分子病理学技术课件

分子病理学技术及其应用分子病理学技术及其应用南京大学医学院附属鼓楼医院病理科 王景美分子病理学技术及其应用南京大学医学院附属鼓楼医院病理科 1分子病理学定义分子病理学定义v由分子生物学、医学遗传学和病理学相结合所形成的交叉学科。v研究基于体细胞基因突变及其产物异常的疾病，研究它们的发生和发展机制。v应用分子生物学和分子遗传学的原则、理论和技术来确诊遗传性疾病、发育异常性疾病、感染性疾病和恶性肿瘤，从而阐明这些疾病的自然史，并为临床医生提供与治疗有关的信息。v借用遗传学、基因组学和蛋白质组学所创建的方法，在DNA、RNA和蛋白质三个层次来实现。分子病理学定义由分子生物学、医学遗传学和病理学相结合所形成的2 传统病理学传统病理学 分子病理学分子病理学 研究内容研究内容 组织形态学 遗传学、基因组学 及蛋白质组学研究对象研究对象 目标病灶或细胞(群)DNA,RNA,Protein研究手段研究手段 形态学观察 分子生物学及医学 遗传学技术优点优点 “金标准”高敏感性、高特异性，定性，定量缺点缺点 主观判断 要求较高，影响因素多分子病理学与传统病理学的区别分子病理学与传统病理学的区别 传统病理学 3分子病理学技术课件4分子病理学的发展分子病理学的发展1990年人类基因组计划的成功实施使得医学进入了分子时代。上世纪九十年代，分子生物学理论和方法引进病理学，形成了分子病理学。近年来，FISH、感染原的PCR诊断、基因重排等分子诊断技术，已从实验室研究走向临床实际医疗工作。国内尚处于起步阶段。分子病理学的发展1990年人类基因组计划的成功实施使得医学进5分子病理学常用技术分子病理学常用技术qPCR及原位PCR技术q原位杂交(ISH)及荧光原位杂交(FISH)q限制性核酸内切酶片断长度多态性分析(RFLP)q基因突变分析和核酸序列分析q生物芯片分子病理学常用技术PCR及原位PCR技术6PCR基因诊断技术PCR基因诊断技术7核 酸 化 学8核酸化学核酸化学-组成与结构组成与结构v核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，分核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两种vDNA主要存在于细胞核染色质中，携带遗传信息；RNA主要存在于细胞质中(90%)，参与细胞内遗传信息的表达v构成核苷酸的碱基主要有五种：A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。vDNA为一反向平行的互补双链结构，碱基互补配对（A=T,G C)核酸化学-组成与结构核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大9核酸化学核酸化学-理化性质理化性质一般理化性质变性：DNA分子中的两条链分开形成单链的过程复性：分开的单链分子按照碱基互补原则重新形成 双链的过程核酸化学-理化性质一般理化性质10中心法则中心法则-决定生命的法则决定生命的法则DNA是自身复制的模板DNA通过转录作用将遗传信息传递给中间物质RNARNA通过翻译作用将遗传信息表达成蛋白质中心法则-决定生命的法则DNA是自身复制的模板11DNA双螺旋结构示意图双螺旋结构示意图DNA双螺旋结构示意图12PCR技术原理及特点技术原理及特点PCR技术原理及特点13PCR基本原理基本原理是一种选择性体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷 酸引物介导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异性DNA序列反应分为三步：（1）变性(denature):通过加热使DNA双链解离形成单链（2）退火(anneal):突然降低温度使引物和互补的模板杂交（3）延伸(extension):以引物为起始点的DNA链延伸反应 一个变性退火延伸的过程就是一个循环PCR基本原理是一种选择性体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩14PCR原理示意图原理示意图PCR原理示意图15PCR技术的发明及发展技术的发明及发展v1985年Mullis教授发明了PCR技术vPCR技术首先应用于人-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断vPCR技术在短短几年内广泛应用于分子生物学、微生物学、遗传学等生物学的各个领域v1988年PCR技术在我国开展PCR技术的发明及发展1985年Mullis教授发明了PCR16PCR技术的特点技术的特点q敏感性高q特异性强q快速、简便q可扩增RNA或cDNAq存在的一些问题PCR技术的特点敏感性高17几种常用几种常用PCR技术类型技术类型l二温式PCRl逆转录PCR（RT-PCR)l巢式或套式PCR（Nested PCR)l多重PCR（Multiplex-PCR)l定量PCRl不对称PCR（asymmetric PCR)l其它几种常用PCR技术类型二温式PCR18PCR技术主要仪器设备技术主要仪器设备o离心机oPCR仪o电泳装置o紫外分光光度计o其他：超纯水制造系统、计量仪器、通风设备PCR技术主要仪器设备离心机19热循环扩增加样(灭菌水、10 PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶）操作程序操作程序制备DNA标本电泳、观察热循环扩增加样操作程序制备DNA标本电泳、观察20标本的来源及取样标本的来源及取样l组织标本：新鲜组织标本或冰冻组织、石蜡包埋组织、脱落细胞l体液及排泄物：全血、血清、唾液、尿液、胸水、腹水、羊水、生殖道分泌物等l细菌培养物标本的来源及取样组织标本：新鲜组织标本或冰冻组织、石蜡包埋组21DNA模板的制备模板的制备DNA沉淀组织处理破碎细胞，消化蛋白质（EDTA、SDS等去污剂/加热/碱等的作用蛋白酶K）DNA纯化（除去蛋白质、多糖及脂类等生物大分子）DNA模板的制备DNA沉淀组织处理破碎细胞，消化蛋白质DNA22酚氯仿提取法加热法碱变性法表面活性剂裂解法常用常用DNA模板制备方法模板制备方法酚氯仿提取法常用DNA模板制备方法23PCR扩增体系的基本成分扩增体系的基本成分引物Taq DNA聚合酶10 PCR缓冲液MgCl24dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)模板DNA其他PCR扩增体系的基本成分引物24PCR条件的优化条件的优化l引物lMg2l温度循环参数l其他PCR条件的优化引物25PCR扩增产物的分析扩增产物的分析琼脂糖凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法PCR扩增产物的分析琼脂糖凝胶电泳法26注意事项注意事项预防污染：隔离不同操作区、分装试剂、改进实验操作、结果的重复性污染源的追踪：设立阳性及阴性对照、选择合适引物、环境污染污染的处理：稀酸处理法、UV照射法注意事项预防污染：隔离不同操作区、分装试剂、改进实验操作、结27PCR技术的临床应用技术的临床应用病原体检测遗传性疾病的基因诊断肿瘤基因的检测PCR技术的临床应用病原体检测28PCR技术检测病原体技术检测病原体v病毒检测：肝炎病毒、HIV、HPV、HSV、CMV等v细菌检测：肠道致病菌、呼吸道致病菌、脑膜炎双球菌、林球菌等v其他病原体：寄生虫、衣原体、支原体、梅毒螺旋体等PCR技术检测病原体病毒检测：29PCR技术在遗传性疾病诊断中的应用技术在遗传性疾病诊断中的应用l地中海性贫血（珠蛋白基因突变或缺失/珠蛋白基因突变）l镰状细胞性贫血（珠蛋白基因突变）l苯丙酮尿症l血友病l其他：视网膜色素变性、先天性肾上腺皮质增生PCR技术在遗传性疾病诊断中的应用地中海性贫血（珠蛋白基因30PCR技术检测肿瘤基因技术检测肿瘤基因l基因重排l癌基因检测：Ras,C-myc,CerbB2 l抑癌基因检测:p53,APC,BRCA PCR技术检测肿瘤基因基因重排31基基 因因 重重 排排基 因 重 排32原理 正常造血细胞向B或T淋巴系定向分化时，发生特异性Ig和(或)TCRs基因重新组合，使结构上分散排列在DNA上的V、D、J基因片段发生重排，形成了免疫球蛋白和T细胞受体复杂和多样性的功能基因，经PCR扩增后产生多个基因片段，电泳呈弥漫涂片状。发生肿瘤时，淋巴细胞的增殖是克隆性的，免疫球蛋白和T细胞受体基因重排的功能受抑。经PCR扩增后产生单一(单克隆性)基因条带 原理 正常造血细胞向B或T淋巴系定向分化时，发生特异性33基因重排原理示意图基因重排原理示意图基因重排原理示意图34引物、引物配制及产物引物、引物配制及产物IgHIgH引物：引物：引物：引物：FR3A、LJH 、VLJH(半巢式PCR扩增，最终产物80120bp左右的条带)TCRTCR 混合引物：混合引物：混合引物：混合引物：V区引物I (mix1)：V2、V3、V4、V8、V9V区引物II (mix2)：V5、V10、V11、V12 J区引物 (mix3)：JGT12、JGT3、JGT4(mix1+mix3及mix2+mix3分别扩增，最终产物170230bp左右的条带)引物浓度：引物浓度：引物浓度：引物浓度：20pmoles/L引物、引物配制及产物IgH引物：FR3A、LJH、VL35PCRPCR方法方法反应体系反应体系反应体系反应体系2525 l l(模板DNA 5l,10PCR缓冲液2.5 l，10mM dNTP 0.5l,25mM MgCl2 1.54 l,上下游引物各20pmoles,Taq酶0.625U,灭菌双蒸水补足至25l)PCRPCR循环程序：循环程序：循环程序：循环程序：94C 5min 94C 1min 72C 1min 72C 10min (35个循环)55C 1min PCR方法反应体系25l(模板DNA 5l,1036阳性结果判定标准阳性结果判定标准v带宽不超过1mm，边缘整齐v条带在期望的碱基大小范围之内v如背景上无smear，又无引物二聚体则表示PCR扩增的失败，而非阴性结果v如出现期望大小之外的其他条带，均应视为人工假相，不能作为判定依据阳性结果判定标准带宽不超过1mm，边缘整齐37分子病理学技术课件38IgH基因重排出现在B-NHL约为75%，在T-NHL占10%20%。几乎所有的T细胞肿瘤和约40%69%的B细胞肿瘤均有TCR基因重排IgH、TCR基因重排在NHL、反应性淋巴细胞增生性淋巴结炎及恶性组织细胞病的鉴别诊断中具有重要意义克隆性IgH、TCR基因重排的检测，对NHL、ALL、MM和CLL等淋巴细胞来源肿瘤的诊断和鉴别诊断，对NHL的早期骨髓浸润和预后判断具有重要意义IgH基因重排出现在B-NHL约为75%，在T-NHL占39