高效毛细管电泳仪课件

高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪（high performance capillary electrophoresis,HPCE）1.主要内容主要内容电泳的基本原理电泳的基本原理电泳的影响因素电泳的影响因素毛细管电泳的基本结构毛细管电泳的基本结构毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的临床应用毛细管电泳的临床应用2.一、电泳的定义一、电泳的定义电电泳泳（electrophoresis，EP）是是指指带带电电荷荷的的溶溶质质或或粒粒子子在在电电场场中中向向着着与与其其本本身身所所带带电电荷相反的电极移动的现象。荷相反的电极移动的现象。利利用用电电泳泳现现象象将将多多组组分分物物质质分分离离、分分析析的的技技术术 叫叫 做做 电电 泳泳 技技 术术（electrophoresis technique）3.二、电泳发展简史二、电泳发展简史1、1937年年 瑞典科学家瑞典科学家 A.Tiselius首先提出的，后来首先提出的，后来A.Tiselius又和他的同事又和他的同事们一起第一次从人的血清中们一起第一次从人的血清中分离出白蛋白、分离出白蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白，由于球蛋白，由于A.Tiselius对电泳技木发展对电泳技木发展和应用的杰出贡献，使他成和应用的杰出贡献，使他成为为1948年诺贝尔化学奖的得年诺贝尔化学奖的得主主 4.2、1948年年Wieland和和Fischer重重新新发发展展了了以以滤滤纸纸作作为为支支持持介介质质的的电电泳泳方方法法，对对氨氨基基酸酸的的分离进行过研究。分离进行过研究。3、1959年年Raymond 和和Weintraub 利利用用人人工工合合成成的的凝凝胶胶作作为为支支持持介介质质，创创建建了了聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳，极极大大地地提提高高了了电电泳泳技技术术的的分分辨辨率，开创了近代电泳的新时代。率，开创了近代电泳的新时代。4、1967年年 Hjerten最最先先提提出出在在高高电电场场强强度度，直直径径为为3mm的的毛毛细细管管中中作作自自由由溶溶液液的的区区带带电电泳泳(CZE,capillary zone electrophoresis)。5.三、电泳原理三、电泳原理物物质质分分子子在在正正常常情情况况下下一一般般不不带带电电，即即所所带带正正负负电电荷荷量量相相等等故故不不显显示示带带电电性性。但但是是在在一一定定的的物物理理作作用用或或化化学学反反应应条条件件下下，某某些些物物质质分分子子会会成成为为带带电电的的离离子子（或或粒粒子子），不不同同的的物物 质质，由由 于于 其其带带 电电 性性 质质、颗颗 粒粒 形形 状状和和大大 小小不不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。度也不同，因此可使它们分离。6.电泳原理电泳原理 若将带净电荷若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：到的电荷引力为：F引引=E Q （6-1）在溶液中在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F阻阻 F阻阻=6rV （6-2）当当F引引=F阻阻时时 EQ=6rV V=EQ/6r （6-3）由上式可以看出由上式可以看出,粒子的移动速度粒子的移动速度(泳动速度泳动速度V)与电与电场强度场强度(E)和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量(Q)成正比成正比,而与粒子的半而与粒子的半径径(r)及溶液的粘度及溶液的粘度()成反比。成反比。7.电泳原理电泳原理电泳迁移率电泳迁移率（Electrophoreticmobility,），表），表示单位电场下带电粒子的运动速度。示单位电场下带电粒子的运动速度。e e=v v/E/Ee e=q/6r=q/6r对于一定的荷电粒子或离子，电泳迁移率是该粒子的特征对于一定的荷电粒子或离子，电泳迁移率是该粒子的特征常数。颗粒带净电荷量越大或其直径越小，其形状越接近常数。颗粒带净电荷量越大或其直径越小，其形状越接近球形，在电场中泳动的越快；反之，则越慢。球形，在电场中泳动的越快；反之，则越慢。设设d为粒子电泳移动距离，为粒子电泳移动距离，t为电泳时间，则为电泳时间，则电场强度电场强度E为单位距离内的电位差（为单位距离内的电位差（），设），设L为两为两极间的距离，即极间的距离，即8.合并上面两式：合并上面两式：设有设有A和和B两种带电粒子，它们能否在电场中电泳分两种带电粒子，它们能否在电场中电泳分离，可由它们的移动距离的差值来判断，设离，可由它们的移动距离的差值来判断，设A和和B的的电泳移动距离分别为电泳移动距离分别为 和和 ，两物质移动的距离差为：两物质移动的距离差为：由此可知，物质由此可知，物质A和和B能否分离，决定于两者的迁移能否分离，决定于两者的迁移率。率。9.四、影响电泳的因素四、影响电泳的因素电场强度电场强度：电场强度越大，带电粒子泳动越快：电场强度越大，带电粒子泳动越快溶液的溶液的pH值值：pH值离等电点愈远，粒子所带静电荷值离等电点愈远，粒子所带静电荷越多，电泳速度愈快。越多，电泳速度愈快。等电点等电点（isoelectric point,pI):当溶液的酸碱度处当溶液的酸碱度处于某一特定于某一特定pH值时，它将带有相同数量的正负电荷，值时，它将带有相同数量的正负电荷，致使蛋白质分子在电场中不会移动，此特定的致使蛋白质分子在电场中不会移动，此特定的pH值值被称为被称为。溶液离子强度溶液离子强度：强度愈高，电泳速度愈慢。适宜强：强度愈高，电泳速度愈慢。适宜强度度0.020.20mol/kg.10.四、影响电泳的因素四、影响电泳的因素电渗电渗：液体相对于固体支持物的移动。泳动方向与：液体相对于固体支持物的移动。泳动方向与电渗方向一致时，则加快泳动速度；当颗粒的泳动电渗方向一致时，则加快泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。温度温度：温度每升高：温度每升高10c,迁移率增加迁移率增加2.4%迁移率：迁移率：11.12.五、常用的电泳方法五、常用的电泳方法纸电泳纸电泳：用滤纸作为支持载体的电泳方法：用滤纸作为支持载体的电泳方法醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳：纤维素的羟基乙酰化：纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯制成的薄膜作支持载体形成的纤维素醋酸酯制成的薄膜作支持载体凝胶电泳：凝胶电泳：琼脂糖、聚丙烯酰胺琼脂糖、聚丙烯酰胺13.06-02 平卧式电泳槽装置示意图平卧式电泳槽装置示意图 06-03 血清蛋白的电泳图谱血清蛋白的电泳图谱 14.平板电泳槽平板电泳槽15.垂板电泳槽垂板电泳槽16.等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF)n利利用用具具有有pH梯梯度度的的支支持持介介质质分分离离等等点点电电不不同同的蛋白质的电泳技术。的蛋白质的电泳技术。n各各种种蛋蛋白白质质各各自自都都有有一一个个等等电电点点,在在一一特特殊殊的的pH环环境境中中,蛋蛋白白质质分分子子呈呈电电中中性性,在在电电场场中中不不会迁移。会迁移。17.等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF)等电聚焦等电聚焦就是在电泳介质中放入就是在电泳介质中放入载体载体两性电两性电解质解质，当通以直流电时，两性电解质即形成，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的一个由阳极到阴极逐步增加的pHpH梯度，在此梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。称为聚焦电泳。两性电解质两性电解质：就是在不同就是在不同PH环境下环境下,电解质可电解质可酸性电离酸性电离,也可碱性电离也可碱性电离,如磷酸如磷酸(二二)氢钠氢钠 18.等电聚焦电泳等电聚焦电泳蛋白质分子在不同蛋白质分子在不同pH下的解离状态下的解离状态 NH3+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-pHpI pHpI pH pI H+OH-H+OH-19.等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳具有很高的分辨率，在等电点上等电聚焦电泳具有很高的分辨率，在等电点上只有有只有有0.01pH单位的差异就能准确地分离单位的差异就能准确地分离特别适合分离分子量相近而等电点不同的蛋白特别适合分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分质组分特点：特点：20.等速电泳等速电泳(isotachophoresis,ITP)n是一种分离组分与电解质一起向前移动，同时进行分离的电泳方法是一种分离组分与电解质一起向前移动，同时进行分离的电泳方法n常用于分离小离子、小分子、肽类及蛋白质常用于分离小离子、小分子、肽类及蛋白质21.等速电泳等速电泳采用两种不同浓度的电解质组成，一种前导采用两种不同浓度的电解质组成，一种前导电解质迁移率高于任何样品组分，充满整个电解质迁移率高于任何样品组分，充满整个毛细管柱；另一种尾随电解质迁移率低于任毛细管柱；另一种尾随电解质迁移率低于任何样品组分，置于一端的电泳槽中何样品组分，置于一端的电泳槽中被分离组分按其不同的迁移率夹在中间，在被分离组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离离等速电泳在毛细管中的电渗流为零等速电泳在毛细管中的电渗流为零22.毛细管电泳技术毛细管电泳技术23.传统电泳存在的缺陷？传统电泳存在的缺陷？不能克服因高电压引起的不能克服因高电压引起的焦耳热焦耳热！引发的问题：引发的问题：分离效能低分离效能低分析时间长分析时间长在高压电场下，电解质会产在高压电场下，电解质会产生自热现象，该热量称为焦生自热现象，该热量称为焦耳热耳热24.毛细管的特点：毛细管的特点：比表面积大比表面积大 散热快散热快 可以用很可以用很高的电压高的电压 分析速度加快分析速度加快 分离效能提高分离效能提高25.熔融石英毛细管熔融石英毛细管毛细管内径毛细管内径毛细管外径毛细管外径26.1.毛细管电泳的工作原理毛细管电泳的工作原理毛细管电泳是在一根内径为毛细管电泳是在一根内径为25-75m，长几，长几十厘米熔融石英玻璃十厘米熔融石英玻璃毛细管毛细管内内进行的电泳。进行的电泳。是在外加电场的作用下，在毛细管中按荷电是在外加电场的作用下，在毛细管中按荷电粒子粒子淌度或分配系数的差异淌度或分配系数的差异而进行分离的新而进行分离的新技术。技术。即电泳迁移率27.毛细管壁毛细管壁(以熔融石英毛细管柱为例以熔融石英毛细管柱为例)：pH3时，SiOH+H2O SiO-+H3O+紧密层紧密层扩散层扩散层剪切面剪切面ZetaZeta电势电势w28.电电场场作作用用下下，毛毛细细管管柱柱中中出出现现：电电泳泳现现象象和和电电渗渗流现象流现象。电渗流（电渗流（electroosmotic flow,EOF)：在毛细管：在毛细管中，溶液中的正电荷与毛细管壁表面的负电荷之中，溶液中的正电荷与毛细管壁表面的负电荷之间的作用形成间的作用形成双电层双电层，引起流体朝一个方向移动，引起流体朝一个方向移动的现象的现象.EOF+-29.电渗流的速度、方向电渗流的速度、方向A.A.电渗流淌度：电渗流淌度：电渗的大小电渗的大小受到电势和介质粘度的影响，一般受到电势和介质粘度的影响，一般说来，电势越大，粘度越小，电渗流值越大说来，电势越大，粘度越小，电渗流值越大在不在不少情况下，电渗流的速度是泳流速度的少情况下，电渗流的速度是泳流速度的5一一7倍。倍。B.B.电渗流方向：电渗流方向：在通常的熔融石英毛细管区带电泳中，电渗流在通常的熔融石英毛细管区带电泳中，电渗流由由正极流向负极正极流向负极.30.毛细管电泳中，离子迁移的顺序毛细管电泳中，离子迁移的顺序V V总=V+V=V+VEOFEOF正离子正离子：电泳方向与电渗流方相同，：电泳方向与电渗流方相同，最先流出最先流出；中性粒子中性粒子：电泳速度为零，随电渗流流出。：电泳速度为零，随电渗流流出。负离子：负离子：电泳方向电泳方向与电渗流方向相反与电渗流方向相反；VVVVEOFEOF，无法流出，无法流出 VVVVEOFEOF，在中性粒子后流出，在中性粒子后流出+-NNNNNNNEOF都是从负极流出31.毛细管电泳仪系统毛细管电泳仪系统电泳仪电泳仪进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测检测 系统系统数据处理系统数据处理系统32.33.(一一)高压电源高压电源（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；）电源极性易转换；34.(二二)进样系统进样系统进样量：毛细管长度的进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非；纳升级、非常小；常小；1.流体力学进样方式流体力学进样方式（1）进样端加压）进样端加压（2）出口端抽真空）出口端抽真空（3）虹吸进样）虹吸进样35.36.2.电动进样方式：电动进样方式：毛细管一端插入样品瓶，毛细管一端插入样品瓶，加电压；加电压；凝胶电泳进样的唯一方式凝胶电泳进样的唯一方式37.(三）缓冲液池三）缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好化学惰性，机械稳定性好；(四四)检测器检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；类型类型 检测限检测限/mol /mol 特点特点紫外紫外-可见可见 10 10-13-131010-15-15 加二极管阵列，光谱信息加二极管阵列，光谱信息荧光荧光 10 10-15-151010-17 -17 灵敏度高，样品需衍生灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光激光诱导荧光 10 10-18-181010-20 -20 灵敏度极高，样品需衍生灵敏度极高，样品需衍生电导电导 10 10-18-181010-19 -19 离子灵敏，需专用的装置离子灵敏，需专用的装置38.3.高效毛细管电泳仪实图高效毛细管电泳仪实图39.4.毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式 1 1 毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)2 2 胶束电动色谱胶束电动色谱 3 3 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CGE)4 4 毛细管等速电泳毛细管等速电泳 5 5 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 6 6 毛细管电色谱毛细管电色谱40.5.毛细管电泳的临床应用毛细管电泳的临床应用血清蛋白分析血清蛋白分析血红蛋白成分分析血红蛋白成分分析肌红蛋白分析肌红蛋白分析脂蛋白分析脂蛋白分析糖化血红蛋白（糖化血红蛋白（HbAlc）分析）分析同工酶的分离同工酶的分离免疫复合物分析免疫复合物分析DNA片段和染色分析片段和染色分析在治疗药物监测中的应用在治疗药物监测中的应用41.b.IgM患者患者CZE图谱，图中箭头指为异常增值的图谱，图中箭头指为异常增值的M蛋白峰；蛋白峰；42.酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；43.采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；44.思考题思考题1、简述毛细管电泳与传统电泳的异同。、简述毛细管电泳与传统电泳的异同。2、毛细管电泳仪主要组成部分有哪些？、毛细管电泳仪主要组成部分有哪些？3、简述毛细管电泳的基本工作原理和特点。、简述毛细管电泳的基本工作原理和特点。4、电渗流对荷电离子及中性粒子的电泳迁移、电渗流对荷电离子及中性粒子的电泳迁移率有何影响？率有何影响？45.个人观点供参考，欢迎讨论！