分子荧光分析法经典课件

*15721572：西班牙植物学家：西班牙植物学家：西班牙植物学家：西班牙植物学家N.MonardesN.Monardes观察到荧光现象观察到荧光现象观察到荧光现象观察到荧光现象18551855：Stokes Stokes 研究荧光，提出作为一种分析手段研究荧光，提出作为一种分析手段研究荧光，提出作为一种分析手段研究荧光，提出作为一种分析手段18651865：GoppelsroderGoppelsroder首次应用方法首次应用方法首次应用方法首次应用方法18861886：提出荧与化学结构关系的经验法则：提出荧与化学结构关系的经验法则：提出荧与化学结构关系的经验法则：提出荧与化学结构关系的经验法则19681968：JetteJette和和和和West West 第一台光电荧光计第一台光电荧光计第一台光电荧光计第一台光电荧光计19561956：第一台商品化的荧光分光光度计：第一台商品化的荧光分光光度计：第一台商品化的荧光分光光度计：第一台商品化的荧光分光光度计特点：特点：特点：特点：1)1)灵敏度高（灵敏度高（灵敏度高（灵敏度高（1-100 ppb)1-100 ppb)：有的可达：有的可达：有的可达：有的可达0.01ppb0.01ppb；2)2)选择性强；选择性强；选择性强；选择性强；3)3)方法简单快速，用样量少方法简单快速，用样量少方法简单快速，用样量少方法简单快速，用样量少;4)4)提供比较多的物理参数。提供比较多的物理参数。提供比较多的物理参数。提供比较多的物理参数。荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理*特点：荧光分析的基本原理3.1 3.1 荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理*分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。荧光和磷光:当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出特殊性，会发出比吸收波长更长比吸收波长更长的不同波长的可见光，的不同波长的可见光，当紫外光照射停止时当紫外光照射停止时,随之消失的光叫做随之消失的光叫做荧光荧光，不立即，不立即消失的光叫消失的光叫磷光磷光。3.1 荧光分析的基本原理*分子发光：处于基态的分子吸收能量3.1 3.1 荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理*分分子子能能级级=电电子子能能级级(Ee)+振振动动能能级级(Ev)+转动能级转动能级(Er)。电子激发的多重度：电子激发的多重度：M=2s+1Pauli不相容原理：分子中同一轨不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。反的自旋方向，即自旋配对。单单重重态态:如如果果分分子子中中全全部部轨轨道道里里的的电子都是自旋配对的电子都是自旋配对的,s=0,M=1三三重重态态：电电子子在在跃跃迁迁过过程程中中还还伴伴随着自旋方向的改变，随着自旋方向的改变，s=1,M=3S0S1S2T1T23.1.1分子发光的产生 3.1 荧光分析的基本原理*分子能级=电子能级(Ee)+振动*去去活活化化发发射射光光子子非非辐辐射射跃跃迁迁化化学学反反应应荧光荧光磷光磷光振动驰豫振动驰豫系间跨越系间跨越内转换内转换外转换外转换激发光去除后，荧光立即消失激发光去除后，荧光立即消失激发光去除后，磷光不会立即消失激发光去除后，磷光不会立即消失熄灭或猝灭熄灭或猝灭3.1 3.1 3.1 3.1 荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理荧光分析的基本原理3.1.1分子发光的产生*去活化发射光子非辐射跃迁化学反应荧光磷光振动驰豫系间跨越内3.1.2 激发光谱和发射光谱*激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）激激发发光光谱谱形形状状与与吸吸收收光光谱谱形形状状完完全全相相似，经校正后二者完全相同！似，经校正后二者完全相同！发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器信号显信号显示系统示系统单色器单色器3.1.2 激发光谱和发射光谱*激发光谱:固定测量波长(选荧光激发光谱与发射光谱的特征*a.Stokesa.Stokes位移位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。射之间产生了能量损失。b.b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 分子被激发到高于分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振电子态的最低振动能级动能级 尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。荧光体被激发至哪一个电子态无关。无论激发波长是无论激发波长是1还是还是2，荧光的波长都是，荧光的波长都是23.1.2 激发光谱和发射光谱 激发光谱的形状与发射波长也无关激发光谱的形状与发射波长也无关荧光激发光谱与发射光谱的特征*a.Stokes位移3.1.2*exex=290nm =290nm(MAX)(MAX)固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX)固定固定固定固定 exex=290nm(MAX)=290nm(MAX)emem=620nm 620nm(MAX)(MAX)S S0 04 43 32 21 1S S1 14 43 32 21 11 1 4 41 1 3 31 1 2 21 11 11 1 4 41 1 4 41 1 2 21 1 1 1c.c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等*ex=290nm(MAX)固定em=620nm(M*200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱*200250300350400450500荧光激发光谱荧光*3.1.3 3.1.3 荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子荧光产生的必备条件分子必须能够吸收激发光分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率分子必须具有一定的荧光量子产率影响因素：荧光产生过程中，影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；辐射和无辐射过程；与每一过程的速率常数有关；与每一过程的速率常数有关；kf 分子结构决定（内因）；分子结构决定（内因）；主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。*3.1.3 荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子*n 振动弛豫振动弛豫激发激发 n荧光荧光（1）跃迁类型：）跃迁类型：具有具有 电子跃迁类型的结构电子跃迁类型的结构 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命10-710-9s串越至三重态几率小*振动弛豫激发 荧光（1）跃迁类型：具有*共轭度越大，荧光越强。共轭度越大，荧光越强。原因原因：共轭体系越大，离域大共轭体系越大，离域大共轭体系越大，离域大共轭体系越大，离域大 键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。产生。产生。产生。化合物化合物化合物化合物苯苯苯苯萘萘蒽蒽蒽蒽丁丁丁丁 省省省省戊戊戊戊 省省省省 exexmaxmax(nm)(nm)205205286286365365390390580580 ememmaxmax (nm)(nm)278278322322400400480480642642 F F0.110.110.290.290.460.460.600.600.520.52（2）具有大的共轭键结构*共轭度越大，荧光越强。化合物苯萘*0.9210.18（3）具在刚性平面结构*0.9210.18*1 1）给电子取代剂加强荧光）给电子取代剂加强荧光）给电子取代剂加强荧光）给电子取代剂加强荧光（4 4）取代基效应）取代基效应）取代基效应）取代基效应HNHN2 2，NHR NHR，NRNR2 2，OH OH，OR OR，CN CN产生产生产生产生 p p 共轭共轭共轭共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光二苯甲酮：弱荧光、强磷光二苯甲酮：弱荧光、强磷光二苯甲酮：弱荧光、强磷光S S1 1 T T1 1的的的的系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近1 1化合物化合物化合物化合物苯苯苯苯苯酚苯酚苯酚苯酚苯胺苯胺苯胺苯胺苯基氰苯基氰苯基氰苯基氰苯甲醚苯甲醚苯甲醚苯甲醚 ememmax max(nm)(nm)278310278310285365285365310405310405280390280390285345285345相对荧光强度相对荧光强度相对荧光强度相对荧光强度101018182020202020202 2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光C=0C=0，COOH COOH，NONO2 2不产生不产生不产生不产生 p p 共轭共轭共轭共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光硝基苯：不产生荧光、弱磷光硝基苯：不产生荧光、弱磷光硝基苯：不产生荧光、弱磷光*1）给电子取代剂加强荧光（4）取代基效应HN2，N*空间位阻对荧光发射的影响空间位阻对荧光发射的影响空间位阻对荧光发射的影响空间位阻对荧光发射的影响3 3）取代基的位置）取代基的位置）取代基的位置）取代基的位置反式二苯乙烯反式二苯乙烯反式二苯乙烯反式二苯乙烯强荧光物质强荧光物质强荧光物质强荧光物质 F F=0.750.75 F F=0.030.03立体异构体对荧光发射的影响立体异构体对荧光发射的影响立体异构体对荧光发射的影响立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯顺式二苯乙烯顺式二苯乙烯顺式二苯乙烯非荧光物质非荧光物质非荧光物质非荧光物质*空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯F=*含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。（5 5）重原子取代基效应）重原子取代基效应）重原子取代基效应）重原子取代基效应ClCl，Br Br，IIS S1 1 T T1 1的系间窜跃由于重原子的存在增强的系间窜跃由于重原子的存在增强的系间窜跃由于重原子的存在增强的系间窜跃由于重原子的存在增强*含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。（5）*3.1.4 3.1.4 溶液的荧光强度溶液的荧光强度1 1 荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系当lc0.05*3.1.4 溶液的荧光强度1 荧光强度与溶液浓度的关系当*2 影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的环境因素1）溶剂对荧光强度的影响一般溶一般溶剂效效应介介电常数、折射率常数、折射率特殊溶特殊溶剂效效应溶溶剂与与荧光物光物质间的特殊作用的特殊作用溶剂溶剂相对介电常数相对介电常数荧光峰荧光峰/nm/nm荧光效率荧光效率乙腈乙腈38.238.24104100.0660.066丙酮丙酮21.321.34054050.0550.055氯仿氯仿5.55.53983980.0460.046四氯化碳四氯化碳2.242.243903900.0020.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率极性增加，荧光效率增加；粘度增加，荧光效率增加*2 影响荧光强度的环境因素1）溶剂对荧光强度的影响一般溶剂*2 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素2）温度对荧光强度的影响随着温度的增高，荧光物质溶液的随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低荧光量子产率及荧光强度将降低 不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱（在邻二苯中）碰撞几率增大碰撞几率增大粘度降低粘度降低*2 影响荧光强度的因素2）温度对荧光强度的影响随着温度的增3）介质酸度的影响*2 2 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素具酸或碱性基团的有机物质，在不同具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，荧光体的存在值时，荧光体的存在型体不同，不同的型体型体不同，不同的型体(分子与其离子分子与其离子)在电子构型上有所不同，在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别 苯胺：弱的有机碱苯胺：弱的有机碱 在碱性溶液在碱性溶液pH712中以分子形式存在，蓝色强荧光中以分子形式存在，蓝色强荧光在酸性在酸性pH13以离子形式存在，荧光弱。以离子形式存在，荧光弱。3）介质酸度的影响*2 影响荧光强度的因素具酸或碱性基团的3 3 溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭*荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的现象现象1）碰撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞碰撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞2）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧 光配合物光配合物3）转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧4）发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与Fe2+5）荧光物质自猝灭）荧光物质自猝灭3 溶液荧光的猝灭*荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光*3.2 3.2 荧光光谱仪荧光光谱仪吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器信号显信号显示系统示系统3.2.1 3.2.1 荧光光谱仪基本结构荧光光谱仪基本结构单色器单色器与紫外与紫外-可见可见光谱仪的不同光谱仪的不同*3.2 荧光光谱仪吸收池光源检测器单色器信号显示系统3.2*光源光源光源光源1.1.光源的要求：光源的要求：光源的要求：光源的要求：v v发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱v v光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小v v有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命2.2.氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源 高压汞光源高压汞光源高压汞光源高压汞光源波长范围：波长范围：波长范围：波长范围：2001000nm2001000nm工作压力：工作压力：工作压力：工作压力：520 atm520 atm启动电压：启动电压：启动电压：启动电压：2040KV2040KV使用寿命：使用寿命：使用寿命：使用寿命：10002000h10002000h最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射波长范围宽发射波长范围宽发射波长范围宽 发射光强度大发射光强度大发射光强度大发射光强度大*光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱2.氙灯*单色器单色器单色器单色器第一单色器：在光源与第一单色器：在光源与样品池之间，滤去不需样品池之间，滤去不需要的光，得到所需要的要的光，得到所需要的激发光。激发光。第二单色器：在样品池第二单色器：在样品池与检测器之间，滤去溶与检测器之间，滤去溶剂、容器表面散射光，剂、容器表面散射光，瑞利和拉曼光以及杂质瑞利和拉曼光以及杂质发出的散射光等，获得发出的散射光等，获得待测物质发射的荧光。待测物质发射的荧光。光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器问题：问题：问题：问题：荧光分光光度计与荧光分光光度计与荧光分光光度计与荧光分光光度计与紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计有何可见分光光度计有何可见分光光度计有何可见分光光度计有何异同点？异同点？异同点？异同点？*单色器第一单色器：在光源与样品池之间，滤去不需要的光，得到*检测器检测器检测器检测器光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管 放大倍数：放大倍数：放大倍数：放大倍数：2 2 2 2n n n n 5 5 5 5n n n n;n=10,10;n=10,10;n=10,10;n=10,103 3 3 3 101010107 7 7 7，最大最大最大最大101010108 8 8 8 101010109 9 9 9样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池样品池：液池、荧光池1.1.样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样2.2.吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围波长范围波长范围波长范围3.3.使用注意事项使用注意事项使用注意事项使用注意事项容易破碎容易破碎容易破碎容易破碎问题：问题：问题：问题：紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？沾污问题沾污问题沾污问题沾污问题*检测器光电倍增管样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫*3.3 3.3 分子荧光分析法的应用分子荧光分析法的应用3.3.1 3.3.1 荧光分析法分类荧光分析法分类一、直接荧光法一、直接荧光法问题：基体干扰较为严重问题：基体干扰较为严重芳香族有机化合物分析芳香族有机化合物分析二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）衍生化法或荧光探针法衍生化法或荧光探针法待测物与衍生化试剂发生化学反应待测物与衍生化试剂发生化学反应3.3.2 3.3.2 荧光定性分析荧光定性分析与标准品的激发和发射光谱谱图进行对照与标准品的激发和发射光谱谱图进行对照三、荧光分析法特点三、荧光分析法特点1)灵敏度高（灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达：有的可达0.01ppb；2)选择性强；选择性强；3)方法简单快速，用样量少方法简单快速，用样量少;4)提供比较多的物理参数。提供比较多的物理参数。*3.3 分子荧光分析法的应用3.3.1 荧光分析法分类一、3.3.3 荧光定量分析荧光定量分析*定量依据定量依据1.标准曲线法（校准曲线法）标准曲线法（校准曲线法）2.单点校正法（标准对比法）单点校正法（标准对比法）c1c2c3c4c5cxcscxA sA xcs和和cx应很接近应很接近3.3.3 荧光定量分析*定量依据1.标准曲线法（校准曲线*3.3.4 3.3.4 荧光分析法的应用荧光分析法的应用1 1 无机化合物的荧光分析无机化合物的荧光分析衍生化法：与荧光试剂形成荧光配合物衍生化法：与荧光试剂形成荧光配合物*3.3.4 荧光分析法的应用1 无机化合物的荧光分析衍生化*3.3.4 3.3.4 荧光分析法的应用荧光分析法的应用2 2 有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析3 3 生物大分子的荧光分析生物大分子的荧光分析直接法：可测定的化合物很少直接法：可测定的化合物很少衍生化法：与荧光试剂形成共价化合物衍生化法：与荧光试剂形成共价化合物待测物待测物试剂试剂 exexmaxmax ememmaxmax测定范围测定范围 ppmppm丙三醇丙三醇苯胺苯胺紫外紫外蓝色蓝色0.120.12糠醛糠醛蒽酮蒽酮4654655055051.5151.515氨基酸氨基酸氧化酶氧化酶3153154254250.01500.0150维生素维生素A A无水乙醇无水乙醇345345490490020020蛋白质蛋白质曙红丫曙红丫紫外紫外5405400.0660.066肾上腺素肾上腺素乙二胺乙二胺4204205255250.0010.030.0010.03 青霉素青霉素-甲氧基甲氧基-氯氯-(-(-氨氨乙基乙基)-)-氨基氮杂蒽氨基氮杂蒽4204205005000.06250.6220.06250.622玻璃酸梅玻璃酸梅3-3-乙酰氧基吲哚乙酰氧基吲哚3953954704700.0010.0320.0010.032胍基丁胺胍基丁胺邻苯二醛邻苯二醛3653654704700.0560.056四氧嘧啶四氧嘧啶苯二胺苯二胺3653654854851010-4-4*3.3.4 荧光分析法的应用2 有机化合物的荧光分析3 生