高效液相色谱技术课件

高效液相色谱技术高效液相色谱技术（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）高效液相色谱法高效液相色谱法l 它是在经典它是在经典液相液相色谱实验基础上，引入色谱实验基础上，引入气气相相色谱的理论。色谱的理论。l 以以液体液体作为作为流动相流动相的色谱法。的色谱法。l 在技术上采用在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分，而发展起来的快速分离分析技术。析技术。HPLC和经典液相色谱法的比较和经典液相色谱法的比较 高效液相色谱法高效液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法色谱柱柱长色谱柱柱长/cm102510200色谱柱柱内径色谱柱柱内径/mm210（不锈钢管）不锈钢管）1050（玻璃管）（玻璃管）固定相粒度（粒径固定相粒度（粒径m）35075600流动相流动方式流动相流动方式高压输液泵压入高压输液泵压入靠重力流入靠重力流入溶液的传质、扩散速度溶液的传质、扩散速度快快缓慢缓慢色谱柱入口压力色谱柱入口压力/MPa2200.0010.1色谱柱柱效色谱柱柱效/（理论塔板（理论塔板数数/m）2*1035*104250进样量进样量/（g）10-610-2110分析时间分析时间/h0.051.0120HPLC vs GC分析对象分析对象流动相流动相工作条件工作条件气相色谱法气相色谱法气体和沸点较低的化合物，仅占有机物总数的20 惰性气体惰性气体 温度较高高效液相色高效液相色谱法谱法高高极性极性、高分子量高分子量、离离子型的物质子型的物质，占有机物总数近80 液体液体可在室温下工作特点：高压、高效、高速、高灵敏高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。LCGC互补性高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点（1）分离效能高：柱效可达）分离效能高：柱效可达500030000块块/米米（2）选择性高：通过流动相的控制来改善分离过程）选择性高：通过流动相的控制来改善分离过程的选择性的选择性（3）检测灵敏度高：）检测灵敏度高：UV最小检出量可以达到最小检出量可以达到10-9gFD-最小检出量可以达到最小检出量可以达到10-12g（4）分析速度快分析速度快:采用了高压泵采用了高压泵HPLC液液-固吸附固吸附液液-液分配液分配正相正相色谱色谱反相色谱反相色谱一般反相色谱一般反相色谱离子对色谱离子对色谱离子抑制色谱离子抑制色谱离子交换色谱离子交换色谱一般离子交换色谱一般离子交换色谱离子色谱离子色谱氨基酸分析氨基酸分析空间排斥色谱空间排斥色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱假相色谱假相色谱胶束胶束色谱色谱环糊精色谱环糊精色谱亲合亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳色谱，手性色谱，毛细管电泳结构流程结构流程高效液相色谱仪高效液相色谱仪高压输液系统：高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压储液罐、吸滤器、高压 输液泵、输液泵、脱气装置脱气装置及梯度洗脱装置及梯度洗脱装置进样系统：进样系统：进样器，进样阀进样器，进样阀分离系统：分离系统：色谱柱，恒温箱色谱柱，恒温箱检测系统：检测系统：检测器检测器记录系统：记录系统：记录装置、色谱工作站记录装置、色谱工作站色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置 1、流动相和储液罐、流动相和储液罐（1）储液罐）储液罐 材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（聚醚醚酮（PEEK）棕色玻璃瓶会避免藻类的生长棕色玻璃瓶会避免藻类的生长 容积：容积：0.52.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输液放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差静压差 注意：密封、过滤注意：密封、过滤一、高压输液系统一、高压输液系统液相色谱的流动相液相色谱的流动相 1.1.流动相特性流动相特性（1 1）流流动动相相组组成成改改变变，极极性性改改变变，可可显著改变组分分离状况。显著改变组分分离状况。（2 2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小于固定相的极性，小于固定相的极性，正相正相，极性柱也称正相柱。，极性柱也称正相柱。（3 3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液相相色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱时间时间时间时间时间时间正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系待测物极性：待测物极性：ABC2.2.流动相类别流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分；按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常常用用溶溶剂剂：己己烷烷、四四氯氯化化碳碳、甲甲苯苯、乙乙酸酸乙乙酯酯、乙乙醇醇、乙腈、水。乙腈、水。采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3.3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的在选择溶剂时，溶剂的极性极性是选择的重要依据。是选择的重要依据。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙丙醇醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙乙酸乙酯酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物，含强络合剂的溶液等。过滤过滤用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤脱气脱气采用超声或过滤的方法注意注意流动相流动相使用前使用前冲洗冲洗使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！（2）流动相）流动相-过滤过滤流动相过滤的目的流动相过滤的目的 过滤去除可能存在的微小固体颗粒过滤去除可能存在的微小固体颗粒 保护色谱高压泵和色谱柱保护色谱高压泵和色谱柱流动相过滤方法流动相过滤方法 在线溶剂过滤在线溶剂过滤 抽真空过滤抽真空过滤溶剂吸滤器溶剂吸滤器:Ni合金，合金，孔约孔约0.45 m，防止颗，防止颗粒物进行泵内。粒物进行泵内。流动相流动相在线过滤：在线过滤：清洁方法：清洁方法：1 1、用水冲洗残留溶剂后，将过滤器、用水冲洗残留溶剂后，将过滤器放在约放在约35浓硝酸里浸一小时浓硝酸里浸一小时2 2、用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器、用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器3 3、将过滤器重新装好。、将过滤器重新装好。4 4、定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶、定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶 （每（每1 13 3个月至少清洗一次）个月至少清洗一次）不能用超不能用超声波清洗声波清洗流动相流动相抽真空过滤抽真空过滤过滤用膜：水系和有机，过滤用膜：水系和有机，孔径：孔径：0.22m和和0.45m流动相脱气的目的流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能提高检测的性能防止气泡引起的尖峰防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱保护色谱柱减少死体积减少死体积防止填料的氧化防止填料的氧化（2）流动相）流动相-脱气脱气常用的脱气方法有：常用的脱气方法有：抽真空脱气法：抽真空脱气法：特点：可以一次完成过滤和脱气任特点：可以一次完成过滤和脱气任务务注意：抽真空会引起混合溶剂组分注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系的变化，适合单一溶剂体系超声波脱气法超声波脱气法简单，但效果不理想简单，但效果不理想使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天，冲液建议不超过两天，最好每天更换最好每天更换流动相：流动相：water/methanol/water/methanol/trifluoroacetictrifluoroacetic acid(50/50/0.1)acid(50/50/0.1)a:fresha:freshb:after three hoursb:after three hoursc:after eight hoursc:after eight hours主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105Pa。l应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性蚀等特性2、高压泵、高压泵活塞型往复泵活塞型往复泵液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵 双柱塞往复式串联泵示意图双柱塞往复式串联泵示意图3、梯度洗脱装置：、梯度洗脱装置：为什么要进行梯度洗脱？为什么要进行梯度洗脱？使保留值相差很大的多种成分在合使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离理的时间内全部洗脱并达到相互分离梯度洗脱：梯度洗脱：在分离过程中逐渐改变流动相组成，在分离过程中逐渐改变流动相组成，如溶剂的极性、离子强度、如溶剂的极性、离子强度、pH值等。值等。梯度洗脱装置梯度洗脱装置 梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它时间，改善检测器的灵敏度，它类似于类似于GCGC种种使用的程序升温技术使用的程序升温技术 影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类度、溶剂的互溶性、检测器的种类高压梯度：高压梯度：用于二元梯度，用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比用两个泵分别按设定的比例输送例输送A和和B两溶液至混两溶液至混合器合器 低压梯度：低压梯度：只用一个高压泵，只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。就在比例阀中完成。四元低压梯度系统四元低压梯度系统四元高压梯度系统四元高压梯度系统泵压力不正常的主要原因：泵压力不正常的主要原因：气泡，主动阀故障，出口阀故障，密封垫气泡，主动阀故障，出口阀故障，密封垫或柱塞杆磨损，渗漏或堵塞，比例阀故障，或柱塞杆磨损，渗漏或堵塞，比例阀故障，传感器故障，使用比例阀混合时盐浓度太高传感器故障，使用比例阀混合时盐浓度太高二、进样装置二、进样装置早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。1隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到12%；加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。2停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。3阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降510%左右），但耐高压（3540MPa），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。4自动进样。用于大量样品的常规分析。六通阀进样装置六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的510倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。六通阀使用和维护注意事项：样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。六通阀进样装置 正面 一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈进样针进样针六通阀进样装置 反面连接自动进样器自动进样器样品瓶置于进样针下方样品瓶置于进样针下方进样针穿过垫圈进入瓶中进样针穿过垫圈进入瓶中注射器抽取所设定的样品体积注射器抽取所设定的样品体积进样针收回进样针收回转入针端口使之并成为流路的一部分转入针端口使之并成为流路的一部分进样注意点进样注意点进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。进样方法进样方法整个定量圈体积进样为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相。Sample Mobile phasen例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。n进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。部分定量圈体积进样当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求：不得超过定量圈体积的1/2量三、分离系统三、分离系统-色谱柱色谱柱 柱材料和规格柱材料和规格不锈钢管不锈钢管柱管的内径：柱管的内径：0.54.6mm填料粒度：填料粒度：310m柱长度柱长度：1025 cm常用色谱柱有：ODS柱、氰基柱、氨基柱等n色谱柱使用注意点色谱柱使用注意点：npHpH范围范围2-11.52-11.5。使用有机缓冲液，浓度以。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM10-50mM为好。在中高为好。在中高pHpH下避免使用磷酸盐，下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，n最高操作温度最高操作温度60 60，最佳温度，最佳温度 4040。n分离碱性物质，所用流动相分离碱性物质，所用流动相pHpH值应高于被值应高于被测物测物pKapKa一个单位。一个单位。柱pH范围最高温度SBC1890C860C360苯基60腈基60XDB60Extend-C18601 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ZORBAX RP-HPLCZORBAX RP-HPLC系列柱系列柱的的使用条件使用条件保存色谱柱时用保存色谱柱时用100%100%甲醇或乙腈，柱甲醇或乙腈，柱两端必两端必须用接头密封须用接头密封。停用数天后最使用时，应先用停用数天后最使用时，应先用低流速甲醇冲低流速甲醇冲洗洗1h1h左右左右，然后再换上流动相，否则直接用，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形不好。流动相，柱效会下降，峰形不好。新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗（0.5ml/min0.5ml/min）。）。1 1、要求：、要求：粒径小、颗粒分布均匀粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压机械强度高、能耐高压 化学稳定性好化学稳定性好HPLC的固定相的固定相液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510m。2.2.液液-液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体）全多孔型担体氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。（2）表面多孔型担体）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。（3）化学键合固定相）化学键合固定相化学键合固定相：以以硅硅胶胶为为载载体体，借借化化学学反反应应方方法法将将有机分子以共价键连接在硅醇基上有机分子以共价键连接在硅醇基上a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOCb.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSiC稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广。c.硅碳键型：硅碳键型：SiC化学键合固定相的特点：化学键合固定相的特点：（1 1）传质快传质快，表面无深凹陷。（2 2）寿寿命命长长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水，耐光，耐有机溶剂，稳定。（4 4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。（5 5）有利于梯度洗脱。有利于梯度洗脱。化学键合化学键合固定相固定相非极性键合相：非极性键合相：十八烷基键合相十八烷基键合相（ODS，C18）中等极性键合相：中等极性键合相：醚基键合相醚基键合相极性键合相：极性键合相：氨基、氰基键合相氨基、氰基键合相反相键合相色谱法（反相键合相色谱法（RPBPC）固定相：固定相：采采用用极极性性较较小小的的键键合合固固定定相相，如如硅硅胶胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶）、硅胶-苯基等苯基等流动相：流动相：采采用用极极性性较较强强的的溶溶剂剂，如如甲甲醇醇、乙乙睛睛-水水、水和无机盐的缓冲溶液等。水和无机盐的缓冲溶液等。分离机理分离机理疏溶剂作用理论疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相非极性的烷基键合相硅硅胶胶表表面面的的十十八八烷基烷基“分子毛分子毛”较强的疏水特性。较强的疏水特性。分子中非极性部分分子中非极性部分疏水烷基疏水烷基 缔合作用，分子保留缔合作用，分子保留分子极性部分分子极性部分极性流动相极性流动相 离开固定相，减小保留离开固定相，减小保留两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为流动相流动相极性溶剂极性溶剂分离物分离物极性官能团有机物极性官能团有机物改变流动相配比可分离极性化合物改变流动相配比可分离极性化合物用用水水和和无无机机盐盐的的缓缓冲冲液液为为流流动动相相可可分分离离易易离离解的样品有机酸、有机碱等。解的样品有机酸、有机碱等。主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物 用途用途 固固定定相相：极极性性的的有有机机基基团团，CN、NH2。双双羟羟基等键合在硅胶表面基等键合在硅胶表面流流动动相相：非非极极性性或或极极性性小小的的溶溶剂剂（如如正正已已烷烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等）分离机理：分离机理：范德华力、诱导力或氢键力范德华力、诱导力或氢键力用途：用途：多用于分离极性或中等极性化合物多用于分离极性或中等极性化合物正相键合相色谱法（NPBPC）其它其它固定相固定相离子交换固定相：离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子离子交换树脂、键合型离子交换树脂交换树脂空间排阻色谱固定相：空间排阻色谱固定相：凝胶凝胶手性固定相：手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精固着在载体上如环糊精亲合色谱固定相：亲合色谱固定相：生物专一性配基生物专一性配基+载体载体5、检测器、检测器主要作用：主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。定量分析。紫外检测器 示差折光检测器 荧光检测器 光电二极管阵列检测器a.紫外检测器紫外检测器基基于于被被分分析析组组分分对对特特定定波波长长紫紫外外光光或或可可见见光光的的选选择择性性吸吸收收，应用最广，对大部分有机化合物有响应。灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm10mm，容积8L)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。紫外紫外-可见光检测器光路示意图可见光检测器光路示意图可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器选用氘灯作为光源，在选用氘灯作为光源，在190600 nm 190600 nm 范围内可范围内可连续调节，选择不同的波长检测连续调节，选择不同的波长检测b.光电二极管阵列检测器（DAD）紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。DADDAD检测器的主要特点检测器的主要特点可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算不同可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算不同波长处的相对吸收比波长处的相对吸收比可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置实时可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，得到在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，得到时间时间波长波长吸收值吸收值为坐标的三维图形为坐标的三维图形三维：光谱-色谱图c.示差折光检测器示差折光检测器（Differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。灵敏度低，对温度敏感，不能用于梯度洗脱。光源光源调零调零光学零光学零参比参比样品样品平面镜平面镜透镜透镜光电转换光电转换记录仪记录仪放大器放大器遮光板遮光板溶剂相和样品溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度通用型检测器，灵敏度为通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗d.荧光检测器荧光检测器（Fluorescencedetector）高灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生素B，黄曲霉素，卟啉类化合物，农药，药物，氨基酸，甾类化合物等有响应。检测器器梯度梯度主要特点主要特点紫外紫外-可可见光光可可对流速和温度流速和温度变化敏感；池体化敏感；池体积可制作得很小；可制作得很小；对溶溶质的响的响应变化大。化大。荧光光可可选择性和灵敏度高；易受背景性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、光、消光、温度、pH和溶和溶剂的影响。的影响。化学化学发光光困困难灵敏度高；灵敏度高；发光光试剂受限；受流受限；受流动相和脉相和脉动的影响。的影响。电导不可不可是离子性物是离子性物质的通用的通用检测器；受温度和流速影响；不器；受温度和流速影响；不能用于有机溶能用于有机溶剂体系。体系。电化学化学困困难选择性高；受流性高；受流动相相pH值和和杂质的影响；的影响；稳定性差。定性差。蒸蒸发光散射光散射可可可可检测所有物所有物质。示差折光示差折光不可不可检测所有物所有物质；不适合微量分析；不适合微量分析；对温度温度变化敏感化敏感质谱可可主要用于定性和半定量。主要用于定性和半定量。原子吸收光原子吸收光谱可可选择性高。性高。ICP发射光射光谱可可可可进行多元素同行多元素同时检测。火焰离子化火焰离子化可可柱外峰展柱外峰展宽。数据处理和计算机控制系统数据处理和计算机控制系统色谱工作站色谱工作站在线显示在线显示自动采集自动采集处理储存处理储存自动控制自动控制 HPLC的建立与应用的建立与应用一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤1、根根据据被被分分析析样样品品的的特特性性选选择择适适用用于样品分析的一种于样品分析的一种HPLC分离方式。分离方式。材料来源、材料来源、浓度范度范围组分特性、分特性、结构、分子量、溶解性等构、分子量、溶解性等2、选择、选择合适的分析方法合适的分析方法适适用用的的色色谱谱柱柱：柱柱的的规规格格（柱柱内内径径及及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）柱长）和选用固定相（粒径及孔径）流动相流动相检测器检测器样品预处理样品预处理3.分析条件的优化分析条件的优化流动相种类与配比流动相种类与配比梯度梯度温度温度流速流速检测波长检测波长进样量进样量4、由由获获得得的的色色谱谱图图进进行行定定性性分分析析和和定量分析。定量分析。1 1、定性分析、定性分析色谱鉴定法：色谱鉴定法：保留时间对照保留时间对照化学鉴定法：化学鉴定法：利用专属化学反应对分离利用专属化学反应对分离 后收集的组分定性后收集的组分定性色谱色谱-光谱联用定性光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法：非在线色谱光谱联用法：色谱光谱联用仪色谱光谱联用仪2 2、定量分析、定量分析外标法：外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等外标二点法等 不需知道校正因子，但需进样量准确不需知道校正因子，但需进样量准确内标法：内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法内标二点法、内标对比法1、在食品分析中的应用、在食品分析中的应用食品营养成分分析：食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等；色素、维生素、香料、矿物质等；食品添加剂分析：食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；抗氧化剂等；食品污染物分析：食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。芳烃等。2、在环境分析中的应用、在环境分析中的应用多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。3、在生命科学中的应用、在生命科学中的应用分子水平上研究生命科学、遗传工程、临分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具床化学、分子生物学等必不可少的工具低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定酶的纯化、分离和测定4、在医学检验中的应用、在医学检验中的应用体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：物监测：合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等5、在无机分析中的应用、在无机分析中的应用阳、阴离子的分析等。阳、阴离子的分析等。我国药典收载我国药典收载HPLC法项目和数量比较表法项目和数量比较表项目项目数数量量1985版版1990版版1995版版2000版版2010版版鉴别鉴别934150检查检查1240160含量含量测定测定7601173871385色色谱柱柱类型型 品种数品种数C18柱柱1210个个C8柱柱93个个氰基柱基柱21个个硅胶柱硅胶柱31个个苯基柱苯基柱9个个色色谱柱柱类型型品种数品种数氨基柱氨基柱5个个丁基柱丁基柱3个个三甲基硅烷三甲基硅烷柱柱2个个二羟基丙基硅烷键合二羟基丙基硅烷键合硅胶硅胶柱柱1个个苯乙烯苯乙烯-二乙烯基二乙烯基柱柱1个个20102010版药典二部中色谱柱的使用情况版药典二部中色谱柱的使用情况本章小结本章小结色谱过程、分离原理及其分类；分配色谱过程、分离原理及其分类；分配系数系数KTLC中中Rf值的计算值的计算SDS-PAGE与琼脂糖凝胶电泳的基本与琼脂糖凝胶电泳的基本原理及其适用范围。原理及其适用范围。气相色谱检测器的类型及适用范围。气相色谱检测器的类型及适用范围。HPLC正相与反相色谱的组成及其特点。正相与反相色谱的组成及其特点。