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主要内容主要内容一、高效液相色谱法简介一、高效液相色谱法简介二、高效液相色谱系统二、高效液相色谱系统三、高效液相色谱法分类三、高效液相色谱法分类四、四、HPLC HPLC 使用注意事项使用注意事项高效液相法色谱简介高效液相法色谱简介高效液相色谱法的发展高效液相色谱法高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)起始于起始于60年代后期，是在经典液相色谱法的基础年代后期，是在经典液相色谱法的基础上引入了气相色谱理论而迅速发展起来的上引入了气相色谱理论而迅速发展起来的一种分离分析方法。一种分离分析方法。HPLC法的分离原理溶于流动相溶于流动相(mobile phase)中的中的各组分各组分经过固定经过固定相时，相时，与固定相与固定相(stationary phase)发生吸附、发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用分配、离子交换、排阻等作用，由于不同组分理，由于不同组分理化性质不同，与固定相发生作用的大小、强弱不化性质不同，与固定相发生作用的大小、强弱不同，导致在固定相中滞留时间不同，从而先后流同，导致在固定相中滞留时间不同，从而先后流出色谱柱出色谱柱。高效液相色谱仪的结构流程高效液相色谱仪的结构流程高高压压泵泵进进样样器器检检测测器器色谱色谱工作站工作站色谱柱色谱柱高效液相谱系统高效液相谱系统输液泵 输液泵是输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。输液系统中最重要的部件之一。输液泵应具备如下性能：泵应具备如下性能：流量稳定流量稳定，其，其RSD应应0.5%；流量范围宽流量范围宽，分析型应在，分析型应在0.110 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；输出压力高输出压力高，一般应能达到，一般应能达到150300kg/cm2；液缸容积小液缸容积小；密封性能好，密封性能好，耐腐蚀耐腐蚀。一个输液泵只能控制一个输液泵只能控制一个输液瓶，即只能用一一个输液瓶，即只能用一种溶剂（单一或混合溶剂）种溶剂（单一或混合溶剂）进行洗脱（等度洗脱）。进行洗脱（等度洗脱）。由于由于等度洗脱用等度洗脱用的流动相的流动相组成始终保持恒定，所以组成始终保持恒定，所以只适合组分数目少，性质只适合组分数目少，性质差别不大的样本的分离差别不大的样本的分离。一元泵系统 对于组分多、性质差别大的复对于组分多、性质差别大的复杂样本杂样本在一个条件下难以将各在一个条件下难以将各个组分洗脱下来，如在一个分个组分洗脱下来，如在一个分析周期内按程序改变流动相的析周期内按程序改变流动相的组成（如极性、离子强度和组成（如极性、离子强度和pHpH值值)，使各组分在适当条件下，使各组分在适当条件下得到分离。得到分离。二元泵系统二元泵系统 在一个分析周期内依据被测组分的极性在一个分析周期内依据被测组分的极性而按程序改变流动相组成进行洗脱的方法而按程序改变流动相组成进行洗脱的方法叫做叫做梯度洗脱梯度洗脱。优点：优点：能缩短分析时间，提高分离度，改善能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形。峰形。缺点：缺点：基线漂移。在不同仪器或色谱柱上较基线漂移。在不同仪器或色谱柱上较难重现。难重现。高压/低压梯度洗脱系统及特点v由两台以上输液泵将两种以上溶剂分别送入混合由两台以上输液泵将两种以上溶剂分别送入混合器混合，然后进入色谱柱的洗脱方式称为高压梯器混合，然后进入色谱柱的洗脱方式称为高压梯度洗脱。特点：度洗脱。特点：梯度准确度好。梯度准确度好。v由一台输液泵通过比例阀和在线脱气机完成的梯由一台输液泵通过比例阀和在线脱气机完成的梯度洗脱方法称为低压梯度洗脱。特点：度洗脱方法称为低压梯度洗脱。特点：需要配备需要配备在线脱气机，易发生时间滞后效应。在线脱气机，易发生时间滞后效应。现在的现在的HPLC输液泵多用柱塞往复泵，它的输液泵多用柱塞往复泵，它的液缸容积可小至液缸容积可小至0.1ml，易于清洗和更换流，易于清洗和更换流动相，特别适合于梯度洗脱，而且由于改变动相，特别适合于梯度洗脱，而且由于改变电机转速就能方便地调节流量，所以流量不电机转速就能方便地调节流量，所以流量不受柱阻影响，输液泵压力可达受柱阻影响，输液泵压力可达400kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，双泵系统其主要缺点是输出的脉冲性较大，双泵系统较好地克服了输出脉冲性较大的缺点。较好地克服了输出脉冲性较大的缺点。v按双泵的连接方式可分为按双泵的连接方式可分为并联式和并联式和串联串联式式，一般说来并联泵的流量重现性较好，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为为0.1%左右，串联泵为左右，串联泵为0.20.3%），但出故障的机会较多（因），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。多一单向阀），价格也较贵。v溶剂的纯度要高，否则重现性差；梯度溶剂的纯度要高，否则重现性差；梯度混合的溶剂互溶性要好；进样之前必须进混合的溶剂互溶性要好；进样之前必须进行空白梯度洗脱行空白梯度洗脱，以辨认溶剂峰；每次梯，以辨认溶剂峰；每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡，度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡，使之回到流动相组成的初始浓度。使之回到流动相组成的初始浓度。v示差折光检测器对流动相组成变化敏感，示差折光检测器对流动相组成变化敏感，不能进行梯度系统。不能进行梯度系统。梯度洗脱注意事项梯度洗脱注意事项梯度洗脱注意事项梯度洗脱注意事项检测器检测器是检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。根据检测原理可将其分为选择性检测号。根据检测原理可将其分为选择性检测器和通用型检测器。器和通用型检测器。检测器选择性紫外紫外(VWD(VWD、DAD)DAD)荧光光电化学电化学通用型示差折光蒸发光散射质谱几种常用检测器的主要性能几种常用检测器的主要性能UV荧光荧光电化学电化学质谱质谱蒸发光蒸发光信号信号流速影响流速影响温度影响温度影响检测限检测限(g/ml)池体积池体积(l)梯度洗脱梯度洗脱样品破坏样品破坏吸光度吸光度无无小小10-10210适宜适宜无无荧光强度荧光强度无无小小10-1327适宜适宜无无电流电流有有大大10-131不宜不宜无无离子流强度离子流强度无无适宜适宜有有散射光强散射光强无无小小10-9适宜适宜无无检测器的保养检测器的保养u紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时打紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时打开检测器，开检测器，20分钟后可以进行检测；在分析分钟后可以进行检测；在分析完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩短灯的使用寿命）短灯的使用寿命）u样品池要常清洗样品池要常清洗柱温箱柱温箱HPLC分析一般在室温条件下进行分析一般在室温条件下进行,但适当但适当提高柱温能降低流动相黏度和柱前压，有提高柱温能降低流动相黏度和柱前压，有利于改善传质和提高分析速度，有利于提利于改善传质和提高分析速度，有利于提高保留时间的重现性。高保留时间的重现性。高效液相色谱分类方法与特点高效液相色谱分类方法与特点HPLC 分类根据固定相可以分为：液根据固定相可以分为：液-固色谱、液固色谱、液-液色谱液色谱及键合相色谱；及键合相色谱；根据分离原理可以分为：吸附色谱、分配色根据分离原理可以分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱、排阻色谱谱、离子交换色谱、离子对色谱、排阻色谱等。等。键合相色谱分离原理：认为吸附、分配兼有之。分离原理：认为吸附、分配兼有之。正相色谱正相色谱：采用极性固定相（如硅胶、氨基：采用极性固定相（如硅胶、氨基与腈基键合相），流动相为相对非极性的疏与腈基键合相），流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等加入甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。用于分离中等极性以调节组分的保留时间。用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）类及氨基酸类等）。反相色谱反相色谱：一般用非极性固定相（如：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。性和极性较弱的化合物。离子交换色谱：离子交换色谱：固定相是离子交换树脂。固定相是离子交换树脂。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。主要缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。改变流动相的改变流动相的pH值和离子强度可以改善分离。值和离子强度可以改善分离。排阻色谱法排阻色谱法固定相为有一定孔径的多孔固定相为有一定孔径的多孔性填料。常用于分离高分子化合物，如组性填料。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。离子对色谱法离子对色谱法主要用于分析离子强度大主要用于分析离子强度大的酸碱物质。的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。高如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。反相离子对色谱法常用反相离子对色谱法常用ODS柱，流动相为柱，流动相为甲醇甲醇-水或乙腈水或乙腈-水，水中加入水，水中加入310 mmol/L的离子对试剂，在一定的的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行值范围内进行分离。被测组分保留时间与离子对性质、分离。被测组分保留时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有值、离子强度有关。关。三、三、HPLCHPLC使用注意事项使用注意事项HPLCHPLC的日常操作条件的日常操作条件u 最好是恒温、恒湿最好是恒温、恒湿 温度：温度：1530 相对湿度相对湿度80%u 房间应有良好的通风房间应有良好的通风u 空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器u 避免光线直射避免光线直射u 远离高电干扰、高振动设备远离高电干扰、高振动设备（一）启动前检查1.流动相是否过滤流动相是否过滤2.水与有机溶剂混合时温度变化大，必须水与有机溶剂混合时温度变化大，必须待恢复到室温时方可使用，否则易产生气待恢复到室温时方可使用，否则易产生气泡。泡。3.更换流动相时注意两种流动相必须具有更换流动相时注意两种流动相必须具有互溶性，互溶性，更换溶剂的一般方法：（更换溶剂的一般方法：（1）取少量准备更换的流）取少量准备更换的流动相放在清洁的烧杯中，取出吸滤器，将吸滤头动相放在清洁的烧杯中，取出吸滤器，将吸滤头放在烧杯中用超声波振荡器振动清洗干净；放在烧杯中用超声波振荡器振动清洗干净；（2）打开排液阀，按清洗键（）打开排液阀，按清洗键（purge），用新流），用新流动相清洗泵中的流动相；动相清洗泵中的流动相；（3）关闭排液阀，启动泵，清洗流路；）关闭排液阀，启动泵，清洗流路；（4）连接色谱柱和检测器，用新流动相平衡色谱）连接色谱柱和检测器，用新流动相平衡色谱柱。柱。4.更换不互溶性流动相时应先用异丙醇进行更换不互溶性流动相时应先用异丙醇进行置换，然后每步都按（置换，然后每步都按（1）（4）进行。）进行。5.更换缓冲盐流动相时，用纯水清洗，每更换缓冲盐流动相时，用纯水清洗，每步都按步都按14进行。进行。6.保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。清洗；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。7.定期在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，定期在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过滤器畅通无阻保持过滤器畅通无阻。8.每天开始使用仪器时注意放空排气，确每天开始使用仪器时注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。泡存在。（二）泵的使用与维护注意事项1.防止任何固体微粒进入泵体（防止任何固体微粒进入泵体（0.2um或或0.45um的微孔滤膜过滤）。的微孔滤膜过滤）。2.流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性。流量的稳定性。3.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内。的流动相不应保留在泵内。4.泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转会磨损柱塞、密封圈，导致漏液。泵运转会磨损柱塞、密封圈，导致漏液。5.输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形造成漏液。否则会使高压密封环变形造成漏液。6.使用缓冲液后用两通管连接管路及检测池，先使用缓冲液后用两通管连接管路及检测池，先用纯水冲洗，然后用甲醇冲洗。管路及检测池冲用纯水冲洗，然后用甲醇冲洗。管路及检测池冲洗干净后再冲洗色谱柱。洗干净后再冲洗色谱柱。反相柱先用含反相柱先用含5%7%甲醇的水冲洗色谱柱（此时甲醇的水冲洗色谱柱（此时不要再连接检测池），然后用甲醇或甲醇不要再连接检测池），然后用甲醇或甲醇-水混合水混合液冲洗。液冲洗。7.缓冲盐不得在色谱柱中过夜缓冲盐不得在色谱柱中过夜。8.缓冲液使用前必须过滤。缓冲液使用前必须过滤。9.磷酸盐、乙酸盐缓冲液易受到细菌和霉菌磷酸盐、乙酸盐缓冲液易受到细菌和霉菌的影响，不得放置过夜，应临用现制。的影响，不得放置过夜，应临用现制。注意：用缓冲液后不能直接换用有机溶剂注意：用缓冲液后不能直接换用有机溶剂流动相的贮存流动相的贮存流动相的贮存流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能贮存在塑料容器中。中，不能贮存在塑料容器中。容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。容器应定期清洗，以除去底部的杂质沉淀容器应定期清洗，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。和可能生长的微生物。1.使用流动相溶解样品使用流动相溶解样品 -减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要峰时尤为重要 -保证样品在流动相中的溶解度，避免保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀样品在系统中尤其在柱中产生沉淀2.进样前最好使用进样前最好使用 0.45um 的膜进行过滤。的膜进行过滤。样品处理样品处理 手动进样阀手动进样阀手动进样阀手动进样阀操作注意点：操作注意点：1 1）样品溶液必须用）样品溶液必须用0.45um0.45um的滤膜的滤膜过滤过滤2 2）进样应使用液相色谱专用平头）进样应使用液相色谱专用平头进样针进样针3 3）转动阀芯时不能太慢，更不能）转动阀芯时不能太慢，更不能停留在进样阀的中间位置停留在进样阀的中间位置4 4）常用密封垫的材质适用）常用密封垫的材质适用pH10,pH10,样品溶液样品溶液pHpH小于小于1010,换特氟隆材换特氟隆材质的密封垫质的密封垫pH10-13pH10-135 5）每天分析工作结束后，要清洗）每天分析工作结束后，要清洗进样阀进样阀定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套进样阀的保养进样阀的保养色谱柱的保养色谱柱的保养8945612370 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:输液时不要打开排液阀输液时不要打开排液阀柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动震动当柱子和色谱仪联结当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定时，阀件或管路一定要清洗干净要清洗干净要注意流动相的脱气要注意流动相的脱气避免使用高粘度的溶避免使用高粘度的溶剂作为流动相剂作为流动相进样样品要提纯进样样品要提纯控制绝对进样量控制绝对进样量加预柱加预柱预柱预柱预柱套预柱套 预柱芯预柱芯 预柱套预柱套预柱芯预柱芯装色谱柱时应按色谱柱上的箭头方向安装。装色谱柱时应按色谱柱上的箭头方向安装。一般不要倒冲色谱柱。一般不要倒冲色谱柱。每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱,清清洗后塞住两头洗后塞住两头当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存保存注意：只能使用色谱级的溶剂注意：只能使用色谱级的溶剂!不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液流动相的选择流动相的选择采用采用“HPLC”级溶剂级溶剂 对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小溶剂粘度要小与检测器相匹配（质谱、与检测器相匹配（质谱、ELSD不能用无机盐缓不能用无机盐缓冲液、用冲液、用UV检测器时注意溶剂的截止波长检测器时注意溶剂的截止波长流动相过滤头产生的问题流动相过滤头产生的问题故障特征故障特征“鬼峰鬼峰”(由已被污染的过滤头造成由已被污染的过滤头造成)保留时间不断改变保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞由于过滤头堵塞或部分堵塞)清洗步骤：清洗步骤：1.水水2.稀硝酸稀硝酸3.水水4.异丙醇异丙醇5.水水注意：砂芯式滤头不能超声注意：砂芯式滤头不能超声流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题改变保留时间和峰面积改变保留时间和峰面积 由于流动相中形成气泡对液流的不良影响及泵中由于流动相中形成气泡对液流的不良影响及泵中形成气泡使液流波动形成气泡使液流波动峰变形峰变形 柱中气泡形成和累积使流动相绕流柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声尖峰或锯齿状噪声 检测池中气泡形成和累积产生基线噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声输液泵常见故障及相应排除措施输液泵常见故障及相应排除措施故障故障 可能原因可能原因 解决办法解决办法 无流动相流出，无流动相流出，又无压力指示又无压力指示泵内有大量气体泵内有大量气体打开泄压阀，排液打开泄压阀，排液密封圈损坏密封圈损坏更换更换压力和流量不稳压力和流量不稳有气泡有气泡打开泄压阀排液打开泄压阀排液单向阀内有单向阀内有异物异物稀硝酸超声清洗稀硝酸超声清洗压力高压力高 堵堵压力低压力低漏漏按规则操作尽量避免问题按规则操作尽量避免问题 如出现问题应尽快如出现问题应尽快预测可能出现预测可能出现的问题的原因，的问题的原因，一次仅改变一种因一次仅改变一种因素有助于正确判断问题所在的原因素有助于正确判断问题所在的原因对自己所做的故障排除工作作好记录对自己所做的故障排除工作作好记录!使用使用HPLC 时注意时注意
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