细胞融合技术

细胞融合技术 第三节本节目标1通过阅读了解通过阅读了解细胞融合技术的一般原理细胞融合技术的一般原理，知道，知道细胞融合的几种诱导方法细胞融合的几种诱导方法。2掌握细胞融合技术掌握细胞融合技术在育种上的应用在育种上的应用，比较细胞，比较细胞融合技术育种与常规的杂交育种的优缺点。融合技术育种与常规的杂交育种的优缺点。3提出自己的提出自己的单克隆抗体的制备方案单克隆抗体的制备方案，通过讨论，通过讨论和相互评价，在自主探究中，掌握单克隆抗体的和相互评价，在自主探究中，掌握单克隆抗体的制备技术及应用，体验科学家的科学探索过程。制备技术及应用，体验科学家的科学探索过程。4、植物体细胞杂交及应用植物体细胞杂交及应用【重点、难点重点、难点】1、细胞融合技术的一般原理，知道细胞融合的几、细胞融合技术的一般原理，知道细胞融合的几种诱导方法。种诱导方法。2、单克隆抗体的制备方案。、单克隆抗体的制备方案。3、植、植物体细胞杂交及应用物体细胞杂交及应用一一.细胞融合技术细胞融合技术阅读课本第30-31页内容，回答问题：1.什么叫细胞融合技术？什么叫细胞融合技术？2.常用的人工诱导细胞融合的方法有哪几种？哪常用的人工诱导细胞融合的方法有哪几种？哪一种重复性强，对原生质体伤害小，方法简单，一种重复性强，对原生质体伤害小，方法简单，可控性强？可控性强？用人工方法诱导细胞融合，并在一定条件下使融合细胞用人工方法诱导细胞融合，并在一定条件下使融合细胞分化再生，形成新物种或新品种的过程。分化再生，形成新物种或新品种的过程。物理法物理法：离心、振动、：离心、振动、电融合技术（电刺激。伤害小，电融合技术（电刺激。伤害小，可控性强）可控性强）化学法化学法：用聚乙二醇（）诱导：用聚乙二醇（）诱导灭活的病毒灭活的病毒：仙台病毒、：仙台病毒、疱疹病毒疱疹病毒等等（适合动物）（适合动物）动物细胞融合（细胞杂交）动物细胞融合（细胞杂交）2个或多个动个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程物细胞结合形成一个细胞的过程细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒融合后形成的细胞称为融合后形成的细胞称为杂交杂交细胞细胞用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核 细胞电融合仪1.1.抗体是由何种细胞产生的？抗体是由何种细胞产生的？2.2.2.2.抗体是如何产生的？抗体是如何产生的？二二.动物细胞融合与动物细胞融合与单克隆抗体单克隆抗体读下面一段文字资料，思考以下问题：读下面一段文字资料，思考以下问题：长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清从动物血清中分离出所需抗体的方法中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得。用这种方法获得的抗体，不仅的抗体，不仅产量低产量低，而且抗体的，而且抗体的特异性差，特异性差，纯度低，反应不够灵敏纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在。人们发现，在动物动物发生免疫反应的过程中，体内的发生免疫反应的过程中，体内的B B细胞可以细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体产生多达百万种以上的特异性抗体，但是，但是每每个个B B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须。要想获得大量的单一抗体，必须用单个用单个B B细胞进行无性繁殖，即克隆细胞进行无性繁殖，即克隆。1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念用单个用单个B B细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。就叫做单克隆抗体。（一）（一）单克隆抗体概念单克隆抗体概念1 1、如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？、如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？单克隆抗体单克隆抗体问题讨论问题讨论提示：提示：1.1.什么样的细胞可以产生抗体？什么样的细胞可以产生抗体？2.2.什么样的细胞可以无限增殖？什么样的细胞可以无限增殖？设计方案：设计方案：一个一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖杂种细胞杂种细胞单克隆抗体单克隆抗体B B淋巴细胞淋巴细胞注射特定注射特定抗原蛋白抗原蛋白骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融合融合（只考虑两两融合）（只考虑两两融合）培养液中细胞有几培养液中细胞有几种类型？融合细胞种类型？融合细胞几种几种类型类型？骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞-B-B淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞淋巴细胞-骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞多种多种杂交细胞杂交细胞在具有筛选作用的培养基上培养在具有筛选作用的培养基上培养专一抗体检验阳性专一抗体检验阳性克隆上述杂交细胞克隆上述杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞检验阳性细胞单克隆抗体单克隆抗体注射到小鼠体内注射到小鼠体内体外培养体外培养（二）、单克隆抗体的制备过程（二）、单克隆抗体的制备过程第第第第1 1 1 1次筛选目的：得到杂次筛选目的：得到杂次筛选目的：得到杂次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。交瘤细胞（多种）。交瘤细胞（多种）。交瘤细胞（多种）。第第第第2 2 2 2次筛选目的：在杂次筛选目的：在杂次筛选目的：在杂次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产交瘤细胞中筛选出能产交瘤细胞中筛选出能产交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细生所需抗体的杂交瘤细生所需抗体的杂交瘤细生所需抗体的杂交瘤细胞。胞。胞。胞。该细胞继承该细胞继承双亲细胞双亲细胞的遗传特性，既能的遗传特性，既能产生专产生专一抗体一抗体又能又能无限增殖无限增殖。杂交瘤细胞有何特点？杂交瘤细胞有何特点？特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高腹腔注射法腹腔注射法诊断疾病诊断疾病（识别作用，（识别作用，如同位素标记单克隆抗如同位素标记单克隆抗体，可诊断肿瘤、心血体，可诊断肿瘤、心血管畸形等）管畸形等）（三）（三）单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用优点：优点：准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物（主要用于癌症治疗，也可运主要用于癌症治疗，也可运载药物，如载药物，如“生物导弹生物导弹”）（导向作用，导向作用，作为载体，作为载体，生物导弹生物导弹=单克隆抗体单克隆抗体+药物，药物，治疗肿瘤）治疗肿瘤）（位置准确、疗效高、副作用小）（位置准确、疗效高、副作用小）（位置准确、疗效高、副作用小）（位置准确、疗效高、副作用小）诊断乳腺癌单克隆抗体诊断乳腺癌单克隆抗体小结小结两个过程两个过程动物细胞融合过程动物细胞融合过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程“一二三一二三”二次筛选二次筛选筛选杂交瘤细胞、能筛选杂交瘤细胞、能产生所需抗体的杂交瘤细胞产生所需抗体的杂交瘤细胞一个新细胞一个新细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞三个优势三个优势产量大、特异性产量大、特异性强、灵敏度高强、灵敏度高(理化性质单一理化性质单一)的优势的优势单克隆抗体单克隆抗体三、三、植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术与作物育种与作物育种杂交的两个细胞杂交的两个细胞用纤维素酶、果胶酶处用纤维素酶、果胶酶处理细胞壁理细胞壁（酶解法）（酶解法）原生质体、原生质体、经离心、振经离心、振动、电刺激动、电刺激用聚乙二醇用聚乙二醇（）（）诱导诱导融合后的原生质体融合后的原生质体再生细胞壁再生细胞壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化细胞分裂细胞分裂愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株再分化再分化（植物体细胞植物体细胞融合完成的标融合完成的标志志）植植物物细细胞胞融融合合植物植物组织组织培养培养白菜白菜甘蓝甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝植物体细胞杂交意义？p33细胞融合技术可以避免细胞融合技术可以避免受精过程，受精过程，在在亲缘关系亲缘关系较远的物种间实现基因较远的物种间实现基因转移，创造出自然界没转移，创造出自然界没有的新物种。有的新物种。意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，实现种间遗传物质的重组实现种间遗传物质的重组2 2、动植物细胞在结构上有何区别？这与它们动植物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？杂交或融合过程有什么影响？3 3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？方法有哪些？离心、振动、电激等物理方法；离心、振动、电激等物理方法；聚乙二醇诱导等聚乙二醇诱导等化学方法化学方法问题讨论问题讨论动物细胞无细胞壁，动物细胞融合过程中不动物细胞无细胞壁，动物细胞融合过程中不须去除细胞壁和再生出细胞壁。须去除细胞壁和再生出细胞壁。、植物体细胞杂交最终得到的是完整的植物个体，、植物体细胞杂交最终得到的是完整的植物个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？不能，只能得到杂交细胞不能，只能得到杂交细胞4 4、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？有其他方法吗？能能 ，还可以利用灭活的病毒（生物还可以利用灭活的病毒（生物方法）进行诱导方法）进行诱导问题讨论问题讨论、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？原理是否相同？相同，都是细胞膜的流动性相同，都是细胞膜的流动性问题讨论问题讨论7 7、植物细胞融合有什么意义？植物细胞融合有什么意义？6 6、为什么要用、为什么要用灭活灭活的病毒？的病毒？病毒一般对生物体是有伤害的。病毒一般对生物体是有伤害的。仙台病毒仙台病毒物理或物理或物理或物理或化学方法化学方法化学方法化学方法丧失感染活性丧失感染活性保留融合活性保留融合活性克服远缘杂交不亲和的障碍，克服远缘杂交不亲和的障碍，实现种间遗传物质的重组。实现种间遗传物质的重组。免疫小鼠免疫小鼠培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融合融合B B淋巴细胞淋巴细胞注射特定注射特定抗原蛋白抗原蛋白选择培养基上培养选择培养基上培养专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性注射到小鼠体内注射到小鼠体内体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体克隆杂交细胞克隆杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞专一抗体，检验阳性细胞多种杂交细胞多种杂交细胞杂交瘤细胞有何特点？杂交瘤细胞有何特点？本过程利用的那些技术？本过程利用的那些技术？动物细胞融合技术动物细胞融合技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术是否注射抗原是否注射抗原（只考虑两两融合）培养（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？几液中细胞有几种类型？几种融合细胞？种融合细胞？两次筛选的目的两次筛选的目的分别是什么？分别是什么？（二）（二）、单克隆抗体制备过程、单克隆抗体制备过程与传统制备的抗体相与传统制备的抗体相比具有什么特点？比具有什么特点？植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较细胞工程胞工程植物体植物体细胞胞杂交交动物物细胞融合胞融合实质内容内容改改变遗传物物质、产生新的性状，生新的性状，获得得细胞胞产品品(使后代具有双使后代具有双亲的的特性特性)理理论基基础细胞膜的流胞膜的流动性性;植物植物细胞全能性胞全能性细胞膜的流胞膜的流动性性;细胞增殖胞增殖诱导手段手段物理法：离心、振物理法：离心、振动、电激激化学法：聚乙二醇化学法：聚乙二醇物理法：离心、振物理法：离心、振动、电激激化学法：聚乙二醇化学法：聚乙二醇生物法：生物法：灭活的病毒活的病毒诱导过程程去去细胞壁胞壁(纤维素素酶酶、果胶、果胶酶酶)原生原生质体融合体融合(获得得杂种原生种原生质体体)植物植物细胞培养胞培养(获得植株得植株)获得分离的得分离的单个个动物物细胞胞(胰蛋白胰蛋白酶酶处理理)诱导融合融合动物物细胞培养胞培养(细胞胞产品品)应用用获得白菜得白菜甘甘蓝等等杂种植物种植物主要用于主要用于单克隆抗体的制克隆抗体的制备(杂交瘤交瘤细胞胞)1.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案抗体实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群A体外培养体外培养注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔C体外培养体外培养不能，未对小鼠免疫处理不能，未对小鼠免疫处理2.人人CD20单克隆抗体是治疗一些恶性肿瘤的特效药物，目前主要是通过培养单克隆抗体是治疗一些恶性肿瘤的特效药物，目前主要是通过培养哺乳动物细胞的方式生产。我国科学家已哺乳动物细胞的方式生产。我国科学家已 培育出世界上第一头转入了培育出世界上第一头转入了CD20抗体基因的转基因牛，可以从它产抗体基因的转基因牛，可以从它产 的牛奶中直接提取的牛奶中直接提取CD20抗体。这项技术抗体。这项技术成熟后，有望使这一特效药成熟后，有望使这一特效药 的生产成本降至现在的的生产成本降至现在的1/10。请回答：。请回答：(1)单克隆抗体的制备过程需先将单克隆抗体的制备过程需先将_和和 _融合，这一过程的诱导方法与植物体细胞杂融合，这一过程的诱导方法与植物体细胞杂交不同的是交不同的是_。(2)动物细胞培养需要在含动物细胞培养需要在含_混合气体的培混合气体的培养箱中进行，培养液中通常需加入养箱中进行，培养液中通常需加入_等一些天等一些天然成分。然成分。(3)转基因技术的核心是转基因技术的核心是_。该过程。该过程用到的工具酶有用到的工具酶有 _和和_。经过免疫的经过免疫的B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞用灭活的病毒诱导用灭活的病毒诱导95%O2加加5%CO2动物血清动物血清重组载体的构建重组载体的构建限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(限制酶限制酶)DNA连接酶连接酶3.野生马铃薯品种的植株具有较强的抗病、抗虫、抗盐碱、抗野生马铃薯品种的植株具有较强的抗病、抗虫、抗盐碱、抗寒能力，但块茎不能食用。俄、德、芬兰专家共同做实验研究，寒能力，但块茎不能食用。俄、德、芬兰专家共同做实验研究，用野生马铃薯与马铃薯的体细胞进行杂交，培育出了生活能力强用野生马铃薯与马铃薯的体细胞进行杂交，培育出了生活能力强的杂交系马铃薯。据图分析回答问题：的杂交系马铃薯。据图分析回答问题：(1)过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解，其中过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解，其中“酶解酶解”所用的酶应该包括所用的酶应该包括_。(2)过程可用聚乙二醇过程可用聚乙二醇(PEG)，其目的是，其目的是_。纤维素酶、果胶酶纤维素酶、果胶酶诱导原生质体融合诱导原生质体融合(3)请用文字和箭头表示出请用文字和箭头表示出技术过程的实验流程：技术过程的实验流程：_。由此过程可以看出植物细胞有形成完整个体的可能性，这是由此过程可以看出植物细胞有形成完整个体的可能性，这是_的表现。的表现。(4)在培养基上培养一段时间后，原生质体会再生出细胞壁。可在培养基上培养一段时间后，原生质体会再生出细胞壁。可以取样，通过以取样，通过_实验来鉴别细胞实验来鉴别细胞壁是否已经再生。壁是否已经再生。(5)请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处：请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处：_。融合细胞融合细胞 愈伤组织愈伤组织 幼苗幼苗植物细胞具有全能性植物细胞具有全能性植物细胞的质壁分离与复原植物细胞的质壁分离与复原可以克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍可以克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍4下图为细胞融合的简略过程，请据图回答：下图为细胞融合的简略过程，请据图回答：(1)若若A、B是植物细胞，在细胞融合之前已用是植物细胞，在细胞融合之前已用_处理，除去处理，除去_；A、B到细胞到细胞C的过程中，常用的物理方法是的过程中，常用的物理方法是_。融。融合完成的标志是合完成的标志是_.(2)若若A、B是植物细胞，则形成的是植物细胞，则形成的D细胞还要应用细胞还要应用_技术把技术把D培养培养成植株。成植株。(3)若若A、B是动物细胞，一般取自是动物细胞，一般取自_,然后然后用用_使其分散开来，使其分散开来，A、B到到C的过程中，常用的不同于植物细胞的的过程中，常用的不同于植物细胞的手段是手段是_，所形成的，所形成的D称为称为_(4)若该过程是制备单克隆抗体，若该过程是制备单克隆抗体，A为小鼠为小鼠B淋巴细胞，那么，在获得此细胞之前，淋巴细胞，那么，在获得此细胞之前，小鼠已被注射了小鼠已被注射了_，注射后小鼠身体产生了相应的，注射后小鼠身体产生了相应的_，生成了，生成了_。图中。图中B为为_。(5)若该过程仍是制备单克隆抗体，在若该过程仍是制备单克隆抗体，在A、B到到C的过程中，所形成的的过程中，所形成的C有有_种，用来培养的种，用来培养的D的细胞应该是的细胞应该是_。从中选择出它的方法是。从中选择出它的方法是_培养，获得培养，获得D后，常用的培养方法是后，常用的培养方法是_和和_。纤维素酶和果胶酶纤维素酶和果胶酶细胞壁细胞壁电刺激、振动、离心电刺激、振动、离心 产生细胞壁产生细胞壁植物组织培养植物组织培养动物胚胎或幼龄动物的器官或组织动物胚胎或幼龄动物的器官或组织胰蛋白酶胰蛋白酶灭活的病毒诱导灭活的病毒诱导杂杂交细胞交细胞效应效应B细胞细胞 抗原抗原抗体和记忆细胞抗体和记忆细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞3杂交瘤细胞杂交瘤细胞用特定的选择培养基用特定的选择培养基培养基中培养培养基中培养 小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖(1)AB(2)CD5.（09山东）人类在预防与诊疗传染性疾病中，经常使用疫苗和山东）人类在预防与诊疗传染性疾病中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病病原体为抗体。已知某传染性疾病病原体为RNA病毒，该病毒表面病毒，该病毒表面A蛋蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：请回答：请回答：（1）过程）过程代表的是代表的是_。（2）过程）过程构建构建A基因表过载体时，必须使用基因表过载体时，必须使用_和和 _两种工具酶。两种工具酶。（3）过程）过程采用的实验技术是采用的实验技术是_，获得的，获得的X是是_。（4）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的产的 _ 所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，从所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行_比较；或用图中的比较；或用图中的_进行特异性结合进行特异性结合检测。检测。逆转录逆转录限制酶(限制性内切酶）DNA连接酶细胞融合杂交瘤细胞 A蛋白 核酸（基因）序列抗A蛋白的单克隆抗体