酶催化活性需要金属离子。,金属离子主要以,三种方式,参与催化过程：,与底物结合，,定向底物，,便于反应；,通过金属离子氧化态的变化介导,氧化还原反应,，如,Fe,2+,与,Fe,3+,等；,静电,稳定或者掩盖电荷,。,63,（六）酶作用机制举例,溶菌酶：活性部位在酶分子一个狭长的缝隙中，与底物有,六个结合位点,：,A,、,B,、,C,、,D,、,E,和,F,。,催化反应涉及到：,酶与底物结合,、,Glu35,广义酸催化,、,张力的产生及,D,糖环的变形,、,Asp52,对正碳离子的静电稳定,（转换态的稳定）。,丝氨酸蛋白酶：催化三联体（,His57,、,Asp102,和,Ser195,）。,趋异进化,（,Divergent evolution,）,和,趋同进化,（,Convergent evolution,）,天冬氨酸蛋白酶：中间物分离的尝试至今未成功。酶活性对,pH,要求：通常,酸性,pH,。,64,4.6,酶的活性调节,（一）酶原的激活,没有活性的酶的前体称为,酶原,。酶原转变成有活性的酶的过程称为,酶原的激活,。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。,在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。,65,（二）同工酶(Isoenzyme),能催化,相同的化学反应,，但在,蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能,等方面都存在明显差异的一组酶。（来源不同）,乳酸脱氢酶（LDH）,M,H,M,M,M,M,M,4,H,M,M,M,M,3,H,M,M,H,H,M,2,H,2,M,H,H,H,MH,3,H,H,H,H,H,4,66,（三）别构酶（Allosteric enzyme）,有些酶具有,活性中心和别构中心,，当调节物与别构中心结合时，酶的构象发生改变，导致酶的催化活性发生改变。这类酶称为,别构酶,。,特点,：1.一般是寡聚酶，四级结构；,2.具有别构效应；,3.,v,对S不呈双曲线，呈S型。,S,v,67,别构效应（Allosteric effect）,：调节物与别构酶的调节部位结合，,诱导酶构象发生改变,，使酶活性部位与底物结合受到影响，从而调节反应速率的代谢过程。这种效应叫做别构或变构效应。,调节物：,负调节物（,Negative,effector,）：,结合到别构部位，关闭酶的活性；,正调节物（,Positive,effector,）：,结合到别构部位，激活酶活性。,68,（四）共价修饰,主要类型：,Ser、Thr或Tyr,侧链（,OH,）的磷酸化和去磷酸化来调节酶活性,注意：,磷酸化调节酶活性,可以是,激活,，也可以是,关闭酶活性,，如,糖原磷酸化酶,磷酸化后，酶从T态转变成R态（无活性到有活性）；,丙酮酸脱氢酶,磷酸化后则失去活性。,69,（五）多酶复合物和多功能酶,多酶复合物,：在第一节已经介绍过。优越性：一个反应的产物直接转移到下一个酶的活性中心，减少了转移时间，增高中间物的局部浓度，使整个代谢加速；,多功能酶,（Multifunctional enzyme）：指一个蛋白质分子具有多种催化功能的酶。合成代谢中催化顺序反应的酶融合在一起，形成一个蛋白质分子，使合成协调一致，且比多酶复合体更稳定。,70,本章重点,酶的基本性质及化学本质；,酶的分类及命名：,酶促反应动力学（单底物模型），米氏常数（,K,m,）,的意义以及影响酶活性的因素；,酶的抑制剂类型；,酶的作用机制：,酶活性的调节：酶原激活、别构酶、同工酶、多酶复合物和多功能酶、共价修饰。,71,