基因诊断治疗课件

基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗（Gene diagnosis and Gene Therapy）1基因诊断和基因治疗（Genediagnosisan基因诊断基因诊断2基因诊断2概述概述 几乎所有的几乎所有的疾病疾病均在一定程度上均在一定程度上与基因与基因有某种有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基检测基因的改变因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。3概述几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系基因诊断主要内容基因诊断主要内容一、基因诊断概念一、基因诊断概念二、基因诊断常用技术二、基因诊断常用技术三、基因诊断策略三、基因诊断策略四、基因诊断在临床的应用四、基因诊断在临床的应用1.在遗传性疾病诊断中的应用在遗传性疾病诊断中的应用2.在传染性疾病诊断中的应用在传染性疾病诊断中的应用3.在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用4.在法医学上的应用在法医学上的应用五、基因诊断存在的问题和发展前景五、基因诊断存在的问题和发展前景4基因诊断主要内容一、基因诊断概基因诊断的出现：基因诊断的出现：1976年加州大学华裔科学家年加州大学华裔科学家KanYW用核酸分子杂交首次对一例用核酸分子杂交首次对一例珠蛋白生成障碍性贫血进行珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断。诊断。5基因诊断的出现：5狭义狭义:在基因（在基因（DNADNA或或RNARNA)水平，用水平，用PCRPCR、核酸杂、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态存在与否、结构变异和表达状态的的过程，对疾病作出诊断。过程，对疾病作出诊断。基因诊断的概念基因诊断的概念6狭义:在基因（DNA或RNA)水平核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术PCR及其衍生技术及其衍生技术限制性酶谱分析限制性酶谱分析限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交DNA芯片技术芯片技术DNA测序技术测序技术二、基因诊断中常用的几种技术二、基因诊断中常用的几种技术7核酸分子杂交技术二、基因诊断中常用的几种技术7(一一)核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术(1)(1)方法方法:以已知顺序核酸片段作为以已知顺序核酸片段作为探针探针,经放射性或非放射性物质经放射性或非放射性物质标记标记后后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交分离已杂交和未杂交的标记核酸链和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测通过标记信号的检测就可以对未知就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析的目的核酸链进行定性、定量分析.8(一)核酸分子杂交技术(1)方法:8(2)2)几种不同形式的核酸分子杂交几种不同形式的核酸分子杂交 a.Southern印迹(southern blot)杂交:用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b.Northern印迹(Northern blot)杂交:用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析 c.斑点杂交（dot blot):既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低 d.原位杂交（in situ hybridization):是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断 分类:玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片.膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜)9(2)几种不同形式的核酸分子杂交9原原位位杂杂交交的的镜镜像像图图10原位杂交的镜像图10(二)PCR技术在基因诊断中的应用（）等位基因特异性寡聚核苷酸（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是该方法是诊断已知点的突变：诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用诊断时，只需用PCRPCR扩增受检者目的扩增受检者目的DNADNA片段，再分别与上述探针杂交片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况：杂交的结果有如下几种情况：PCR PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交不存在这种突变；不存在这种突变；只与突变探针杂交只与突变探针杂交-突变基因为纯合子；突变基因为纯合子；与正常探针和突变探针都可杂交与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子；突变基因为杂合子；与正常探针和突变探针都不能杂交与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发现的类型突变基因不属于已发现的类型11(二)PCR技术在基因诊断中的应用（）等位基因特异性寡聚核ASO探针杂交检测已知点突变受检者受检者基因组基因组DNA或含或含突变位点的突变位点的PCR扩增产物扩增产物与标记的与标记的ASO探针杂交探针杂交ASO1ASO2NormalHeteroHomo12ASO探针杂交检测已知点突变受检者基因组DNA或含ASO1A（）（）PCR-PCR-单链构象多态性（单链构象多态性（PCR single strand PCR single strand conformation ploymorphism,PCR-SSCP)conformation ploymorphism,PCR-SSCP)分析分析 是一种基于单链是一种基于单链DNADNA构象差别来检测点突变的方法构象差别来检测点突变的方法DNADNA变性变性形形成单链，在中性条件下长度相同的单链成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,DNA,如果碱基组成和如果碱基组成和(或或)排列顺序不同排列顺序不同,形成的构象就不同形成的构象就不同,这样就形成了单链构象多态性这样就形成了单链构象多态性.这些分子在这些分子在非变性非变性PAGEPAGE电泳电泳中表现出不同的迁移率中表现出不同的迁移率.SSCPSSCP特别适于分析小于特别适于分析小于400400bp bp 的的 PCRPCR产物。据认为产物。据认为SSCPSSCP可以区可以区分分1 1bpbp的差异的差异PCR-SSCPPCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行后还需进行测序测序分析，确定变异性质分析，确定变异性质13（）PCR-单链构象多态性（PCRsinglestraPCR-SSCP分析原理示意分析原理示意14PCR-SSCP分析原理示意14(3)PCR-(3)PCR-限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（PCR restriction PCR restriction fragment length polymorphisms,PCR-RFLPfragment length polymorphisms,PCR-RFLP）分析分析 基因突变导致的基因碱基组成或基因突变导致的基因碱基组成或(和和)顺序发顺序发生改变生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失位点或使原有的位点消失.用用限制酶限制酶对不同个对不同个体基因组进行消化时，其体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大电泳条带的数目和大小小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在变是否存在.15(3)PCR-限制性片段长度多态性（PCRrestric 限制性片段限制性片段长度多度多态性性 RFLPs(restriction fragment length polymorphisms)样品一样品二19871987年年,H.Donis-Keller等人以等人以RFLPRFLP为遗为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱传标记绘制了第一张人类遗传图谱16限制性片段长度多态性样品一样品二1987年,H.Don(4)PCR-(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术变性梯度凝胶电泳分析技术 双链双链DNADNA在一定浓度变性剂在一定浓度变性剂(尿素尿素,甲酰胺甲酰胺)作用下作用下,会变性而解链会变性而解链,导致导致DNADNA分子电泳迁移率变化分子电泳迁移率变化.当在不当在不同梯度浓度变性胶中电泳时同梯度浓度变性胶中电泳时,DNADNA泳动到变性剂浓度泳动到变性剂浓度能使能使DNADNA发生变性，发生变性，DNADNA开始解链，从而不同的开始解链，从而不同的DNADNA片片段会形成不同的迁移率条带段会形成不同的迁移率条带优点优点：可靠，检出单碱基突变率可达：可靠，检出单碱基突变率可达缺点缺点：富含高熔点：富含高熔点GCGC区时，则难以检测出突变区时，则难以检测出突变17(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术双链DNA在一定变性梯度凝胶电泳图变性梯度凝胶电泳图18变性梯度凝胶电泳图18荧光定量荧光定量PCR(FQ-PCR)PCR(FQ-PCR)技术技术 是一种目前国内外应用较为广泛的定量是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCRPCR技术技术,是通过始点定量和是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高具有灵敏度高,特异性强特异性强等优点等优点.FQ-PCR FQ-PCR技术的两种定量形式技术的两种定量形式:绝对定量绝对定量:一般采用一般采用外标准品外标准品定量的制备来实现绝对定量定量的制备来实现绝对定量.如合成目的如合成目的基因基因;将将PCRPCR产物直接梯度稀释产物直接梯度稀释;或将或将PCRPCR产物克隆到载体上产物克隆到载体上,抽取质粒抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点优点:稳定稳定,准确准确.相对定量相对定量:指在测定目的基因的同时测定一指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因内源性管家基因(如如-actin,rRNAactin,rRNA等等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反映反应体系内是否存在反应体系内是否存在PCRPCR扩增的影响因素扩增的影响因素.(6)定量定量PCR(quantiativePCR,Q-PCR)19荧光定量PCR(FQ-PCR)技术(6)定量PCR(quan(7 7）DNADNA序列测序序列测序1.1.19771977年年SangerSanger创建的链终止反应序列测序法创建的链终止反应序列测序法 用放射性同位素标记引物，用用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸随机终随机终止止DNADNA链的延伸，产生长度不同的链的延伸，产生长度不同的DNADNA片段，再用聚丙烯片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。20(7）DNA序列测序1.1977年Sanger创建的链终止反21212.2.自动测序法自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。DNA DNA 测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质222.自动测序法22（8 8）DNADNA芯片技术芯片技术 DNA DNA芯片（芯片（DNA chip)DNA chip)又称为基因芯片，又称为基因芯片，DNADNA微阵列（微阵列（DNA DNA microarray)microarray)该技术的基础仍然是利用该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交核酸分子杂交原理：首先将一系列原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（预先设计好的核酸探针（oligos or cDNA)oligos or cDNA)有序地，高密度地排有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNADNA微阵列。微阵列。用用荧光标记待测样品荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。因序列信息或表达信息。23（8）DNA芯片技术DNA芯片（DNAchip)又称为基基因芯片技术基因芯片技术24基因芯片技术24 基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。传制图等。25基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯基基因因表表达达的的分分析析26基因表达的分析26三、遗传病的基因诊断一.遗传病基因诊断的策略1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆.2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断.27三、遗传病的基因诊断一.遗传病基因诊断的策略27二、人类基因组上的二、人类基因组上的DNADNA遗传标记遗传标记1980限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLPs)1985短串联重复序列短串联重复序列(short tendem repeats,STRs,mini-satellites)1990s单核苷酸多态性单核苷酸多态性(single-nucleotide polymor-phisms SNPs)28二、人类基因组上的DNA遗传标记限制性片段长度多态性(RF短串短串联重复序列重复序列STRs (short tendem repeats,Microsatellites)STRSTR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%5%，基本单位是，基本单位是1bp-8bp1bp-8bp的的串联串联重复，重复次数重复，重复次数 n=15-60n=15-60，已知，已知80008000多个多个主要形式为：主要形式为：(CA)(CA)n n，(GA)(GA)n n，(AA)(AA)n n，(GG)(GG)n n，(CAA)(CAA)n n，(CGG)(CGG)n n，其中以其中以 (CA)(CA)n n，(GT)(GT)n n 为多见。为多见。19921992年，年，WelssenbanchWelssenbanch等以等以STRSTR为标记的第二代连锁图取代了为标记的第二代连锁图取代了RFLPRFLP连锁图连锁图。29短串联重复序列STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNADNA序列多态性。与序列多态性。与RFLPRFLP与与STRSTR不同不同,它是直接以它是直接以序列的变异序列的变异作为标记作为标记,而不是以而不是以片段的长度差异片段的长度差异作为标记作为标记.人类基因组图谱的初步分析表明，共有人类基因组图谱的初步分析表明，共有3 3万至万至3.53.5万个基因。万个基因。有有300300多万个单核苷酸多态性多万个单核苷酸多态性,SNP,SNP在人类基因组中广泛存在，平在人类基因组中广泛存在，平均每均每50050010001000个碱基对中就有个碱基对中就有1 1个，个，3-43-4个相邻的标记构成的单个相邻的标记构成的单倍型（倍型（haplotypehaplotype）就可有）就可有8-168-16种。种。19961996年，年，LanderLander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。传连锁图的遗传标记。单核苷酸多核苷酸多态性性（single nucleotid polymorphism，SNP）30主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNASNPSNP用作用作遗传标记具有以下具有以下优点：点：SNP SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。频率都可估计出来。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。与串联重复的微卫星位点与串联重复的微卫星位点(STR)(STR)相比，相比，SNPSNP是高度稳定的是高度稳定的.尤其尤其是处于编码区的是处于编码区的SNP(cSNP),SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。群的遗传分析出现困难。部分位于基因内部的部分位于基因内部的SNPSNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。选改变位点。易于进行自动化分析，缩短了研究时间易于进行自动化分析，缩短了研究时间 .31SNP用作遗传标记具有以下优点：SNP在人群中是二等位四、基因诊断技术在临床的应用四、基因诊断技术在临床的应用3232四、基因诊断技术在临床的应用3232血红蛋白病的基因诊断血红蛋白病的基因诊断 分为异常血红蛋白病和地中海贫血分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，后者是由于珠蛋白合成速率降低，a a链和链和b b链合成不平衡。链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基因诊断：（一）异常血红蛋白病的基因诊断：如镰状红细胞贫血病如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸链第六位氨基酸:GAA(:GAA(谷谷)GUA()GUA(缬缬)代替代替.对该病的基因诊断应采用对该病的基因诊断应采用:1)PCR-1)PCR-限制酶切限制酶切,即用即用PCRPCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段片段,再选适当的内切酶消化再选适当的内切酶消化PCRPCR产物产物,根据电泳图谱上片段数量和大根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断小做出判断 2)Southern 2)Southern 印迹杂交分析印迹杂交分析33血红蛋白病的基因诊断分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是HbA、HbS和和HbC的密码子及蛋白质区别的密码子及蛋白质区别珠蛋白基因的第珠蛋白基因的第6位密码子有三种形式：正常红细胞的基因位密码子有三种形式：正常红细胞的基因A、镰、镰状红细胞的基因状红细胞的基因S和另一种相对常见的血红蛋白和另一种相对常见的血红蛋白C的基因的基因C。34HbA、HbS和HbC的密码子及蛋白质区别珠蛋白基因的设计一对引物进行设计一对引物进行PCR扩增，扩增序列中必须包括第扩增，扩增序列中必须包括第5、6、7密码子，扩增后用密码子，扩增后用Mst限制性内切酶限制性内切酶对扩增产物进行水对扩增产物进行水解，通过对水解片段的解，通过对水解片段的电泳分析电泳分析或进行或进行Southern杂交分杂交分析析可以做出正确的诊断。可以做出正确的诊断。限制性内切酶限制性内切酶Mst识别序列为识别序列为CCTNAGG，N可以是任可以是任意核苷酸。因此意核苷酸。因此珠蛋白基因的第珠蛋白基因的第5、6密码子和第密码子和第7密码子密码子的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。但是在的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。但是在发生发生镰状突变后该酶切位点消失镰状突变后该酶切位点消失。35设计一对引物进行PCR扩增，扩增序列中必须包括第5、6、7密Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析36Mst酶切位点(GCTNAGG)53正常基因53+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者酶切产物电泳分析酶切产物电泳分析37+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者酶酶切产物酶切产物Southern印迹杂交分析印迹杂交分析用寡核苷酸用寡核苷酸探针探针和和PCRPCR产物产物进行杂交检测点突变进行杂交检测点突变被检靶片段经被检靶片段经PCRPCR扩增、酶切，并经电泳分离后转移扩增、酶切，并经电泳分离后转移到膜上，与经标记寡核苷酸探针杂交到膜上，与经标记寡核苷酸探针杂交探针为探针为珠蛋白基因珠蛋白基因5端的基因片断端的基因片断38酶切产物Southern印迹杂交分析用寡核苷酸探针和PCR产图示图示珠蛋白基因纯合子珠蛋白基因纯合子A（AA）、纯合子）、纯合子S(SS)和杂合子和杂合子AS个体的个体的DNA杂交结果杂交结果39图示珠蛋白基因纯合子A（AA）、纯合子S(SS)和杂合子APCRPCR产物仅与完全互补的探针进行杂交产物仅与完全互补的探针进行杂交含含突变序列突变序列的产物仅与的产物仅与突变探针突变探针杂交杂交PCRPCR产物分别与经标记的产物分别与经标记的野生型和突变型野生型和突变型靶基因序列的寡核靶基因序列的寡核苷酸探针杂交，根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否苷酸探针杂交，根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点带有突变点40PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交40b-b-珠蛋白基因珠蛋白基因点突变点突变GAG(Glu)-GTG(Val)bA bA probeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC b bSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCHeterobA bA probeb bS probeHomoNormal41HeterobAprobebSprobeHomoNorm（二）（二）地贫的基因诊断：地贫的基因诊断：1 1.定性分析定性分析：PCRPCR法直接扩增法直接扩增11和和22，基因，基因的的33端有差别，针对此可设计引物进行端有差别，针对此可设计引物进行PCRPCR，如有缺失，则不能扩增出产物。如有缺失，则不能扩增出产物。2 2.定量分析定量分析:地贫的共同特点是地贫的共同特点是珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA的量减少，因此可用的量减少，因此可用RT-PCRRT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊断。的量以助诊断。42（二）地贫的基因诊断：42重型重型重型重型 地贫地贫地贫地贫:胎儿水肿综胎儿水肿综胎儿水肿综胎儿水肿综合征合征合征合征 早产死胎或出生早产死胎或出生早产死胎或出生早产死胎或出生前后死亡前后死亡前后死亡前后死亡 可导致严重产科可导致严重产科可导致严重产科可导致严重产科并发症并发症并发症并发症 无理想治疗方法无理想治疗方法无理想治疗方法无理想治疗方法43重型地贫:胎儿水肿综合征43基因不同程度的基因不同程度的缺失引起不同类型缺失引起不同类型的的地贫，地贫，基因基因缺失缺失1 14 4个。正常个。正常GeneGene组用组用BamHIBamHI切割，切割，可得到可得到14kb14kb的片段，的片段，而缺失一个而缺失一个 Gene Gene时可得到时可得到10kb10kb片段片段。BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe地贫的地贫的GeneGene诊断诊断44BamHIBamHI21210kb14kbpro以以GeneGene为探针，为探针，Southern blot Southern blot 方法检测方法检测/-/-/-/-正常正常缺缺1缺缺2缺缺3缺缺414kb10kb45以Gene为探针，Southernblot方法检测 （三）三）-地贫的基因诊断地贫的基因诊断 1 1.DNA.DNA检测与分析检测与分析 ：PCR-ASO PCR-ASO 探针法为主要方法：根据探针法为主要方法：根据 -珠蛋白主要突变位珠蛋白主要突变位点，设计点，设计2 2对引物，扩增可能发生突变的对引物，扩增可能发生突变的2 2个片段个片段,再分别与相应再分别与相应野生型探针和突变探针进行斑点杂交。野生型探针和突变探针进行斑点杂交。PCR-RFLP PCR-RFLP连锁分析法：检测与连锁分析法：检测与-珠蛋白基因连锁的遗传标珠蛋白基因连锁的遗传标记进行基因诊断记进行基因诊断,如如-珠蛋白珠蛋白55端有一限制内切酶端有一限制内切酶HgiAIHgiAI的多的多态性位点态性位点,在中国人群的频率为在中国人群的频率为0.5 0.5 DNA DNA芯片技术芯片技术 2 2.RNA.RNA检测与分析：检测与分析：RT-PCRRT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊断的量以助诊断46（三）-地贫的基因诊断46杜氏肌营养不良症的基因诊断杜氏肌营养不良症的基因诊断(Duchenne muscular dystrophy,DMD)DMDDMD：是性连锁隐性遗传病是性连锁隐性遗传病,是由是由抗肌萎缩蛋白抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变基因突变(突变或缺失突变或缺失)。其突出其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。DMDDMD患儿在患儿在5 5岁前发病，岁前发病，2020岁左右由于心力衰竭岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500 1/3500。47杜氏肌营养不良症的基因诊断(DuchennemusculDMDDMD是一种严重致死性疾病（是一种严重致死性疾病（XRXR），临床症状表现肌），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。肉进行性萎缩和乏力。BMDBMD临床症状与临床症状与DMDDMD相似，但症相似，但症状较轻。状较轻。Gene Gene 定位定位Xp21 Xp21，Gene 2300kb,79 Gene 2300kb,79 个个Exon Exon，cDNAcDNA全长全长13974bp 13974bp 编码编码3685 Aa3685 Aa，分子量，分子量427kD427kD。DMD/BMD 70%DMD/BMD 70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用生在不同的部位。应用多重多重PCRPCR扩增检测，判断缺失扩增检测，判断缺失状态。状态。4848杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断 多重多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图（检测患者缺失凝胶电泳图（9对引物）对引物）P1 除外显子除外显子1 外其余均缺失；外其余均缺失；P2 外显子外显子819 有小的缺失；有小的缺失；P3 外显子外显子44-50 缺失；缺失；P4 外显子外显子4552 有小的缺失；有小的缺失；B1 空白对照；空白对照；C1、C2 正常对照。正常对照。49杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断多重PCR检测患者缺失凝临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKDGeneAPKDGene定位定位16p1316p13，但致病基因尚未克隆，基，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实已证实APKD GeneAPKD Gene与与珠蛋白基因珠蛋白基因33端附近的一段端附近的一段小卫星小卫星DNADNA序列（序列（3HVR3HVR）紧密连锁，因此，可以通）紧密连锁，因此，可以通过过RFLPRFLP连锁分析进行诊断。连锁分析进行诊断。成年型多囊肾病的基因诊断成年型多囊肾病的基因诊断APKDAPKD，AD AD 50临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最以以33HVR为为probe与与PvuII酶切后的家系有关成酶切后的家系有关成员的员的Gene组组DNADNA杂交杂交Southern Blot杂交杂交Gene组组DNAprobe（3HVR）PvuII酶切酶切DNA片段片段杂交杂交结果结果51以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有结结果果121234557kb34kb23kb52结果1结果分析结果分析患者（患者（I1、II1和和II2）有）有3.4kb3.4kb片段片段,说明说明致病基因与致病基因与3.4kb3.4kb片段连锁片段连锁,并按孟德尔方并按孟德尔方式遗传式遗传.II5不含不含3.4kb3.4kb片段片段,产前诊断正常产前诊断正常.53结果分析53甲型血友病的基因诊断甲型血友病的基因诊断血血友友病病是是一一种种遗遗传传性性凝凝血血功功能能障障碍碍的的出出血血性性疾疾病病，由由于于正正常常凝凝血血过过程程中中血血浆浆凝凝血血的的活活力力有有缺缺陷陷所所致致。患患者者常常因因出出血血不不止止或或继继发发病病而而夭夭折折，治治疗疗主主要要靠靠替替代代疗疗法法，输输入入缺缺乏乏的的血血浆浆因因子子。重重型型血血友友病病甲甲和和乙乙的的男男性性发发病病率率为为1/50001/500001/50001/50000。为为甲型血友病和乙型血友病。甲型血友病和乙型血友病。54甲型血友病的基因诊断血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾已知甲型血友病已知甲型血友病XRXR，获得家系成员基因组，获得家系成员基因组DNA DNA。PCR 142 bpPCR 142 bp BcLI BcLI BcLI BcLI 142bp+99 bp+43bp 142bp+99 bp+43bp 电泳电泳 结果分析结果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+55p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-B问问:1：2、1诊断；诊断；2：1是男或是女发病是男或是女发病？142bp99bp12123III156问:1：2、1诊断；2：1是男或是女发病？142bp结果分析结果分析1 1）先症者）先症者II2具有具有99bp99bp片段而发病，该片段来自母亲。片段而发病，该片段来自母亲。2 2）II2有有142bp/99bp142bp/99bp杂合子。杂合子。142bp142bp来自父亲，为正来自父亲，为正常片段，常片段，99bp99bp片段是来自母亲而成为携带者。片段是来自母亲而成为携带者。3 3）1为为99bp99bp片段片段 如果是男性为患者（如果是男性为患者（99bp99bp片段来自母亲）；女性片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）。为携带者（来自父母双方）。57结果分析1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略.58肿瘤的基因诊断肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生 一一.通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤淋巴造血系统肿瘤:染色体易位及基因融合是较普遍的现象染色体易位及基因融合是较普遍的现象.如如:淋巴瘤和淋巴结反应性增生淋巴瘤和淋巴结反应性增生.它是由于它是由于T T细胞受体细胞受体(TCR)(TCR)基基因和因和IgHIgH基因重排基因重排,使原来相隔数百个碱基的使原来相隔数百个碱基的IgHIgH和和TCRTCR基因的基因的V V区和区和J J区靠近在一起区靠近在一起.用用PCRPCR扩增该区域片段扩增该区域片段,通过长度分析通过长度分析就能判断是否发生了基因重排就能判断是否发生了基因重排.5959二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和细胞中都能检测到癌基因和(或或)抑癌基因的突变抑癌基因的突变1.1.癌基因癌基因-ras-ras与肿瘤与肿瘤:ras ras是肿瘤中最常被激活的癌基因是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变激活的分子机制主要是点突变,高发区是第高发区是第12 12、1313和和6161位密码子位密码子.如如90%90%的胰腺癌的胰腺癌,50%,50%的结直肠癌和的结直肠癌和1/31/3的肺腺癌都在是的肺腺癌都在是K-K-rasras基因第基因第1212位密码子突变位密码子突变.ras ras癌基因点突变检测方法癌基因点突变检测方法:a.PCR-ASOa.PCR-ASO法法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类型。仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类型。b.PCR-SSCPb.PCR-SSCP法：法：根据根据PCRPCR扩增的目标扩增的目标DNADNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便；变基因检测出来。该法检测点突变更方便；缺点：不能检测出突变的具体位缺点：不能检测出突变的具体位点和具体类型。点和具体类型。60二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤癌基因的激活及抑癌 2.2.P53P53基因与肿瘤基因与肿瘤：p53 p53基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子机制主要基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基因表达异常而使是基因突变，也有因为基因表达异常而使p53p53失活，约失活，约50%50%以上的恶性肿瘤有以上的恶性肿瘤有p53p53基因突变。基因突变。突变类型：突变类型：130130290290密码子间常发生点突变，也有少量的密码子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。插入或缺失突变。基因检测方法：基因检测方法：PCR-SSCP:PCR-SSCP:可检出有无突变可检出有无突变 PCR-RFLP:PCR-RFLP:通过内切酶位点的消失或增加通过内切酶位点的消失或增加 检测检测p53p53的基因突变的基因突变。612.P53基因与肿瘤：61三.通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也病毒，也有有RNA病毒病毒,其中逆转录病毒其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤对动物细胞的致瘤作用已得到公认作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如:Burkitt 淋巴瘤人类乳头瘤病毒(HPV)宫颈癌通过检测这些病毒的基因就可以帮助诊断相应的肿瘤.EB病毒62三.通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤已经发现多种病毒与肿瘤四.通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物肿瘤标志物（tumor marker)tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。类型类型：基因标志基因标志：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。化。基因表型标志基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。基因诊断方法基因诊断方法：基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，测序，PCR-SSCPPCR-SSCP等技术。等技术。导致肿瘤标记物产生导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，可用或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCRRT-PCR技术检测肿瘤标记物技术检测肿瘤标记物mRNAmRNA的存在的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。中该酶的活性增高。63四.通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物（tu感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断 每种病原体都有各自特异的遗传物质每种病原体都有各自特异的遗传物质,可以是可以是DNA,DNA,也可以是也可以是RNA.RNA.每种病原生物都有各自种属特异的基因每种病原生物都有各自种属特异的基因.一一.病毒感染性疾病的诊断病毒感染性疾病的诊断 a.a.乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒:目前采用免疫法检测血清中病毒抗原目前采用免疫法检测血清中病毒抗原.HBV HBV基因组包含基因组包含4 4个开放阅读框个开放阅读框,S,S、C C、P P和和X X区区,C,C区变异性区变异性小小,是基因诊断采用的目标部位是基因诊断采用的目标部位.在用在用PCRPCR检测时可扩增检测时可扩增HBVHBV的特异核苷酸序列的特异核苷酸序列,通过通过PCRPCR产物的直接电泳分析、或内切产物的直接电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或酶谱分析、或点杂交、或SouthernSouthern印迹等结果作出判断印迹等结果作出判断.也也可采用基因芯片技术可采用基因芯片技术.64感染性疾病的基因诊断每种病原体都有各自特异的遗传物质PCR检测检测HIV病毒携带者病毒携带者65PCR检测HIV病毒携带者65 b.b.传染性非典型肺炎传染性非典型肺炎(SARS):(SARS):是由新型变异冠状病毒是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)(SARS-CoV)感染引起感染引起.SARS-CoV.SARS-CoV基因组基因组为正链单股为正链单股RNA,RNA,有有1111个开放阅读框个开放阅读框,基因组的特异保守序列为编基因组的特异保守序列为编码码RNARNA聚合酶的序列聚合酶的序列.基因诊断方法基因诊断方法:采用采用RT-PCRRT-PCR技术扩增保守序列技术扩增保守序列 DNADNA芯片芯片二二.诊断细菌感染性的疾病诊断细菌感染性的疾病 用用PCRPCR技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列,设计引物设计引物,检测检测引起的疾病的细菌类型引起的疾病的细菌类型.66b.传染性非典型肺炎(SARS):66基因诊断方法在法医学上的应用基因诊断方法在法医学上的应用 微卫星核心区重复序列的微卫星核心区重复序列的拷贝数的差异拷贝数的差异是微卫星是微卫星DNADNA多多态性的主要成因态性的主要成因，微卫星的侧翼序列多是相对保守的非重微卫星的侧翼序列多是相对保守的非重复序列，因此可以设计特异性引物，用复序列，因此可以设计特异性引物，用PCRPCR技术技术检测微卫星检测微卫星DNADNA的多态性。的多态性。人工合成很短的重复序列作为探针，与酶切的人体人工合成很短的重复序列作为探针，与酶切的人体DNA作作southernblot，同一个体的不同组织来源的，同一个体的不同组织来源的DNA谱带完全谱带完全一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，这种同人的指纹具有高度个体特异性一样，这种southern印迹印迹图图被称为被称为DNA指纹。指纹。67基因诊断方法在法医学上的应用67PCR-STR技术在法医学中的应用技术在法医学中的应用68PCR-STR技术在法医学中的应用68基因诊断用于亲子鉴定基因诊断用于亲子鉴定69基因诊断用于亲子鉴定69DNA指纹分析用于个体鉴定指纹分析用于个体鉴定70DNA指纹分析用于个体鉴定70基因诊断意义基因诊断意义现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生儿的出生 71基因诊断意义现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。71基因诊断存在的问题与发展前景一.基因诊断技术应用存在的问题 1.理论问题 目前找到的致病基因不多,由多基因及基因 与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不 清楚 2.技术问题 设备条件;操做人员;污染造成的假阳性.3.伦理问题二.发展前景72基因诊断存在的问题与发展前景一.基因诊断技术应用存在的问题7结束语 基因诊断利用分子生物学技术基因诊断利用分子生物学技术,从从DNA/RNADNA/RNA水平检测基因水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态的存在、分析基因的结构变异和表达状态,从而对疾病作出从而对疾病作出诊断诊断.基因诊断的基本技术是核酸分子杂交和基因诊断的基本技术是核酸分子杂交和PCRPCR扩增扩增.前者前者是最直接、最准确的基因诊断技术是最直接、最准确的基因诊断技术,后者则是应用前景最为后者则是应用前景最为广阔的诊断技术广阔的诊断技术.目前目前,基因诊断技术已广泛地应用到遗传基因诊断技术已广泛地应用到遗传病、肿瘤和感染性疾病的诊断病、肿瘤和感染性疾病的诊断.随着医学和分子生物学技术随着医学和分子生物学技术的不断发展的不断发展,基因诊断技术将会更加广泛基因诊断技术将会更加广泛.73结束语基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA水基因治疗基因治疗Gene Therapy74基因治疗GeneTherapy74基因治疗（基因治疗（Genetherapy）基因治疗基因治疗（Genetherapy）：指应用：指应用DNA重组技术，将重组技术，将外源正常基因外源正常基因导入导入靶细靶细胞胞，以，以纠正纠正或或补偿补偿因基因缺陷和异常引起因基因缺陷和异常引起的疾病的疾病,以达到治疗的目的。以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。为达到这一目的，实施相应的策略。75基因治疗（Genetherapy）基因治疗基因治疗三要素基因治疗三要素1.合适的目的基因合适的目的基因：补充缺损基因；矫正异常：补充缺损基因；矫正异常基因；其他具有治疗作用的基因。基因；其他具有治疗作用的基因。2.合适的基因转移方法合适的基因转移方法。3.必须在体内正常表达必须在体内正常表达：基因表达调控机制。：基因表达调控机制。76基因治疗三要素1.合适的目的基因：补充缺损基因；矫正异常基因基因治疗流程基因治疗流程1.确定病因（致病基因）确定病因（致病基因）2.治疗基因的获得：治疗基因的获得：DNA重组重组3.将治疗基因导入基因治疗靶细胞将治疗基因导入基因治疗靶细胞靶细胞：靶细胞：体细胞、生殖细胞（符合易培养、易取出和移植、体细胞、生殖细胞（符合易培养、易取出和移植、体细胞、生殖细胞（符合易培养、易取出和移植、体细胞、生殖细胞（符合易培养、易取出和移植、寿命长等条件）寿命长等条件）寿命长等条件）寿命长等条件）导入方法：导入方法：物理法、化学法、融合法、病毒载体法物理法、化学法、融合法、病毒载体法物理法、化学法、融合法、病毒载体法物理法、化学法、融合法、病毒载体法4.将治疗基因修饰的靶细胞回输体内将治疗基因修饰的靶细胞回输体内5.观察治疗效果观察治疗效果77基因治疗流程1.确定病因（致病基因）77本章内容提示基因治疗基因治疗(genetherapy)概念概念基因治疗策略基因治疗策略治疗靶细胞：体细胞、生殖细胞的基因治疗治疗靶细胞：体细胞、生殖细胞的基因治疗基因转移方法基因转移方法靶细胞特点、靶细胞种类靶细胞特点、靶细胞种类反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸技术自杀基因与旁观者效应自杀基因与旁观者效应78本章内容提示基因治疗(genetherapy)概念78一、基因治疗策略一、基因治疗策略策略：直接基因治疗和间接基因治疗策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：、直接基因治疗：纠正纠正突变基因突变基因在在原位原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较为较理想理想的基因治疗策略，由于存在某些问的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）题，目前正在努力之中。（未实现）79一、基因治疗策略792 2、间接疗法：、间接疗法：以正常的基因以正常的基因替代替代致病基因致病基因。导入外源正常基因，导入外源正常基因，代替代替有缺陷的基因。而有缺陷的基因。而 对靶细胞而言，对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因没有去除或修复有缺陷的基因。用用DNADNA重组技术重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。目的。802、间接疗法：80途途径径:就基因转移的就基因转移的受体细胞受体细胞不同，不同，基因治疗有两种基因治疗有两种途径：途径：1、生殖细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗2、体细胞基因治疗、体细胞基因治疗81途径:就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径1、生殖细胞基因治疗将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为为理想理想的治疗方法，从的治疗方法，从根本根本上治疗遗传病，上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。使其有害基因不能在人群中散播。821、生殖细胞基因治疗将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞但还存在某些问题：但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用）基因转移效率不高，只能用显微注射显微注射方法；方法；3）只适用于排卵周期）只适用于排卵周期短而次数多短而次数多的动物，很难适的动物，很难适用于人类。用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多个，多者十几个。）者十几个。）83但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；82体细胞基因治疗somatic cell gene therapy将正常基因转移到将正常基因转移到体细胞体细胞，使之表达基，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。遗传给后代。842体细胞基因治疗somaticcellgeneth措施：（1 1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。表达后，再回输到体内。（2 2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体 上，准确的替换异常基因，是上，准确的替换异常基因，是理想理想的措施。的措施。（3 3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达）随机整合，非特定座位，只要有效的表达 即可达到治疗的目的。即可达到治疗的目的。（4 4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体 细胞。细胞。85措施：（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，存在的问题 对特定座位基因转移，目前还存在较大对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；困难；随机插入可能引起后代的基因突变。随机插入可能引起后代的基因突变。86存在的问题86二二、基因治疗的方法、基因治疗的方法基因治疗的关键性步骤基因治疗的关键性步骤-目的基因的目的基因的获得与转移获得与