高效液相色谱技术课件_002

2024/7/31第第三三章章高效液相色谱分析高效液相色谱分析highperformanceliquidchromatograph2024/7/31教学目标及要求：教学目标及要求：1.掌握液相色谱的特点；掌握液相色谱的特点；2.掌握液相色谱法的分类；掌握液相色谱法的分类；3.了解影响液相色谱峰扩展及色谱分离的因素；了解影响液相色谱峰扩展及色谱分离的因素；4.理解液相色谱分离的原理；理解液相色谱分离的原理；5.了解液相色谱的固定相和流动相；了解液相色谱的固定相和流动相；6.了解液相色谱仪的组成和结构原理及主要部件；了解液相色谱仪的组成和结构原理及主要部件；7.了解液相色谱分离类型的选择；了解液相色谱分离类型的选择；8.了解液相色谱的应用。了解液相色谱的应用。教学重点、教学难点：教学重点、教学难点：1.高效液相色谱与气相色谱的异同点高效液相色谱与气相色谱的异同点2.高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用3.分离柱和流动相的选择和匹配分离柱和流动相的选择和匹配4.不同种类液相色谱分离的原理上的差异不同种类液相色谱分离的原理上的差异2024/7/31第一节第一节高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述Generalizationofhighperformanceliquidchromatograph一、概述一、概述Generalization二、高效液相色谱仪二、高效液相色谱仪HPLC三、高效液相色谱法的特点三、高效液相色谱法的特点featureofHPLC四、流程及主要部件四、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC2024/7/31高效液相色谱法：高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。化和应用范围广的特点。一、概述一、概述Generalization2024/7/31(一一一一)、HPLCHPLC与经典与经典与经典与经典LCLC区别区别区别区别经典液相色谱经典液相色谱高效液相色谱高效液相色谱常压或减压常压或减压填料颗粒大填料颗粒大柱效低柱效低分析速度慢分析速度慢色谱柱只用一次色谱柱只用一次 不能在线检测不能在线检测高压，高压，404050MPa50MPa填料颗粒小，填料颗粒小，2 250m 50m 柱效高柱效高,40000,400006000060000块块/m/m 分析速度快分析速度快 色谱柱可重复多次使用色谱柱可重复多次使用 能在线检测能在线检测2024/7/31(二二二二)、HPLCHPLC与与与与GCGC异同点异同点异同点异同点气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分析只能分析挥发性物质，只能分析20%20%的化合物的化合物不能用于热不稳定物质的分析不能用于热不稳定物质的分析用毛细管色谱可得到很高的柱效用毛细管色谱可得到很高的柱效有很灵敏的检测器如有很灵敏的检测器如ECDECD和较灵和较灵敏的通用检测器（敏的通用检测器（FIDFID和和TCDTCD）流动相为气体，无毒，易于处理流动相为气体，无毒，易于处理 运行和操作容易运行和操作容易 仪器制造难度较小仪器制造难度较小几乎可以分析各种物质几乎可以分析各种物质 可以用于热不稳定物质的分析可以用于热不稳定物质的分析色谱柱不能很长，柱效不会很色谱柱不能很长，柱效不会很高高没有较高灵敏的通用检测器没有较高灵敏的通用检测器 流动相有毒，费用较高流动相有毒，费用较高 运行和操作比运行和操作比GCGC难一些难一些 仪器制造难度大仪器制造难度大近来出现的蒸发激光光散射检测器（近来出现的蒸发激光光散射检测器（ELSD）是灵敏度较高的通用检测器）是灵敏度较高的通用检测器2024/7/31流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。vHPLC：流动相为液体流动相为液体组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性可以增大分离选择性操作条件差别操作条件差别GC：加温操作加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）2024/7/31二、液相色谱仪器二、液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph2003年全球液相色谱市场的总销售额为年全球液相色谱市场的总销售额为25.16亿美金，亿美金，2010年预计将达到年预计将达到33.83亿美金。亿美金。国内对液相色谱仪的需求量越来越大：国内对液相色谱仪的需求量越来越大：2000年版中国药典规定用液相色谱仪对药物的最终质量控制和检验，较之年版中国药典规定用液相色谱仪对药物的最终质量控制和检验，较之95版药典有了大幅度的增加；我国的医药生产、新药开发以及中草药的研版药典有了大幅度的增加；我国的医药生产、新药开发以及中草药的研究都大大增加了对液相色谱的需求；究都大大增加了对液相色谱的需求；色谱分析已被列为全国化学及相关专业大学生的必修课，全国近色谱分析已被列为全国化学及相关专业大学生的必修课，全国近1000所所大学学生实验用液相色谱仪的需求量将相当可观；大学学生实验用液相色谱仪的需求量将相当可观；随着国家对环境保护和生态平衡的更加重视，随着国家对环境保护和生态平衡的更加重视，“十五十五”期间全国各地的环期间全国各地的环境监测站也已逐步配备液相色谱仪及其他分析仪器，对水质、大气和土壤境监测站也已逐步配备液相色谱仪及其他分析仪器，对水质、大气和土壤进行监控；进行监控；我国进出口国际贸易近年来快速增长，并还将持续大幅度增长，而色谱分我国进出口国际贸易近年来快速增长，并还将持续大幅度增长，而色谱分析方法及其色谱析方法及其色谱质谱联用技术是世界公认的商品检验手段之一，只有高质谱联用技术是世界公认的商品检验手段之一，只有高质量的色谱仪、色质联用仪和高水平的检验结果才可能被世界各国认可，质量的色谱仪、色质联用仪和高水平的检验结果才可能被世界各国认可，没有足够数量的高质量色谱仪器和色质联用仪就难以没有足够数量的高质量色谱仪器和色质联用仪就难以“与世界接轨与世界接轨”。我国液相色谱仪的发展远远落后于气相色谱仪的发展，目前国内使用的液我国液相色谱仪的发展远远落后于气相色谱仪的发展，目前国内使用的液相色谱仪相色谱仪90%以上均是进口产品。以上均是进口产品。2004年市场调查报告2024/7/31液相色谱仪（液相色谱仪（1）2024/7/31液相色谱仪（液相色谱仪（2）2024/7/31液相色谱仪（液相色谱仪（3）2024/7/31液相色谱仪（液相色谱仪（4）2024/7/31美.瓦里安 Prostar 210 高效液相色谱仪2024/7/31三、三、高效液相色谱法的特点和应用高效液相色谱法的特点和应用特点：特点：“三高三高三高三高”“”“一快一快一快一快”“”“一广一广一广一广”高柱效高柱效n=104片片/米，柱效高（远高于一般米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高灵敏度(紫外：紫外：10-9g；荧光：；荧光：10-11g)高选择性高选择性分析速度快分析速度快(1h)应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%有机化合物有机化合物）（是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）（是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）2024/7/31四、流程及主要部件四、流程及主要部件processandmainassemblyofHPLC1.1.流程流程液相色谱流程图液相色谱流程图PUMPDetectorWData station(Recorder)or Collection2024/7/312.主要部件主要部件P83(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（甲酰胺甲酰胺乙腈乙腈甲醇甲醇乙醇乙醇丙醇丙醇丙酮丙酮二氧六环二氧六环四氢呋喃四氢呋喃甲乙酮甲乙酮正丁醇正丁醇乙酸乙酯乙酸乙酯乙醚乙醚异丙醚异丙醚二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)2024/7/314.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。器时，流动相不应有紫外吸收。选择高效液相中溶剂的示意图选择高效液相中溶剂的示意图2024/7/31一、影响分离的因素一、影响分离的因素factorsinfluencedseparation二、分离类型的选择二、分离类型的选择choiceofseparationtypes三、液相色谱的应用三、液相色谱的应用applicationofHPLC四、液相制备色谱四、液相制备色谱preparativeliquidchromatography第五节第五节影响分离的因素与操作条件的选择影响分离的因素与操作条件的选择factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition2024/7/31一、影响分离的因素一、影响分离的因素factorsinfluencedseparation1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径在在高高效效液液相相色色谱谱中中,液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，则则速速率率方方程程中中的的分分子子扩扩散散项项B/U较较小小，可可以以忽忽略略不不计，即：计，即：H=A+C u故液相色谱故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。2024/7/31液液体体的的黏黏度度比比气气体体大大一一百百倍倍，密密度度为为气气体体的的一一千千倍倍，故故降低传质阻力是提高柱效主要途径。降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。改善分离的最直接的因素。2024/7/312.流速流速流速大于流速大于0.5cm/s时时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。选择参数。3.固定相及分离柱固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2024/7/31速率方程速率方程可简化为：可简化为：Dm、Ds试样分子在流动相、固定液中的扩散系数试样分子在流动相、固定液中的扩散系数关键是将关键是将H变小，而变小，而H变小关键是使变小关键是使dp变小，变小，df变小。变小。因此采用因此采用35 m固定相颗粒，且键合相层薄，因此固定相颗粒，且键合相层薄，因此df就就小，由于小，由于H很小，很小，n很多，很多，R大改进，实现了高效。大改进，实现了高效。在分离良好的基础上，才可提高流动相线速，节省了在分离良好的基础上，才可提高流动相线速，节省了分析时间，从而实现了高速分离。分析时间，从而实现了高速分离。如何实现高速分离？如何实现高速分离？2024/7/31影响色谱峰扩展的因素影响色谱峰扩展的因素2024/7/31二、分离类型选择二、分离类型选择choiceofseparationtypes2024/7/31三、三、HPLC的的应用应用applicationofHPLC1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(3750 m)流动相：正己烷流动相：正己烷流流速：速：1.5mL/min色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器2024/7/312.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。固定相固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水100%甲醇甲醇线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min流流速：速：1mL/min柱柱温：温：50C柱柱压：压：70 104Pa检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器2024/7/31四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱preparativeliquidchromatography获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径半制备柱（内径8mm，长度长度1530cm），），一次制备量一次制备量.1mg；1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降降低低10%为宜。为宜。2024/7/312.液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离为主成分（富集）后，再次分离制备。制备。2024/7/313.制备型液相色谱制备型液相色谱制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径制备柱：内径2050mm，柱长柱长50cm。2024/7/31一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理featureandprincipleofSFC二、超临界流体色谱仪的结构流程二、超临界流体色谱仪的结构流程structureandgeneralprocessofSFC三、超临界流体色谱的应用三、超临界流体色谱的应用applicationofSFC第七节第七节超临界色谱超临界色谱supercriticalfluidchromatograph,SFC2024/7/31一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1.概述概述超超临临界界流流体体：在在高高于于临临界界压压力力与与临临界界温温度度时时，物物质质的的一一种种状态。性质介于液体和气体之间。状态。性质介于液体和气体之间。超超临临界界流流体体色色谱谱(SFC)，80年年代代快快速速发发展展，具具有有液液相相、气气相相色谱不具有的优点色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比）比LC有更高的柱效和分离效率。有更高的柱效和分离效率。2024/7/312.超临界流体性质超临界流体性质（1）性质介于液体和气体之间）性质介于液体和气体之间;具具有有气气体体的的低低黏黏度度、液液体体的的高高密密度度，扩扩散散系系数数位位于于两两者者之间。之间。（2）可可通通过过改改变变超超临临界界流流体体的的密密度度（程程序序改改变变）调调节节组组分分分分离离（类类似似于于气气相相色色谱谱的的程程序序升升温温，液液相相色色谱谱中中的的梯梯度度淋淋洗）。洗）。超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。2024/7/313.原理SFC的流动相的流动相：超临界流体；超临界流体；CO2、N2O、NH3SFC的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和和毛细管柱毛细管柱SFC；分离机理：分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；被分离；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；保留值；2024/7/31压力效应压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小；，柱压降对分离的影响小；压力效应：在压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。时间缩短。CO2流动相，当压力改变：流动相，当压力改变：7.09.0106Pa，则：则：C16H34的保留时间的保留时间25min5min。2024/7/31程序升压2024/7/31HPLC与SFC比较2024/7/31二、二、超临界流体色谱的结构与流程超临界流体色谱的结构与流程instrumentstructureandthegeneralprocessofSFC1.1.结构流程结构流程 2024/7/312.主要部件（1）SFC的高压泵的高压泵无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；计算机控制流动相的密度和流量；（2）SFC的色谱柱和固定相的色谱柱和固定相可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；2024/7/31主要部件（3）流动相）流动相SFC的流动相的流动相：超临界流体；超临界流体；CO2、N2O、NH3CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；等改性；（4）检测器）检测器可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器检测器2024/7/31三、三、超临界流体色谱的应用 application of SFC1.聚苯醚低聚物的分析聚苯醚低聚物的分析色谱柱：色谱柱：10m63mi.d.毛细管柱，毛细管柱，固定相：固定相：键合二甲基聚硅氧烷；键合二甲基聚硅氧烷；流动相：流动相：CO2；柱温：；柱温：120 C；程序升压；程序升压；2024/7/312.甘油三酸酯的分析四四种种组组分分仅仅双双键键数数目目和和位位置置不不同同，难难分离；分离；色谱柱：色谱柱：DB-225SFC毛细管柱；毛细管柱；流动相：流动相：CO2；从；从15MPa程序升压到程序升压到27MPa；2.5hr完全分完全分离。离。2024/7/31第七节第七节毛细管电泳毛细管电泳（Capillaryelectrophoresis，CE）一、概述一、概述在外加电场的作用下，带电的胶体粒子或离子在分散的介质中作定向移动（泳动）的现象称为电泳。不同带电粒子由于荷电量不同，分子的大小不同，泳动的速度也就不同，因此、电泳是一种适合于带电胶体粒子和离子的分离分析技术。电泳现象电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度电渗流现象电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基,pH3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度。2024/7/31分离过程分离过程电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。2024/7/31高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（1）2024/7/31高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（2）2024/7/31高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（3）2024/7/31三维毛细管电泳系统（AgilentCE，美国Agilent公司）高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（4）2024/7/31特点：特点：使用散热效率很高的毛细管（2550m）可以减少电泳时产生的焦耳热而导致的区域展宽，因而可以采用较高的电压（2030kV），有利于获得很高的分离效率，每米塔板数可达几十万，高者可达106，分析时间一般小于30min，试样分析范围宽，检测限低。进样量少，可达nl级，极微量的成分也可检出，且样品无需进行复杂的前处理，就可分离分析。高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子；4分钟可分离10种蛋白质.试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。2024/7/31应用范围：应用范围：在中、西药物等分析领域广泛地被应用，同时也广泛地向生命科学领域的各个方面渗透，大量用于氨基酸、蛋白质、肽、低聚核苷的分离，对糖蛋白、糖肽型化合物的研究也正在进行之中。其中生物碱、有机酸等所有带电或不带电的化合物均可进行定量检测,蛋白质、糖肽、糖蛋白则可得到很好的分离分析。2024/7/31二、构造二、构造 主要包括高压电源、毛细管、检测器和贮液槽四个部分。主要包括高压电源、毛细管、检测器和贮液槽四个部分。2024/7/31三、三、CE的分离模式的分离模式v1、毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresisCZE）v2、毛细管凝胶电泳（capillarygelelectrophoresisCGE）v3、胶束电动力学毛细管电泳（micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC或MEKC）v4、毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocusingCIEF）v5、毛细管等速电泳（capillaryisotachoporesis，CITP）v6、毛细管电渗色谱（capillaryelectroosmoticchromatography，CEC)种类较多，实际应用不多，多用于科学研究种类较多，实际应用不多，多用于科学研究主要原因重现性不高主要原因重现性不高2024/7/312024/7/31第八节第八节薄层色谱法薄层色谱法TLC（一）概述（一）概述1定义：定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程：操作过程：铺板活化点样展开定位(定性)/洗脱(定量)3分离机制分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻）4特点：特点：分析快速、灵敏、显色方便5应用：应用：药物杂质检查、纯度测定2024/7/312024/7/31（二）定性参数（二）定性参数1.比移值比移值RfRf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为。2024/7/311）K大，Rf小2）薄层板一定，对于极性组分展开剂极性大，Rf大（容易洗脱）展开剂极性小，Rf小（不容易洗脱）3）Rf范围：0Rf1（组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离）Rf=0.20.8（常用）0.30.5（最佳）2024/7/31参考物与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于12.相对比移值相对比移值Rs2024/7/31（三）吸附剂的选择（三）吸附剂的选择（三）吸附剂的选择（三）吸附剂的选择根据被测物极性和吸附剂的吸附能力被测物极性强弱极性吸附剂被测物极性弱强极性吸附剂（四）展开剂的选择（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择）根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性2024/7/312024/7/31（五）薄层板的制备（五）薄层板的制备定性分析窄条定量分析1020cm（六）定性与定量分析（六）定性与定量分析定性分析日光，紫外光，显色定量分析洗脱法，薄层扫描法硅胶硅胶GG自含粘和剂自含粘和剂硅胶硅胶HH不含粘和剂，铺板时另加入不含粘和剂，铺板时另加入CMCCMC硅胶硅胶FH254FH254含荧光剂，含荧光剂，254nm254nm紫外光照发绿光紫外光照发绿光硅胶硅胶FH365FH365含荧光剂，含荧光剂，365nm365nm紫外光照发光紫外光照发光2024/7/31第九节第九节纸色谱法纸色谱法PC将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇）分离机制：同液-液分配色谱定性参数：讨论讨论讨论讨论：R Rf f与组分性质、流动相及溶解度有关与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分极性组分易保留，易保留，R Rf f小（流动相极性小（流动相极性，R Rf f）非极性组分非极性组分易流出，易流出，R Rf f大（流动相极性大（流动相极性，R Rf f）2024/7/312024/7/31色谱方法色谱方法GCHPLCSFCTLCCE流动相流动相密度（密度（g/mL）扩散系数（扩散系数（cm2/s）使用压力（使用压力（MPa）分子间作用力分子间作用力酸碱性酸碱性升温升温驱动方式驱动方式线速度（线速度（cm/s）气体气体0.001110-20.21.0无微无微-可以可以压力差压力差1050液体液体1510-510-6540有有有有可以可以压力差压力差0.010.5高密度气体高密度气体0.20.310-313弱弱无微（有时因无微（有时因使用改性剂呈酸使用改性剂呈酸碱性）碱性）可以可以压力差压力差10液体液体110-510-6常压常压有有有有-毛细现象毛细现象0.01液体液体110-510-6常压常压有有有有-电渗流电渗流0.5固定相固定相扩散系数（扩散系数（cm2/s）膜厚膜厚(m)分子间作用力分子间作用力粘稠液体固体粘稠液体固体吸附剂键合分吸附剂键合分子层子层10-510-70.110有有固体吸附剂固体吸附剂键合分子层键合分子层10-510-70.55有有固体吸附剂键合固体吸附剂键合分子层分子层10-610-70.15有有硅胶，氧硅胶，氧化铝，键化铝，键合分子层合分子层10-510-71nm有有胶束，添加剂胶束，添加剂-有有控制分离的因素控制分离的因素分子量分子量溶质的极性、官能溶质的极性、官能团团分子量范围分子量范围分子量小的先分子量小的先流出流出有影响有影响1000GPC分子量分子量大的先流出大的先流出影响大影响大10000000有影响有影响10000影响大影响大10000分子量小的先流分子量小的先流出出有影响有影响1000000各种色谱法的性能各种色谱法的性能2024/7/31样品适应性样品适应性气体气体液体液体固体固体(溶剂可溶的溶剂可溶的)专一性样品专一性样品进样量（进样量（g）可以可以可以可以可以可以气体样品气体样品挥发性液体挥发性液体异构体异构体化学安定的样化学安定的样品品10-910-3-可以可以可以可以液体样品液体样品热不稳定样热不稳定样品品异构体异构体离子性样品离子性样品10-910-1-可以可以可以可以分子量分子量10000左右左右的齐聚物的齐聚物-10-910-3-可以可以可以可以液体样品液体样品10-610-3-可以可以可以可以离子或中性样品，离子或中性样品，分子量大的样品分子量大的样品10-710-13色谱柱色谱柱分析用填充柱（内分析用填充柱（内径径长长/cmcm）分析用毛细柱（内分析用毛细柱（内径径长长/cmcm）0.2500（0.010.053）（5006000）（0.40.6）（525）（0.050.1）（2050）（0.40.6）（525）（0.0050.01）（3050）平面平面（0.0050.01）（2070）检测器检测器通用通用选择性选择性TCD，FIDECD，FPD示差折光，示差折光，蒸发光散射蒸发光散射荧光荧光FIDUV碘或硫酸碘或硫酸显色显色电导电导UV，荧光，荧光