临床生化自动化分析仪课件

1第七章临床生化自动化分析检验医学专业检验医学专业温州医学院温州医学院 陈筱菲陈筱菲1第七章临床生化自动化分析检验医学专业2教学目标和要求教学目标和要求掌握掌握自动生化分析仪的分析方法类型及其自动生化分析仪的分析方法类型及其 特点，连续监测法的理论特点，连续监测法的理论K K值，必选的分析参值，必选的分析参数，双波长测定的作用，双试剂的优点，分析数，双波长测定的作用，双试剂的优点，分析仪与手工法比较的优点和缺点。仪与手工法比较的优点和缺点。熟悉熟悉分立式自动生化分析仪的基本结构，备分立式自动生化分析仪的基本结构，备选的分析参数，测定过程的自动监测，校准方选的分析参数，测定过程的自动监测，校准方式和校准要求，影响分析仪分析速度的因素和式和校准要求，影响分析仪分析速度的因素和分析仪性能指标。分析仪性能指标。了解了解某些分析参数的特殊意义，分析仪的工某些分析参数的特殊意义，分析仪的工作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分析原理，常用分析仪的分析性能。析原理，常用分析仪的分析性能。2教学目标和要求3 自动生化分析仪自动生化分析仪由电脑控制，将生化由电脑控制，将生化分析中的取样分析中的取样(sampling)sampling)、加试剂、混匀、加试剂、混匀、保温反应、检测保温反应、检测(detect)detect)、结果计算、可结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗靠性判断、显示和打印、以及清洗(cleaning)cleaning)等步骤组合在一起自动进行操等步骤组合在一起自动进行操作的分析仪器。作的分析仪器。3 自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sa4 自动生化分析技术的应用自动生化分析技术的应用提高了临床生化检验质量和速度；提高了临床生化检验质量和速度；减轻检验人员的劳动强度；减轻检验人员的劳动强度；节约样品和试剂；节约样品和试剂；增加检验项目；增加检验项目；提高检测精密度，减少实验误差；提高检测精密度，减少实验误差；并且有利于临床检验标准化的实现并且有利于临床检验标准化的实现。4 自动生化分析技术的应用5自动生化分析仪按其工作方式不同分为自动生化分析仪按其工作方式不同分为n连续流动式连续流动式(continuouscontinuousstreaming movementstreaming movementstyle)style)或管道式：已很少用或管道式：已很少用n离心式离心式(centrifugation style)centrifugation style)：已很少用：已很少用n分立式分立式(discretediscretestyle)style)：应用最广泛应用最广泛n干片式干片式(drying style)drying style)：急诊多用急诊多用5自动生化分析仪按其工作方式不同分为连续流动式(contin6第一节第一节 分立式自动生化分析仪的结构分立式自动生化分析仪的结构 完全完全模仿手工操作模仿手工操作方式设计，各部分结方式设计，各部分结构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等 。6第一节 分立式自动生化分析仪的结构 完全模仿手工操7一、基本结构（一）样品盘或样品架（一）样品盘或样品架 样品盘样品盘（specimen discspecimen disc）：放置待测样品：放置待测样品的转盘，可放置一定数量的的转盘，可放置一定数量的样品杯（样品杯（specimen cupspecimen cup）或不同规格的或不同规格的采血试管采血试管，通过样品盘的转动来控制通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。不同样品的进样。7一、基本结构（一）样品盘或样品架 8 样品架样品架（specimen stockspecimen stock）：）：每个样品每个样品架可放数只样品杯或采血试管（多为架可放数只样品杯或采血试管（多为5 5只或只或1010只）。样品架的移动通过只）。样品架的移动通过样品传送带样品传送带来进行。来进行。样品架样品架 上上 的的 条形码条形码（barcodebarcode）或编或编码孔可识别样品码孔可识别样品架架号号及样品及样品位置号位置号。8 样品架（specimen stock）：每个样品架9样品架的优点样品架的优点随着样品架移动及样品的被检测，可不断随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；追加已放置样品杯或采血试管的样品架；通过样品架的通过样品架的移动能将样品传移动能将样品传送到另一个送到另一个分析分析模块模块（analysisanalysisdie-blockdie-block）甚至甚至另一台分析仪上另一台分析仪上再进行分析。再进行分析。9样品架的优点随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放10（二）试剂室和试剂瓶（二）试剂室和试剂瓶 转盘式试剂室转盘式试剂室（reagent chamberreagent chamber）：）：内装放内装放置试剂瓶的转盘，一般可放置置试剂瓶的转盘，一般可放置2020种以上具有一定种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置30304545种种试剂瓶。试剂瓶。试剂瓶容量一试剂瓶容量一般为般为1010100100mlml。通过试剂转盘的通过试剂转盘的转动来选用不同转动来选用不同试剂。试剂。10（二）试剂室和试剂瓶 转盘式试剂室（reagen11 试剂架式试剂室试剂架式试剂室：可放置容量为：可放置容量为250250mlml500ml500ml的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条但每个试剂瓶内引出一条试剂管路试剂管路及其喷嘴，及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无试剂间无交叉污染交叉污染。但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积，但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。测项目。11 试剂架式试剂室：可放置容量为250ml500m12 大型分析仪同时备有大型分析仪同时备有第一试剂室第一试剂室和和第二试第二试剂室剂室，即具备对同一检测项目添加两次试剂的，即具备对同一检测项目添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。对有条形码装置的仪器可将带条形码的试对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘剂瓶放在试剂室转盘上的任意位置，仪上的任意位置，仪器能自动识别试剂器能自动识别试剂的种类、批号和有的种类、批号和有效期。试剂室均具效期。试剂室均具有有冷藏装置冷藏装置，可将，可将试剂保存在试剂保存在4 41010。12 大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试剂室，即具备13（三）反应杯和反应盘（三）反应杯和反应盘 反应杯反应杯（reaction reaction cupcup）是样品与试剂进行化学是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色反应的场所，同时用作比色杯。由透光特性好的硬塑料杯。由透光特性好的硬塑料或石英玻璃制成。比色杯光或石英玻璃制成。比色杯光径不同分析仪有径不同分析仪有0.50.50.70.7厘厘米不等，大多数分析仪在计米不等，大多数分析仪在计算时将其折算为算时将其折算为1 1厘米光径。厘米光径。13（三）反应杯和反应盘 反应杯（reaction 14 反应盘反应盘（reaction discreaction disc）：）：100100只只或更多的反应杯围成一圈组成。在测定或更多的反应杯围成一圈组成。在测定过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀，当反应盘恒速圆周运动经过搅拌混匀，当反应盘恒速圆周运动经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。14 反应盘（reaction disc）：100只或15（四）取样和加试剂装置（四）取样和加试剂装置 1 1取样装置取样装置（sampling sampling assemblyassembly）：）：由取样针、取样臂、取样管路、取样注射由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量器和阀门组成，能定量吸取样品并加入到反吸取样品并加入到反应杯。应杯。不同分析仪的取样不同分析仪的取样容量有不同的范围，容量有不同的范围，一般为一般为2 23535ll，步步进进0.10.1微升不等。微升不等。15（四）取样和加试剂装置 1取样装置（sampling 16 取样针设有电子取样针设有电子液面感应器液面感应器，取样针，取样针于样品上方下降，一于样品上方下降，一旦接触到样品液面即旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。停止下降而开始吸样。适用于不同的采血试适用于不同的采血试管上机测定管上机测定16 取样针设有电子液面感应器，取样针于样品上方下降，17 多数加样装置设有多数加样装置设有防撞功能防撞功能，遇到阻碍，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有还设有阻塞报警功能阻塞报警功能，当取样针被样品中的，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、冲洗取样针，并跳过当前样品，进行报警、冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测下一个样品的取样检测。17 多数加样装置设有防撞功能，遇到阻碍时取样针立18取样针防交叉污染（取样针防交叉污染（crossingcrossing contaminationcontamination）措施措施 绝大多数采用绝大多数采用水洗方式水洗方式（又有瀑布式和（又有瀑布式和涌泉式之分），在吸取另一个样品前对接触涌泉式之分），在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；样品的样品针内外壁进行冲洗；也有采用也有采用化学惰性液化学惰性液（chemical chemical inertiainertiafluidfluid）膜的方式来隔绝样品与取膜的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。样针内外壁之间的接触。18取样针防交叉污染（crossing contamina192 2加试剂装置加试剂装置 加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可加入试剂容量一般为杯，可加入试剂容量一般为2020350350ll。步步进进1 15 5微升不等，取样精度在微升不等，取样精度在1 1微升左右。微升左右。注射器方式注射器方式：组成部件与取样装置类似，：组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量试剂剩余量。灌注式灌注式：具有许多条试剂管路及其喷嘴，：具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴，不每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴，不存在各试剂间的交叉污染。存在各试剂间的交叉污染。192加试剂装置 加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯20 大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的第第一试剂一试剂和和第二试剂第二试剂，大多数分析仪所有检测项，大多数分析仪所有检测项目加入第二试剂的时间点统一固定为目加入第二试剂的时间点统一固定为1 1个或个或2 2个个点，也有分析仪有点，也有分析仪有3 3个加入时间点可供选择。个加入时间点可供选择。20 大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个21（五）混匀与搅拌装置（五）混匀与搅拌装置 反应杯里的样品与试剂通过反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌棒搅拌而搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌旋转式搅拌，也有，也有震动式搅拌震动式搅拌方式。也设置了防止搅拌棒在不同方式。也设置了防止搅拌棒在不同反应液之间携带交叉污染的清洗措施。反应液之间携带交叉污染的清洗措施。21（五）混匀与搅拌装置 反应杯里的样品与试剂通过搅拌22（六）温控和定时系统（六）温控和定时系统 温控系统温控系统使反应杯浸浴在恒温环境：使反应杯浸浴在恒温环境：恒温恒温循环水浴方式循环水浴方式：温度传递速度快，保：温度传递速度快，保养要求较高。养要求较高。恒温恒温空气浴方式空气浴方式：温度传递速度不如恒温：温度传递速度不如恒温水浴循环方式，保养简单。水浴循环方式，保养简单。温度控制器能使循环水或循环空气的温度温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度控制在规定温度0.10.1。规定温度可有。规定温度可有3737和和3030两种选择，一般固定在两种选择，一般固定在3737。22（六）温控和定时系统 温控系统使反应杯浸浴在恒温环23 定时系统定时系统：不同分析仪对检测吸光度的不同分析仪对检测吸光度的间隔时间间隔时间有不同的规定，有不同的规定，反应时间反应时间应该设定为此应该设定为此间隔时间的倍数。总反应时间一般限制间隔时间的倍数。总反应时间一般限制在在8.5-108.5-10minmin内，个别分析仪可以设定为内，个别分析仪可以设定为1515或或2222minmin等。等。23 定时系统：24（七）光路和检测系统（七）光路和检测系统 自动生化分析仪以自动生化分析仪以紫外可见分光光度紫外可见分光光度法法为其中心和主要的检测手段，与一般分为其中心和主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由光光度计一样，其光路和检测系统由光源光源、单色器单色器和和检测器检测器组成。组成。24（七）光路和检测系统 自动生化分析仪以紫外可见分251 1光源（光源（light sourcelight source）一般为一般为卤素钨丝灯卤素钨丝灯（halogenhalogentungsten filamenttungsten filamentlamplamp），），也有采用也有采用长寿命的长寿命的氙灯氙灯（xe lampxe lamp），），要求在要求在340340800800nmnm波长范围内能发射出稳定且较平坦波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。的光能。251光源（light source）一般为卤素钨262 2单色器（单色器（monochromatomonochromato）干涉滤光片干涉滤光片（interference filterinterference filter）分分光系统：常带有光系统：常带有340340、380380、405405、500500、550550、600600、660660nmnm等几种滤光片，各滤光片固定在等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长转盘旋转的方式来选择波长。这。这种分光系统在半自动和小型自动分析仪中常种分光系统在半自动和小型自动分析仪中常用，且不能同一时刻进行多波长检测。用，且不能同一时刻进行多波长检测。光栅光栅（rasterraster）分光系统：常在分光系统：常在340340（或（或293293）800800nmnm范围内选择范围内选择10101313种固定的单种固定的单色光。色光。262单色器（monochromato）干涉滤光片27前分光和后分光方式前分光和后分光方式 光栅分光有前分光和后分光两种方式，光栅分光有前分光和后分光两种方式，光源首先经过单色器分光，然后透射到比光源首先经过单色器分光，然后透射到比色溶液的方式为色溶液的方式为前分光前分光。目前以后分光方。目前以后分光方式为多见，其优点是单色器中没有转动部式为多见，其优点是单色器中没有转动部分，双波长在同一时刻检测，因而提高了分，双波长在同一时刻检测，因而提高了检测的精度和速度。检测的精度和速度。27前分光和后分光方式 光栅分光有前分光和后分光两种方28 光源先透过比色杯中的反应液再照射到光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数，分析项目的分析参数，后分光方式后分光方式 选择其中选择其中一个或两个波一个或两个波长（双波长方长（双波长方式）的吸光度式）的吸光度值，用于分析值，用于分析结果的计算。结果的计算。28 光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散293 3检测器（检测器（detectordetector）由光敏二极管及放大电路组成，可按设由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。值。293检测器（detector）由光敏二极管及放大电路30（八）数据处理系统（八）数据处理系统 具有多种数据处理功能。具有多种数据处理功能。n 计算测定结果计算测定结果 n 判断结果准确性判断结果准确性 n 保存各种数据保存各种数据 n 自我诊断功能自我诊断功能 30（八）数据处理系统 具有多种数据处理功能。31（九）清洗系统（九）清洗系统 反应杯反应杯清洗装置清洗装置：一个反应杯内的反应和：一个反应杯内的反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗。检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗。清洗过程：由废液针吸取反应杯内废液，清洗过程：由废液针吸取反应杯内废液，加入加入清洗剂清洗剂（detergentdetergent）冲洗并抽干后，再经冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，然后做数次去离子水冲洗及抽干，然后做杯空白杯空白的吸的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；更高级的仪器带有风干技术。如果不能使用；更高级的仪器带有风干技术。如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。31（九）清洗系统 反应杯清洗装置：一个反应杯内的反32样品针、试剂针和搅拌棒清洗样品针、试剂针和搅拌棒清洗 一般在用于下一个样品、试剂或反应一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。清洗剂可配有清洗剂可配有1 1至至3 3种可供选择，除一种种可供选择，除一种常规清洗剂外，其它常规清洗剂外，其它1 1至至2 2种可按设定对试剂种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。针、样品针或反应杯进行补充清洗。32样品针、试剂针和搅拌棒清洗 一般在用于下一个样33二、组合式自动分析仪二、组合式自动分析仪（一）（一）组合式自动生化分析仪组合式自动生化分析仪 将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即分析模块分析模块进行组合连接，采用样品架方式使样品通过进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于有基于离子选择电极离子选择电极的电解质分析模块，甚至还可组的电解质分析模块，甚至还可组合建立在合建立在免疫发光免疫发光分析原理的免疫分析模块。分析原理的免疫分析模块。33二、组合式自动分析仪（一）组合式自动生化分析仪34组合式分析仪组合式分析仪34组合式分析仪35（二）实验室自动化系统（二）实验室自动化系统（laboratory automation system，LASLAS）包括包括样品前处理系统样品前处理系统、样品输送系统样品输送系统和和各样各样品分析系统品分析系统。不同功能的各模块以同一标准来连。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。随着检测样品量的增接，通过计算机控制运行。随着检测样品量的增加，只需添加需要的新模块，将其安装连接，即加，只需添加需要的新模块，将其安装连接，即可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在模块发生故障时，其余模块仍在运行，在2424小时小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。常工作。35（二）实验室自动化系统（laboratory aut36样品前处理系统样品前处理系统 能独立工作，由样品投入部、离心分离部、能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。活性和扩展性。也可通过样品输送部分与样品分析系统连接，也可通过样品输送部分与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室的全自动化。采血到报告的实验室的全自动化。36样品前处理系统 能独立工作，由样品投入部、离心分离37第二节第二节 生化自动化分析方法概要生化自动化分析方法概要 一、分析方法分类一、分析方法分类（一）（一）终点法终点法（end assay）被测物质在反应过程中完全被转变为产物，被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为该法称为平衡法更为恰当。从恰当。从时间时间-吸光度曲线吸光度曲线来看，到达反应终点来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。37第二节 生化自动化分析方法概要 一、分析方法分类38终点时间的确定终点时间的确定根据时间根据时间-吸光度曲线来确定，吸光度曲线来确定，根据被测物反应终点，结合干扰物的反根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。应情况来确定。38终点时间的确定根据时间-吸光度曲线来确定，391一点终点法一点终点法（one point end assay）在反应到达终点，即在时间在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。用于计算结果。结果计算公式：待测物浓度结果计算公式：待测物浓度C CU U=（待测吸光度待测吸光度A AU U试剂空白吸光度试剂空白吸光度A AB B）KKK K为校准系数为校准系数 391一点终点法（one point end assay）40图4-3一点终点法反应曲线一点终点法反应曲线 A单试剂一点终点法 B双试剂一点终点法40图4-3一点终点法反应曲线 A单试剂一点终点法 412两点终点法两点终点法（two point end assay）在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。果。计算公式为：计算公式为：C CU U=（待测吸光度待测吸光度A A2 2待测吸光度待测吸光度A A1 1）KK。412两点终点法（two point end assay）42图图4-44-4两点终点法反应曲线两点终点法反应曲线 A单试剂两点终点法 B双试剂两点终点法 42图4-4两点终点法反应曲线 A单试剂两点终点法 43 该法能有效地消除该法能有效地消除溶血溶血(hemolysis)hemolysis)、黄疸（黄疸（icterusicterus）和和脂浊（脂浊（lipo-lipo-turbidturbid）等样品本身等样品本身光吸收造成的干扰。光吸收造成的干扰。图图4-5 4-5 血红蛋白、胆红素和脂浊的血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线光吸收曲线 43 该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸44（二）固定时间法（二）固定时间法（fixed-time assay）指在时间指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法称此法为两点法 。计算公式与两点终点法相同，计算公式与两点终点法相同，C CU U=(A=(A2 2-A-A1 1)K)K。44（二）固定时间法（fixed-time assay）45图图4-64-6固定时间法反应曲线固定时间法反应曲线 A单试剂固定时间法 B双试剂固定时间法该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。45图4-6固定时间法反应曲线 A单试剂固定时46（三）（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring assay）又称又称速率法速率法（rate assayrate assay），），是在测定酶是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（位吸光度变化值（A/minA/min）计算结果。计算结果。46（三）连续监测法（continuous monitor47图图4-74-7连续监测法反应曲线连续监测法反应曲线 A单试剂连续监测法 B双试剂连续监测法 47图4-7连续监测法反应曲线 A单试剂连续监测法 48酶促反应的线性段酶促反应的线性段 1 1及及5 5值偏小，而值偏小，而2 23 34 4，故故A A1 1点至点至A A4 4点属线性段点属线性段 48酶促反应的线性段 1及5值偏小，而234，49连续监测法的优点连续监测法的优点 可以确定线性期并计算可以确定线性期并计算A/minA/min，根据此根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（酶活性（U/LU/L）A/minA/min理论（或校准）理论（或校准）K K值。值。代谢物浓度代谢物浓度C CU U=A/min=A/min校准校准K K值。值。49连续监测法的优点 可以确定线性期并计算A/m501 1理论理论K K值值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：义得出酶活性的计算公式为：酶活性酶活性(U/L)=A/minU/L)=A/min将此式中将此式中 以以K K来表示，即为来表示，即为理论理论K K值值 可作为分析参数输入到分析仪中。可作为分析参数输入到分析仪中。501理论K值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的51采用理论采用理论K K值的前提值的前提 应当是样品和试剂的加量准确、比色杯应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。温度的影响有时也非常大。51采用理论K值的前提 应当是样品和试剂的加量准确、52 由于由于摩尔吸光系数摩尔吸光系数受比色杯光径、波受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论光系数，然后来计算理论K K值。值。52 由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长等的影响，书本53（1 1）NADHNADH（NADPHNADPH）摩尔吸光系数的测定摩尔吸光系数的测定 NADH NADH（NADPHNADPH）没有标准纯制品，而没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH NADH 或或NADPHNADPH标准液来校正仪器，须通过标准液来校正仪器，须通过有有NADNAD+(NADP(NADP+)参与的反应途径。参与的反应途径。53（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定 54n用已糖激酶用已糖激酶(HK)HK)或葡萄糖脱氢酶或葡萄糖脱氢酶(GD)GD)方法方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADHNADH的生成的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。n根据公式根据公式A=bCA=bC，已知比色杯光径已知比色杯光径b b和葡萄和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A A后便可计算出后便可计算出NADHNADH（NADPHNADPH）的摩尔吸光系的摩尔吸光系数数为为 A/bCA/bC。54用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖55测定方法测定方法 葡萄糖标准液浓度为葡萄糖标准液浓度为1 1Ommo1/L(0.01mol/L)Ommo1/L(0.01mol/L)，标准标准液加入量为液加入量为3.53.5LL，酶试剂加入量为酶试剂加入量为335335LL，比色杯光比色杯光径为径为0.70.7cmcm，在在340340nmnm测得吸光度为测得吸光度为0.4650.465，则实测，则实测NADHNADH摩摩尔吸光系数尔吸光系数 =64246424，即在此台分析仪上，即在此台分析仪上340340nmnm波长处测得波长处测得NADHNADH（NADPHNADPH）的摩尔吸光系数为的摩尔吸光系数为64246424，而理论上而理论上NADHNADH（NADPHNADPH）的的为为62206220。55测定方法 葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(56（2 2）“色素原色素原”酶促产物酶促产物在在405405nmnm波长摩尔吸光系数的测定波长摩尔吸光系数的测定 有许多酶底物为人工合成的有许多酶底物为人工合成的“色素原色素原”底物，其本身无色，经底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在酶作用后释放出有色的反应产物，在405405nmnm波长具有吸收峰。波长具有吸收峰。ALPALP底物底物磷酸对硝基苯酚磷酸对硝基苯酚(4-(4-Nitrophenyl phosphateNitrophenyl phosphate，4-NPP)4-NPP)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-(4-NitrophenolNitrophenol，4-NP)4-NP)GGTGGT底物底物-L-L-谷氨酰对硝基苯胺谷氨酰对硝基苯胺(-L-Glutamyl-p-nitroanilide)-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或或-L-L-谷氨酰谷氨酰-3-3-羟基羟基-对硝基苯胺对硝基苯胺(-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroanilinep-Nitroaniline，4-NA)4-NA)或对硝基或对硝基-5-5-氨基苯甲酸氨基苯甲酸(2-(2-amino-nitrobenzoicacidamino-nitrobenzoicacid，ANBA)ANBA)。56（2）“色素原”酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的57以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例试剂：试剂：4-4-NPNP标准储存液标准储存液(1(1Ommo1/L)Ommo1/L)4-NP 4-NP标准应用液标准应用液(2.5(2.5mmo1/Lmmo1/L，以以0.840.84mol/L mol/L AMPAMP缓冲液稀释而成缓冲液稀释而成)底物缓冲液底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPPl5mmol/L 4-NPP配于配于0.840.84mol/L mol/L AMP-HCLAMP-HCL缓冲液中，缓冲液中，37,37,pH l0.09pH l0.09土土0.02)0.02)。57以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例试剂：58测定方法测定方法 4-4-NPNP标准液加入量为标准液加入量为5 5LL，底物缓底物缓冲液加入量为冲液加入量为350350LL，波长波长405405nmnm，光径光径0.70.7cmcm，温度温度3737，测定得吸光度为，测定得吸光度为A A1 1；另用另用蒸馏水代替蒸馏水代替4-4-NPNP标准液，按上述方法测定其标准液，按上述方法测定其吸光度为吸光度为A A2 2，4-NP4-NP标准液吸光度标准液吸光度A=AA=A1 1-A-A2 2，若测得若测得AA为为0.4600.460，则实测，则实测4-4-NPNP摩尔吸光摩尔吸光系数系数18662 18662 58测定方法 4-NP标准液加入量为5L592校准校准K K值值 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准校准K K值值为好，但必须有两个先决条件：为好，但必须有两个先决条件：必须使用必须使用配套的试剂；配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有品，该校准品应具有溯源性溯源性。592校准K值 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自60（四）透射比浊法（四）透射比浊法 抗原与相应的抗体结合形成的抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行度法进行透射比浊透射比浊（transmission transmission turbidimetryturbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做物浓度等的测定。该法须做多点校准多点校准，再经，再经非非线性回归线性回归，求出抗原或抗体的含量。，求出抗原或抗体的含量。60（四）透射比浊法 抗原与相应的抗体结合形成的免61二、常用生化检测项目分析方法举例二、常用生化检测项目分析方法举例 1 1终点法检测终点法检测 常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。法）等。61二、常用生化检测项目分析方法举例 1终点法检测 622 2固定时间法固定时间法苦味酸法测苦味酸法测定肌酐采用此定肌酐采用此法。法。622固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。633 3连续监测法连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法，对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、谷氨氨酰谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。等，也可用连续监测法。633连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监644 4透射比浊法透射比浊法 透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应可用于测定产生浊度反应的项目，多数属的项目，多数属免疫比浊法免疫比浊法，载脂蛋白、，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗免疫球蛋白、补体、抗“O”O”、类风湿因子，类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。644透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反65第三节第三节 分析参数设置分析参数设置 各种测定项目的各种测定项目的分析参数分析参数（analysisanalysisparameteparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。65第三节 分析参数设置 各种测定项目的分析参66一、分析参数介绍一、分析参数介绍（一）必选分析参数（一）必选分析参数 1 1试验名称试验名称（test codetest code）2 2方法类型方法类型（也称反应模式）（也称反应模式）(assay mode)assay mode)3 3反应温度反应温度4 4主波长主波长（primary wavelengthprimary wavelength）5 5次波长次波长（secondary wavelengthsecondary wavelength）6.6.反应方向反应方向（response directionresponse direction）66一、分析参数介绍（一）必选分析参数 1试验名称（te677 7样品量样品量（sampling volumsampling volum）常量、减量和增量。常量、减量和增量。8 8第一试剂量第一试剂量 （first reagent volumfirst reagent volum）一般一般20-30020-300ll9 9第二试剂量第二试剂量（second reagent volumsecond reagent volum）同上。同上。1010总反应容量总反应容量（total reacting volumtotal reacting volum）一般一般180-350180-350ll，个别仪器能减少至个别仪器能减少至120120ll。1111孵育时间孵育时间（incubate timeincubate time）1212延迟时间延迟时间（delay timedelay time）677样品量（sampling volum）681313连续监测时间连续监测时间 （continuous monitoring continuous monitoring timetime）一般为一般为6060120120s s，不少于不少于4 4个吸光度检个吸光度检测点（测点（3 3个吸光度变化值）个吸光度变化值）1414校准液校准液（calibratorcalibrator）个数及浓度个数及浓度 1515校准校准K K值值（calibrate coefficientcalibrate coefficient）或理或理 论论K K值值1616线性范围线性范围（linearity rangelinearity range）1717小数点位数小数点位数（decimal point digitdecimal point digit）6813连续监测时间（continuous monito69（二）备选分析参数（二）备选分析参数 这类分析参数与检测结果的准确性有这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。高等，检测结果可能不准确。69（二）备选分析参数 这类分析参数与检测结果的准确701 1样品预稀释样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。样品进行高倍稀释。2 2底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limitsubstrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确结果不准确。701样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个71可编辑71可编辑723 3前区检查前区检查免疫比浊法中应用，以判断是免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别（值的差别（AA）设置一个限值，如果后一设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。剩，应稀释样品后重测。4 4试剂空白吸光度范围试剂空白吸光度范围超过此设定范围表超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。示试剂已变质，应更换合格试剂。723前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将735 5试剂空白速率试剂空白速率连续监测法中使用，是连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。变化速率。6 6方法学补偿系数方法学补偿系数用于校准不同分析方用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。个参数。7 7参考值范围参考值范围对超过此范围的测定结果，对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示仪器会打印出提示。735试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程74（三）某些参数的特殊意义（三）某些参数的特殊意义 1 1最小样品量最小样品量一般分析仪的最小样品一般分析仪的最小样品量是量是2 2ll，目前也有小至目前也有小至1.61.6ll的。的。2 2最大试剂量最大试剂量 对方法灵敏度很高而线对方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，很重要。性上限低的检测项目，很重要。74（三）某些参数的特殊意义 1最小样品量一般分析仪的最753 3弹性速率弹性速率（flexrateflexrate）在酶活性测定中，当酶活性太高，在连在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率功能，能自动选择反应曲线上连有弹性速率功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如使酶活性测定的线性范围得以扩大。如ASTAST可从可从10001000U/LU/L扩展至扩展至20002000U/LU/L，从而减少稀释从而减少稀释及重测次数、降低成本。及重测次数、降低成本。753弹性速率（flexrate）在酶活性测定中764 4标本空白速率标本空白速率 以胆红素干扰碱性苦味酸法测定肌酐以胆红素干扰碱性苦味酸法测定肌酐为例为例：样品中存在胆红素时，胆红素对碱：样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505505nmnm有有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。素的光吸收呈下降趋势。764标本空白速率 以胆红素干扰碱性苦味酸法测定肌77设置空白速率以消除胆红素干扰 若在加入第一试剂后一段时间内设置试若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图除胆红素的负干扰，见图4-84-8。77设置空白速率以消除胆红素干扰 若在加入第一试剂后78空白速率法消除胆红素对肌酐测定的干扰空白速率法消除胆红素对肌酐测定的干扰 图4-878空白速率法消除胆红素对肌酐测定的干扰 图4-879二、单波长和双波长方式二、单波长和双波长方式 （一）概念（一）概念 采用一个波长检测物质的光吸收强度的方采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为式称为单波长方式单波长方式。当反应液中含有一种组分，。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。使用一个主波长和一个次波长的称使用一个主波长和一个次波长的称双波长双波长方式方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。更好。79二、单波长和双波长方式（一）概念 采用一个80（二）双波长的作用（二）双波长的作用消除噪音干扰消除噪音干扰;减少杂散光影响减少杂散光影响;减少样品本身光吸收的干扰：当样品中存在非减少样品本身光吸收的干扰：当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，双波长红素等时，会产生非特异性的光吸收，双波长方式可以部分消除这类光吸收干扰。方式可以部分消除这类光吸收干扰。80（二）双波长的作用消除噪音干扰;81（三）次波长的确定方法（三）次波长