细胞凋亡及机制检测

细胞凋亡细胞凋亡（科普诗）（科普诗）apoptosis似秋叶的凋零，似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡;n危难中的细胞啊，危难中的细胞啊，n你沉稳不乱，你沉稳不乱，nDNA片片切割，片片切割，n化云梯直通天堂；化云梯直通天堂；n细胞体分团相聚，细胞体分团相聚，n把生命的凝重浓集在小体上；把生命的凝重浓集在小体上；n分别了朝夕相处的伙伴，分别了朝夕相处的伙伴，n再见了快乐美好的时光；再见了快乐美好的时光；n这一切的一切又融入临近的胞体，这一切的一切又融入临近的胞体，n腾出的空间再写生命的篇章。腾出的空间再写生命的篇章。n典型的典型的凋亡小体（凋亡小体（apoposis boby）：）：由透亮空泡和不透由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部分光的浓密的核碎片两部分组成。组成。坏死坏死 凋亡凋亡1.性质性质病理性病理性,非特异性非特异性生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性2.诱导因素诱导因素 强烈病理性刺激强烈病理性刺激,随机发生随机发生生理性或较弱病理性刺激，非随机发生理性或较弱病理性刺激，非随机发生生3.生化特点生化特点 被动过程被动过程,无新蛋白合成无新蛋白合成,不不耗能耗能耗能的主动过程，有新蛋白合成耗能的主动过程，有新蛋白合成4.形态变化形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩固缩,膜可发泡成芽膜可发泡成芽,形成凋亡小体形成凋亡小体5.DNA电泳电泳弥散性降解，电泳呈均一弥散性降解，电泳呈均一DNA片状片状DNA片段化（片段化（180-120bp）,电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带6.炎症反应炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体凋亡小体无无有有8.基因调控基因调控无无有有细胞凋亡与坏死的比较细胞凋亡与坏死的比较2002年年10月月7日英国人悉尼日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖面的研究获诺贝尔生理与医学奖。Sydney BrennerH.Robert HorvitzJohn E.Sulston 细胞凋亡与疾病发生机制的细胞凋亡与疾病发生机制的新认识新认识1.该该“死死”的细胞（如的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞）未死未死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。之一。细胞凋亡不足细胞凋亡不足2.不该不该“死死”的细胞（如的细胞（如神经元、心肌细胞神经元、心肌细胞）死死了了，这与老年性痴呆、心肌缺血，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等再灌注损伤等发病有关。发病有关。细胞凋亡过度细胞凋亡过度胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程1.凋亡信号转导凋亡信号转导2.凋亡基因激活凋亡基因激活3.细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行4.凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除凋亡过程及分期诱导期诱导期 执行期执行期 消亡期消亡期 凋凋亡亡诱诱导导因因素素受受体体cAMPCa2+神神经经酰酰胺胺死死亡亡信信号号凋凋亡亡相相关关基基因因激激活活Dnase激活激活Capases激活激活巨噬细胞巨噬细胞吞噬细胞吞噬细胞凋亡细胞凋亡细胞细胞凋亡的生化改变细胞凋亡的生化改变1.DNA的片段化的片段化“梯梯”状条带状条带2.内源性核酸内切酶激活及其作用内源性核酸内切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（凋亡蛋白酶（caspases）的激活）的激活 及其作用及其作用1.DNA的片段化的片段化“梯梯”状条带为细胞状条带为细胞凋亡主要特征凋亡主要特征几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致解，导致DNA 的断裂；的断裂；DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解；白和其它核蛋白的降解；染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础；和形态改变的基础；DNA fragmentation是凋亡的是凋亡的“golden marker”。2.2.内源性核酸内切酶激活及其内源性核酸内切酶激活及其作用作用n由一系列胞内信号转导环节激活，由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质执行染色质DNADNA切割切割3.Caspase 9 激活，需要通过激活，需要通过CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素、细胞色素c、ATP等多个因子的参与等多个因子的参与Caspases在凋亡中的主要作用在凋亡中的主要作用n1.灭活灭活细胞凋亡的抑制物（如细胞凋亡的抑制物（如Bcl-2Bcl-2）；）；n2.2.水解水解细胞的蛋白质结构，细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，导致细胞解体，形成形成凋亡小体（凋亡小体（apoposis boby）；）；n3.在凋亡级联反应中水解在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白相关活性蛋白，使，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能该蛋白获得或丧失某种生物学功能细胞凋亡的调控（一）细胞凋亡相关因素1.诱导性因素诱导性因素2.抑制性因素抑制性因素(二)细胞凋亡信号的转导1.细胞凋亡的诱导因素细胞凋亡的诱导因素.生理活性因子：生理活性因子：TNF家族家族(Fas-L,TNF)、TGF、神经递质、神经递质(谷氨酸、多巴胺谷氨酸、多巴胺)、生、生长长 因子撤退、因子撤退、GC等等.损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等基、癌基因、抑癌基因、放射线等.化疗药物化疗药物.毒素：乙醇、毒素：乙醇、-淀粉样肽淀粉样肽2.细胞凋亡的抑制因素细胞凋亡的抑制因素.凋亡相关基因的抑制作用：凋亡相关基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。等。.生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒、杆状病毒p35、棒、棒状病毒状病毒IAP、牛痘病毒、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等等.药物：药物：Calpain抑制剂、抑制剂、caspases抑制剂、抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂促癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等等(二二)细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导凋亡信号转导系统特点凋亡信号转导系统特点n 多样性：不同种类的细胞系统不同多样性：不同种类的细胞系统不同n 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联联n 同一性：多因素，共用同一系统触发同一性：多因素，共用同一系统触发n 多途性：同一诱导因素启动多条信号转多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径导途径细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导诱导信号诱导信号cellR神经酰胺神经酰胺多途径多途径RSAPK/JNKP53 基因基因NF-kB,JNK/AP-1途径途径激活激活bax or 下调下调bcl-2ROSmtDNA细胞凋亡相关基因细胞凋亡相关基因n抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：bcl-2bcl-2n促进凋亡基因：促进凋亡基因：fas fas，P53P53n双向调控基因：双向调控基因：c-myc c-myc，bclxbclxn研研究究较较多多的的有有c-myc、bcl-2、p53、Ice、Fas/APO-1等。等。1.c-mycnc-myc诱诱导导细细胞胞增增殖殖，也也能能诱诱导导细细胞胞凋凋亡亡。当当生生长长因因子子存存在在，bcl-2基基因因表表达达时时，促促进进细细胞胞增增殖殖，反反之之细细胞凋亡。胞凋亡。n第第一一个个被被确确认认有有抑抑制制凋凋亡亡作作用用的的基基因因，存存在在于于线线粒体外膜、核膜及部分内质网中。粒体外膜、核膜及部分内质网中。nbcl-2相当于线虫的相当于线虫的ced9。nBcl-2家家族族可可分分为为两两类类，一一类类是是抗抗凋凋亡亡的的，如如：Bcl-2；一一类类是是促促进进凋凋亡亡的的，如如：Bax、Bad、Bid，以二聚体形体发挥作用。，以二聚体形体发挥作用。2.bcl-2Bcl-2Bcl-2抗凋亡机制抗凋亡机制n直接的抗氧化直接的抗氧化n抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质n抑制促凋亡的抑制促凋亡的BaxBax，BakBak细胞毒作用细胞毒作用n抑制抑制CaspasesCaspases激活激活n维持细胞钙稳态维持细胞钙稳态n3.fas nfas又称作APO-1或CD95，属TNF受体和NGF受体家族。对细胞凋亡有促进作用n基因产物为45KD的跨膜蛋白。nFas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。n与线虫ced-3同源，又称为Caspase。nICE是一种半胱氨酸蛋白酶，在人类，是一种半胱氨酸蛋白酶，在人类，ICE家族家族至少有至少有11个成员，每一成员均含有与底物结合及个成员，每一成员均含有与底物结合及催化的保守序列，识别位点在催化的保守序列，识别位点在Asp之后，故又称之后，故又称Caspases。n n 启动子启动子Caspases：Caspases8、9和和10n 效应子效应子Caspases：Caspases3、6、74.ICE蛋白酶家族蛋白酶家族n5.Apaf-1n与线虫的ced-4同源；n在线粒体参与的凋亡途径中发挥作用；n能激活Caspase3，这一过程需要细胞色素c和Caspase9的参与。6.p53 磷酸化磷酸化p53使细胞处于使细胞处于G1期，必要时诱导细胞凋亡。期，必要时诱导细胞凋亡。p21 CDK RB不被磷酸化不被磷酸化 G1DNA损伤损伤 p53 并磷酸化并磷酸化 Bax ,Bcl apoptosis Gadd45 DNA修复修复野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能“分子警察”；细胞凋亡发生机制细胞凋亡发生机制n（一）氧化损伤一）氧化损伤n（二）钙稳态失衡（二）钙稳态失衡n (三三)线粒体损伤线粒体损伤（一）氧化损伤机制（一）氧化损伤机制n氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态后果：诱导细胞凋亡。氧化应激引起细胞凋亡的可能机制氧化应激引起细胞凋亡的可能机制n1.氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因引起细胞凋亡。n2.氧自由基引起的DNA损伤可活化多聚ADP核糖合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗，引发细胞凋亡。n3.氧自由在攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，通过脂质过氧化作用直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡；此外细胞膜上不饱和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化产物过氧羟基24碳四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用。氧化应激引起细胞凋亡的可能机制（续）氧化应激引起细胞凋亡的可能机制（续）n4.氧化应激可激活Ca2+/Mg2+依赖的DNase，也可产生膜的发泡现象。n5.氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加，诱导细胞凋亡。自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡。n6.氧化应激可活化核转录因子NF-B、AP-1，可加速细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋亡。（二）钙稳态失衡引起细胞凋亡（二）钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制的可能机制n1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降解DNA链；n2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；n3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；n4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。(三)线粒体损伤细胞凋亡的恶性网络假说细胞凋亡的恶性网络假说线粒体线粒体 m PTP开放开放 Apaf+Cyt.C AIFCaspase抑制剂抑制剂+Caspase 9酶原酶原Caspase-9Caspase3酶原酶原Caspase-3蛋白质水解蛋白质水解无活性核无活性核酸内切酶酸内切酶内切酶激活内切酶激活DNA断裂断裂+Bcl-2Ca2+apoptosis？氧化损伤氧化损伤钙稳态失衡钙稳态失衡线粒体损伤线粒体损伤恶性网络假说恶性网络假说(deleterious network hypothesis)细胞凋亡 m AIF，ApafPTP open细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生物学意义1.1.发育发育 从低等动物到高等动物的发育，都存从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。在着程序性细胞死亡的现象。2.2.免疫系统免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终伴随着细胞凋亡。始终伴随着细胞凋亡。3.3.衰老衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接的联系。或间接的联系。4.4.损伤与修复损伤与修复 5.5.肿瘤发生肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。细胞增殖与死亡的速度平衡失调。6.6.病毒致病病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。病毒表达抗凋亡蛋白。Hutchinson-Gilford syndrome 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病（一）细胞凋亡不足（一）细胞凋亡不足1.肿瘤2.自身免疫病 1.凋亡与恶性肿瘤凋亡与恶性肿瘤 肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与凋亡障碍有关。还与凋亡障碍有关。Oncogenes “anti-apoptic”genes Cell division cell death 肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡 2.凋亡与免疫系统功能障碍凋亡与免疫系统功能障碍 凋亡对免疫系统功能有重要调节作用凋亡对免疫系统功能有重要调节作用 淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；在晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋在晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋亡。亡。胸腺发育过程中的自然凋亡过程胸腺发育过程中的自然凋亡过程（二）细胞凋亡过度（二）细胞凋亡过度1.心血管疾病心血管疾病（1）心肌缺血）心肌缺血 与缺血与缺血-再灌注损伤再灌注损伤（2）心力衰竭）心力衰竭（1）心肌缺血和再灌注损伤）心肌缺血和再灌注损伤 心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞数量的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞数量有限，故而凋亡细胞可以激发性引起炎有限，故而凋亡细胞可以激发性引起炎性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导致心肌组织坏死（心肌梗塞）。致心肌组织坏死（心肌梗塞）。(2)凋亡与心脏病凋亡与心脏病 心脏传导障碍和心律失常心脏传导障碍和心律失常 心脏传导系统在胚胎早期就已形成。心脏传导系统在胚胎早期就已形成。新生儿窦房结主要有大量起搏细胞（新生儿窦房结主要有大量起搏细胞（P细细胞）和少量胶原组成，而成人则为少量胞）和少量胶原组成，而成人则为少量P细胞和大量胶原构成，可能是细胞和大量胶原构成，可能是P细胞凋亡细胞凋亡的结果。因此的结果。因此P细胞凋亡不足或过度均可细胞凋亡不足或过度均可引起心律失常。引起心律失常。2.神经元退性疾病神经元退性疾病（1）阿尔茨海默病）阿尔茨海默病(AD)（2）帕金森病）帕金森病（3）多发性硬化症）多发性硬化症(1)凋亡与神经退行性病变凋亡与神经退行性病变 神经元是神经元是non-proliferating,long-lived,terminally differentiated cell。神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义：神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义：1、避免细胞重新进入细胞周期，特别是遇、避免细胞重新进入细胞周期，特别是遇 到致转化刺激信号时。如向终末分化的到致转化刺激信号时。如向终末分化的 细胞中转染细胞中转染oncogene可引起细胞凋亡，可引起细胞凋亡，而非增殖。而非增殖。(2)(2)为了器官生存的需要为了器官生存的需要 A deleted cell is more advantageous than a damaged cell,even when the cell is irreplaceable.This is analogous to what is frequently referred to as“better dead than wrong”for dividing cell 3.病毒感染 人免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的AIDS(凋亡与免疫缺陷性疾病凋亡与免疫缺陷性疾病)典型例子是典型例子是AIDS1.HIV-1感染后可引起感染后可引起CD4+T淋巴细胞的淋巴细胞的 凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体 gp120介导。介导。2.AIDS患者外周血淋巴细胞患者外周血淋巴细胞Fas/Apo水平水平 明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。由此，通过控制凋亡过程是否可以预由此，通过控制凋亡过程是否可以预防或延缓防或延缓AIDS的进展。的进展。（三）细胞凋亡不足与三）细胞凋亡不足与过度并存过度并存动脉粥样硬化动脉粥样硬化即属于这种情况，对内即属于这种情况，对内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细胞来说则是凋亡不足细胞来说则是凋亡不足细胞凋亡在疾病防治中的意义细胞凋亡在疾病防治中的意义1.合理利用凋亡相关因素合理利用凋亡相关因素2.干预凋亡信号转导干预凋亡信号转导3.调节凋亡相关基因调节凋亡相关基因4.控制凋亡相关的酶学机制控制凋亡相关的酶学机制5.防止线粒体跨膜电位的下降防止线粒体跨膜电位的下降n1.1.合理利用凋亡相关因素合理利用凋亡相关因素n抑凋亡：抑凋亡：NGFNGF老年性痴呆老年性痴呆n急性急性T T细胞白血病：低剂量放射线、细胞白血病：低剂量放射线、TNFTNF 促凋亡：促凋亡：局部肿瘤热疗；高温局部肿瘤热疗；高温4343、30min30minn前列腺癌：前列腺癌：去势治疗去势治疗n2.2.干预凋亡信号转导干预凋亡信号转导nFAS/FASL信号系统：阿霉素刺激信号系统：阿霉素刺激nSPP（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增殖信号，拮抗凋亡殖信号，拮抗凋亡AIDS，ADn3.调节凋亡相关基因调节凋亡相关基因n野生型野生型P53基因转染基因转染n4.控制凋亡相关的酶控制凋亡相关的酶n核酸内切酶核酸内切酶：Ca 2+/Mg 2+依赖性依赖性nCa 2+Mg 2+激活；激活；Zn 2+抑制抑制nCaspases:Ca2+直接或间接激活直接或间接激活n5.防止线粒体跨膜电位的下降防止线粒体跨膜电位的下降n环胞霉素环胞霉素A(cyclosporinA,免疫抑制剂）免疫抑制剂）阻抑阻抑 m，其衍生物无免疫抑制作用，其衍生物无免疫抑制作用，但有稳定但有稳定 m 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 随着研究技术的提高和对凋亡的认识随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。色质到分子水平日趋完善和成熟。n1.1.形态学检测形态学检测n2.DNA2.DNA降解分析降解分析n3.3.凋亡酶学分析凋亡酶学分析n4.4.凋亡相关蛋白分析凋亡相关蛋白分析n5.5.流式细胞分析流式细胞分析一细胞凋亡的形态学分析一细胞凋亡的形态学分析 细胞凋亡的形态学变化主要表现为：细胞凋亡的形态学变化主要表现为：细胞皱缩细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细胞，失去细胞连接连接(cell junction)，微绒毛，微绒毛(microvilli)消失，发泡消失，发泡(blebbing)，染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的新月状体缩的新月状体(crescents)，形成凋亡小，形成凋亡小体体(apoptotic body)等。等。细胞凋亡的形态学检测方法细胞凋亡的形态学检测方法 检测方法检测方法 可鉴定凋亡细胞特征可鉴定凋亡细胞特征 光学显微镜光学显微镜 相差显微镜相差显微镜 透射电镜透射电镜 聚焦激光扫聚焦激光扫 描电镜描电镜 扫描电镜扫描电镜 流式细胞仪流式细胞仪 缩时摄影术缩时摄影术细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞发泡、凋亡小体细胞发泡、凋亡小体微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体凋亡小体凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位细胞膜表面泡状鼓起细胞膜表面泡状鼓起低前向散射光低前向散射光(FSC)、高侧向散射光、高侧向散射光(SSC)凋亡细胞的形成过程凋亡细胞的形成过程二二.DNA降解分析降解分析nDNA降解过程的特点：降解过程的特点：n1.发生于凋亡早期，由内源性核酸内切发生于凋亡早期，由内源性核酸内切酶激活引起酶激活引起n2.DNA在核小体连接部位断裂，产生在核小体连接部位断裂，产生180200bp为最小单位的单体或寡聚为最小单位的单体或寡聚体片断体片断n3.DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体小体 n(一一)DNA凝胶电泳凝胶电泳n 原理：凋亡细胞降解产生一系列规原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的则的DNA片断，其电泳结果呈典型的片断，其电泳结果呈典型的“梯状带梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后坏；而坏死或凋亡后坏死细胞的死细胞的DNA分解是随机的，产生的碎分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电泳时形成片分子量大小不一，在电泳时形成“涂片状涂片状”(smear)。n 普通琼脂糖凝胶电泳、普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影、放射自显影(32PdATP或或32PdCTP连接到连接到DNA片断的片断的3 端端)n(二二)原位标记法原位标记法nTUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。原位缺口末端标记技术。n原理：在原理：在TdT的作用下，带有标记物的的作用下，带有标记物的dUTP被连接在断裂被连接在断裂DNA3末端，然后通过相应的方末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。n应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞片、培养细胞、组织中分离的细胞 n(三三)ELISA法法n 原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗合，再加入抗-DNA片断片断-POD复合物，复合物，与核小体中的与核小体中的DNA片断结合，最后加入片断结合，最后加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度以显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。进行定量分析。三三.凋亡酶学分析凋亡酶学分析n1.内切核酸酶内切核酸酶(endonuclease,DNase)n 种类：种类：DNase （内质网、高尔基体（内质网、高尔基体),DNase（溶酶体、胞核（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，（胞核，胸腺细胞中胸腺细胞中)等等n 作用：作用：使使DNA断裂成断裂成180200bp或其倍或其倍数的片断数的片断n 激活机制：激活机制：CAD(caspase-activate DNase)n ICAD(inhibtor of CAD)n 检测：检测：Western BlottingnCaspases的检测的检测n 1.Caspase-3活性测定活性测定(FIENA法法)n 荧光测定免疫吸附法荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay,FIENA),caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物乙可作用于连接荧光素的特异底物乙酰化天冬氨酸酰化天冬氨酸-谷氨酸谷氨酸-颉氨酸颉氨酸-天冬氨酰胺天冬氨酰胺(Ac-DEVD),产生发荧光的裂解产物产生发荧光的裂解产物AFC，且，且caspase-3活性与活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自由分解的量或自由荧光荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检测产生荧光的强弱成正比，故可定量检测n 2.蛋白印迹法蛋白印迹法n Caspases作用底物的检测作用底物的检测n PARP89kD的检测的检测四四.凋亡相关蛋白分析凋亡相关蛋白分析n1.Bcl-2家族家族n 促进凋亡：促进凋亡：Bax,Bal,Bcl-Xs,Bad,Bid,Bik,Bim,Hrk,Bok等等n 抑制凋亡：抑制凋亡：Bcl-2,Bcl-Xl,Bcl-w,Mcl-1,A1/Bfl-1等等n 均含有均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过结构域，通过此结构域以二聚体形式调控凋亡。此结构域以二聚体形式调控凋亡。n2.其他相关蛋白其他相关蛋白n p53,Myc,Fas等等 五、流式细胞分析五、流式细胞分析（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。加以分选的现代细胞分析技术。FCM分析细胞凋亡的方法分析细胞凋亡的方法n一一.细胞形态分析细胞形态分析n二二.细胞膜结构与功能改变分析细胞膜结构与功能改变分析n三三.细胞细胞DNA含量分析含量分析n四四.TUNEL法法