资源描述
,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,红细胞膜蛋白提取鉴定,内容,1. 红细胞膜提取,2. 膜蛋白提取及定量测定(Lowry法),3.膜蛋白电泳分离、分子量测定,SDS-PAGE,4.western blotting 鉴定,-actin,实验报告要求,:,分别按上各点,写出:原理,操作步骤,结果,讨论,结论,手写,A4 纸大小 ,报告首页写明 实验者,专业。,红细胞膜蛋白提取鉴定内容实验报告要求:,1,实验分组,每个班分三大组,每组十人左右,选出组长,实验进行一大组为单位,1.纯化RBC膜,2.SDS-PAGE 2块胶(一个凝胶架),3.western blot,4.3-4 人一小组测定蛋白质含量,实验分组每个班分三大组,每组十人左右,选出组长,2,一.红细胞膜提取制备(低渗法,),原理:,RBC置低渗缓冲液(pH7.4),破裂溶血,溶血液。,溶血液置高速离心作用中,去除溶液中Hb和其它内含物,制得纯净的RBC膜称为血影,“ghost”,一.红细胞膜提取制备(低渗法)原理:,3,注意事项:,1.离心步骤一定要“平衡、对称放置”,2.溶血液离心后上清吸取小心,以免丢失“膜”,3. 缓冲液pH7.4,偏酸使Hb残留增加,4.此分离方法适合于人、大鼠;牛、猪等易使脂蛋白脱落,1mMCaCl,2,可防止此种膜的不稳定性。,5.本实验因条件限制,在常温离心。如需保持蛋白活性,应在4C离心。,注意事项:1.离心步骤一定要“平衡、对称放置”,4,(,1)RBC分离:,15 ml RBC液,2000rpm 5分钟,RBC(沉淀)3倍体积,等渗,磷酸Buffer,2000rpm 5分钟2,洗净之,RBC,(2)溶血液制备,RBC,加入,低渗,磷酸buffer(1:50),(在 烧杯中) 稍搅拌,置冰箱冻格(4,C)溶血过夜,(以上步骤已完成!),溶血液,用“水泵”吸去上清。 !:膜很轻,(1)RBC分离:溶血液,用“水泵”吸去上清。 !:膜很,5,二、 RBC膜纯化(洗涤),RBC膜转至 1.5ml塑料管(2个/大组),9000rpm 5,沉淀(膜),低渗,磷酸Buffer(pH7.4) ?ml (吹打),9000rpm 54,沉淀 ,等渗,磷酸Buffer 1ml,9000rpm 5分钟,沉淀(RBC膜)0.6ml等渗Buffer,(即为RBC原液),二、 RBC膜纯化(洗涤),6,三、 样品处理:,1.SDS-PAGE用样品处理(一大组):,0.3ml,RBC原液,+0.3ml 样品溶解液,沸水浴 5,2.Lowry法测定用样品处理,(3-4 人/group),:,A,. 取0.3ml,RBC原液, 1.5ml H2O 150ul NaOH,沸水浴 5,待测管1:,取,A,液0.1ml0.9ml H2O,待测管2:,取,A,液0.3ml0.7ml H2O,三、 样品处理:,7,四、Lowry法测定膜蛋白含量,立即摇匀,放置15分钟。以第管为空白管,在分光光度计上以620,比色,读取。,以各管标准蛋白浓度为横座标,各管吸光度值为纵座标作图,画出标准曲线。,2.红细胞膜样品蛋白含量的测定,将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂,一同测定,管号,试剂,H2O (ml),0.9,0.8,0.6,0.4,0.2,1.0,标准蛋白,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,_,碱性铜试剂,摇匀,放置分钟,酚试剂,含标准蛋白ug,25,50,100,150,200,0,1.标准曲线制备,四、Lowry法测定膜蛋白含量立即摇匀,放置15分钟。以第,8,作图,:,横坐标以标准蛋白含量,纵坐标以A620吸光度值,图比例应为3:2(横:纵),计算:,在标准曲线上查出待测样品的浓度,计算,提取膜的 Pr mg数/ml样品,注意稀释倍数,要求,:,计算原提取RBC液的Pr含量,作图:,9,五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量,不连续电泳系统,:,电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同(浓缩效应),五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量 不连续电泳系统,10,(一)垂直板安装,每套板两块玻璃下端对齐,夹好,放在胶架上!,(二)凝胶制备(见表),先配好分离胶(留距齿梳1cm),待其凝固后,再配浓缩胶。,(三)电泳装置安装,先装内槽,试无渗漏;,放入外槽中,加Buffer。,上样品: 每孔18ul,2块/组,每块板留一,标准蛋白孔,(四) 电泳:,100V进分离胶调至80V,约1.5小时,10分离胶,10 ml,5浓缩胶 5ml,30凝胶储备液,3.3,1.0,蒸馏水,4.0,4.0,1.5mol/L Tris-HCl Buffer,2.5,1mol/L Tris-HCl Buffer,1.0,10SDS,0.1,0.08,10 过硫酸铵,0.06(60ul),0.06(60ul),TEMED,8ul,8ul,加入过硫酸铵,TEMED即刻灌胶。,(一)垂直板安装10分离胶5浓缩胶 5ml30凝胶储备,11,(五)取胶:,用专用板平面轻轻“橇”开板,推入小平皿中。,注意: 一块半干转移(浸入转移Buffer20min),另一块考马斯亮蓝染色,染色2小时后,7%醋酸脱色(4),每组做好标记(写好名字),交生化室扫描或摄像保留。,(五)取胶:,12,分子量计算,1.,测量: cm,a.每条带距离,(起始点至带中心),b,.,起始至示踪染料距离,2. MR: 条带距离(a),MR=,起始至示踪染料距离,(b),a,b,14,100,62,40,30,24,分子量计算1.测量: cmab1410062403024,13,分子量,KD,迁移距离cm,MR,70,55,40,35,25,15,预染标准蛋白,分子量迁移距离cmMR705540352515预染标准蛋白,14,3.半对数图:(六条标准蛋白),(,参照统计学散点法),横坐标,为迁移率MR,纵坐标,为LogM,(直接按每一蛋白分子量标在半对数图中),4.计算待测样品蛋白质分子量:,选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带,测量距离计算MR,Mw,3.半对数图:(六条标准蛋白),15,9,8,7,6,5,4,3,2,1,0.1 0.2 0.3 0.4.,横坐标为迁移率MR;(六条标准蛋白),纵坐标为LogM(直接按每一标准蛋白分子量),20,60,100,90.1 0.2,16,六、western blotting(-actin鉴定),1.转膜,将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的NC膜、滤纸均浸入转移Buffer中20分钟,取出,在半干转移槽中按以下顺序放置:,(上),阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端(下),用玻棒滚动去除空气气泡,盖好上盖。,开启电源,调电压时间20 v, 20分钟,2.封闭,将膜取出TBST中洗5,放置于封闭液中10分钟,用TBST洗53;,3.一抗孵育,将膜放入已放一抗溶液塑料袋中,室温孵育 1小时,用TBST洗5分钟3;,4.二抗孵育,将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中,室温孵育 1小时,用TBST洗5分钟3;,5.DAB显色,配制DAB显色液 1 ml(适量),取出膜放入DAB溶液中,显色(约10分钟内); (试剂盒:蒸馏水1ml ,A、B、C各一滴放入水中),6.结果扫描保存,六、western blotting(-actin鉴定)1,17,银 染,考马斯亮蓝染色,银 染考马斯亮蓝染色,18,红细胞膜蛋白提取流程课件,19,
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