遗传学经典基因表达调控培训课件

何谓表达？何谓表达？表达涉及两个环节：转录、翻译表达涉及两个环节：转录、翻译.基基因因工工程程中中“高高表表达达”high level expression，即高的蛋白质产量。即高的蛋白质产量。7/27/20241遗传学经典基因表达调控基因的表达是受到调节控制的：基因的表达是受到调节控制的：经济性经济性 安全性安全性 有序性有序性哪些基因被转录，哪些基因被转录，转录的效率如何。转录的效率如何。mRNA类型，类型，mRNA数量。数量。蛋白质的类型，蛋白质的类型，蛋白质的数量。蛋白质的数量。特定细胞的功特定细胞的功能和属性。能和属性。7/27/20242遗传学经典基因表达调控细菌的乳糖代谢细菌的乳糖代谢乳糖操纵子乳糖操纵子一、酶的诱导与阻遏一、酶的诱导与阻遏7/27/20243遗传学经典基因表达调控 1900年年，Dienert首首次次注注意意到到酶酶的的诱诱导导作作用用，在在酵酵母母细细胞胞的的培培养养中中，存存在在乳乳糖糖时时，细细胞胞产产生生与与乳乳糖糖利利用用有有关关的的酶酶；把把细细胞胞转转移移到到含含葡葡萄萄糖糖的的培培养养基基，这这种种酶酶即消失即消失.结结论论：底底物物的的存存在在能能专专一一地地诱诱导导酶酶的的产生。产生。7/27/20244遗传学经典基因表达调控 当培养基中有乳糖（当培养基中有乳糖（lactose），而无），而无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。迅速增加。乳糖（乳糖（lactose）既是底物）既是底物（substrate）又起到了诱导物）又起到了诱导物（inducer）的作用。）的作用。7/27/20245遗传学经典基因表达调控1953年年Monod发现酶的发现酶的阻遏作用阻遏作用 大大肠肠杆杆菌菌培培养养基基中中的的色色氨氨酸酸阻阻遏遏了了色色氨氨酸酸合成酶的合成合成酶的合成.同同等等诱诱导导或或同同等等阻阻遏遏:大大肠肠杆杆菌菌合合成成色色氨氨酸酸所所需需的的酶酶，5个个编编码码基基因因串串联联在在一一起起，而而且且排排列列顺顺序序也也跟跟基基因因产产物物所所催催化化的的反反应应顺顺序序相相同同。这这种种成串现象由成串现象由Demerec等人于等人于1955年首先观察到。年首先观察到。7/27/20246遗传学经典基因表达调控 从从1946年起及随后的年起及随后的10年，年，Jacques Monod、Joshua Lederberg、Francois Jacob以及以及Andre Lwoff 对乳糖代谢的遗传对乳糖代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研究。学和生物化学进行了系统的研究。7/27/20247遗传学经典基因表达调控 E.coli能以乳糖（葡萄糖能以乳糖（葡萄糖-4-D-半乳糖苷）这半乳糖苷）这种双糖作为唯一碳源。种双糖作为唯一碳源。乳糖进入细胞后被分解为半乳糖和葡萄糖乳糖进入细胞后被分解为半乳糖和葡萄糖.与乳糖代谢有关的三种酶：与乳糖代谢有关的三种酶：-半乳糖苷酶：水解乳糖为半乳糖和葡萄糖；半乳糖苷酶：水解乳糖为半乳糖和葡萄糖；-半乳糖苷透性酶：一种膜蛋白，协助乳糖穿半乳糖苷透性酶：一种膜蛋白，协助乳糖穿膜进入细菌细胞内。膜进入细菌细胞内。巯基半乳糖苷转乙酰酶：将一个乙酰基从乙酰巯基半乳糖苷转乙酰酶：将一个乙酰基从乙酰辅酶辅酶A A转移到转移到-半乳糖苷上。半乳糖苷上。三种酶的编码基因分别命名为三种酶的编码基因分别命名为lacZ、lacY和和lacA，统称为统称为结构基因结构基因，在染色体上相连在一起。，在染色体上相连在一起。7/27/20248遗传学经典基因表达调控lacZ：编码编码-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-galactosidase）四聚体，分解乳糖。四聚体，分解乳糖。乳糖乳糖半乳糖半乳糖+葡萄糖葡萄糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶7/27/20249遗传学经典基因表达调控7/27/202410遗传学经典基因表达调控7/27/202411遗传学经典基因表达调控lacY：编码编码-半乳糖苷透性酶（半乳糖苷透性酶（permeasae）。）。膜蛋白，将乳糖转运到细胞中。膜蛋白，将乳糖转运到细胞中。lacA：编码编码-半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶（transacetylase）。二聚体）。二聚体;把乙酰把乙酰辅酶辅酶A上的乙酰基转移到上的乙酰基转移到-半乳糖苷半乳糖苷上。上。7/27/202412遗传学经典基因表达调控 培培养养中中C源源不不是是乳乳糖糖时时，三三种种酶酶在在细细胞胞内内的的含含量很低，只有几个分子或不到。量很低，只有几个分子或不到。如如果果用用乳乳糖糖代代替替葡葡萄萄糖糖，则则在在几几分分钟钟内内，每每个个cell转转录录出出30-50个个mRNA模模板板，产产生生3000多多个个-半半乳乳糖糖苷苷酶酶分分子子，另另两两种种酶酶的的量量也也迅迅速速增增加加，一一旦旦乳乳糖糖耗耗尽，三种酶的合成同时停止。尽，三种酶的合成同时停止。这这里里，乳乳糖糖被被当当作作诱诱导导物物，并并被被-半半乳乳糖糖苷苷酶酶催催化化分分解解，一一些些不不能能被被该该酶酶分分解解的的半半乳乳糖糖苷苷也也可可作作为为诱导物，如诱导物，如IPTG （异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷）硫代半乳糖苷）IPTG有诱导效应而本身不被分解，称为安慰诱有诱导效应而本身不被分解，称为安慰诱导物导物(gratuitous inducer)7/27/202413遗传学经典基因表达调控7/27/202414遗传学经典基因表达调控constitutive不需诱导、持续地合成.诱导型的合成（如-半乳糖苷酶也可能产生组成型突变体mutant）乳糖操纵子模型有关的试验中，利用了：组成型突变体部分二倍体技术（性导,F因子）组成型合成组成型合成7/27/202415遗传学经典基因表达调控Joshua Lederberg为了研究乳糖代谢的为了研究乳糖代谢的三个酶的基因，分离了大量的突变体三个酶的基因，分离了大量的突变体（lac-），并经过遗传作图发现它们是），并经过遗传作图发现它们是紧密连锁的：紧密连锁的：Z-Y-A乳糖操纵子模型7/27/202416遗传学经典基因表达调控同时发现它们是被同时诱导转录的。同时发现它们是被同时诱导转录的。7/27/202417遗传学经典基因表达调控 雅科Jacob和莫诺Monod根据试验事实提出了操纵子模型operonmodel。认为这三个酶的基因转录受一个开关单位的控制。7/27/202418遗传学经典基因表达调控操纵子模型（OperonModel）1960年，年，Jacob和和Monod提出了操纵子模提出了操纵子模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制（negative control）。）。7/27/202419遗传学经典基因表达调控获获1965年年Nobel生理学和医学奖生理学和医学奖7/27/202420遗传学经典基因表达调控操纵子模型对乳糖诱导效应的解释操纵子模型对乳糖诱导效应的解释 LacI 编码了一个编码了一个阻遏物阻遏物(repressor)，与结构基因附近的一个，与结构基因附近的一个“假想假想”位置位置（命名为（命名为operator site）结合）结合,从而抑制从而抑制结构基因的转录。结构基因的转录。该阻遏物能变构（该阻遏物能变构（allosteric）。即）。即它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了与与operator DNA结合的能力，结构基因结合的能力，结构基因才能够转录表达。才能够转录表达。7/27/202421遗传学经典基因表达调控 调节基因编码的产调节基因编码的产物是一种蛋白质分子，物是一种蛋白质分子，称为阻遏物。当培养基称为阻遏物。当培养基内没有乳糖时，阻遏物内没有乳糖时，阻遏物结合到操纵基因上，阻结合到操纵基因上，阻止了止了RNA聚合酶的通聚合酶的通过，所以结构基因得不过，所以结构基因得不到转录。到转录。培养基加入乳糖后，培养基加入乳糖后，乳糖作为诱导物与阻遏乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏物的蛋白结合，使阻遏物的构象改变。阻遏物的构构象改变。阻遏物的构象改变后，失去了与操象改变后，失去了与操纵基因结合的能力，阻纵基因结合的能力，阻遏物从操纵基因上解离遏物从操纵基因上解离下来。于是转录得以进下来。于是转录得以进行。行。7/27/202422遗传学经典基因表达调控Jacob和和Monod未未提提出出启启动动基基因因区区（RNA聚聚合合物物识识别别并并结结合合的的区区域域）P（Promotor，又又叫叫启启动动子子）,后来由伊彭提出。后来由伊彭提出。启动子：由两个盒组成，以转录起始点为启动子：由两个盒组成，以转录起始点为+1+1，-35-35的的TTGACATTGACA盒是盒是RNARNA聚合酶的识别位点，聚合酶的识别位点，-10-10的的TATAATTATAAT盒盒（PribnowPribnow盒），是盒），是RNARNA聚合酶的结合位点。聚合酶的结合位点。这样，操纵子的概念：最初的操纵子这样，操纵子的概念：最初的操纵子=操纵基因操纵基因+结构结构基因，进一步成为基因，进一步成为 操纵子包括：启动基因操纵子包括：启动基因+操纵基因操纵基因+结构基因。结构基因。7/27/202423遗传学经典基因表达调控 操纵子（操纵子（operon）:功能相关的结构基因在染功能相关的结构基因在染色体上成簇（色体上成簇（cluster）排列）排列,由一个共同的控制区由一个共同的控制区调控基因的转录调控基因的转录,是原核生物转录调控的基本单位是原核生物转录调控的基本单位.由由结构基因结构基因（structural genes）和上游相邻的）和上游相邻的控制控制区区（regulatory region）组成。）组成。一个操纵子转录后形成一个一个操纵子转录后形成一个多顺反子多顺反子mRNA(polycistronicmRNA(polycistronic)。7/27/202424遗传学经典基因表达调控对模型的遗传学验证对模型的遗传学验证组成型突变（组成型突变（constitutive mutants）没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。7/27/202425遗传学经典基因表达调控遗传作图发现：遗传作图发现：这种突变（这种突变（lacOc）的基因紧密连锁在）的基因紧密连锁在结构基因的上游（结构基因的上游（operator region）。）。另一个组成型突变（另一个组成型突变（lacI-）作图的结果）作图的结果是在离结构基因不远处。是在离结构基因不远处。7/27/202426遗传学经典基因表达调控野野生生型型7/27/202427遗传学经典基因表达调控组成型突变lacOclacI-7/27/202428遗传学经典基因表达调控根据操纵子模型的原理，可以预测：根据操纵子模型的原理，可以预测：模型预测模型预测1.lacI基因产物是个可扩散的基因产物是个可扩散的（diffusible）蛋白。）蛋白。2.O区（区（operator region）在调节过程中）在调节过程中起作用，但不编码产物。起作用，但不编码产物。3.O区必须紧靠结构基因。区必须紧靠结构基因。7/27/202429遗传学经典基因表达调控实验验证实验验证 Pardee、Jacob、Monod设计了设计了历史性的实验来检验他们的模型的预历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。测是否正确。1.实验原理实验原理7/27/202430遗传学经典基因表达调控2.实验过程实验过程通过通过F因子，给因子，给lacI-或或lacOc的突变菌输入野的突变菌输入野生型生型lacI或或lacO基因，观察其对基因，观察其对-半乳糖苷半乳糖苷酶活性的影响。酶活性的影响。实验实验1：组成型突变组成型突变lacI-lacZ+F菌株菌株F lacI+lacZ-乳糖诱导型菌乳糖诱导型菌说明说明F菌株的菌株的lacI+能弥补原菌株的能弥补原菌株的lacI-缺陷。缺陷。即：即：lacI 对对lacZ是反式作用（是反式作用（trans-acting）。）。7/27/202431遗传学经典基因表达调控7/27/202432遗传学经典基因表达调控组成型突变组成型突变lacI+lacOc lacZ+F菌株菌株F lacI+lacO+lacZ-组成型表达组成型表达实验2：说明说明F菌株的菌株的lacO+不能弥补原菌株的不能弥补原菌株的lacOc缺陷。缺陷。即：即：lacO对对lacZ是顺式作用（是顺式作用（cis-acting）。）。7/27/202433遗传学经典基因表达调控7/27/202434遗传学经典基因表达调控实验3lacI超突变（超突变（lacIs）编码的阻遏物不能与乳糖）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在结合，所以总是结合在O区的区的DNA上，使上，使lacZ不能表达。不能表达。7/27/202435遗传学经典基因表达调控野生型野生型lacI+lacZ+F菌株超突变菌株超突变F lacIs lacZ+组成型不表达组成型不表达说明超突变说明超突变lacIs 编码的阻遏物能作用于野编码的阻遏物能作用于野生型菌操纵子的生型菌操纵子的O区。区。利用超突变：利用超突变：7/27/202436遗传学经典基因表达调控7/27/202437遗传学经典基因表达调控7/27/202438遗传学经典基因表达调控操纵子模型的意义Jacob和和Monod1961年发表的操纵子理论是遗年发表的操纵子理论是遗 传学的的一个里程碑（传学的的一个里程碑（landmark）。）。用遗传分析结果推论出分子生物学模型并验证。用遗传分析结果推论出分子生物学模型并验证。暗示了蛋白质与暗示了蛋白质与DNADNA结合的概念。结合的概念。描述了描述了“阻遏物阻遏物”的调节因子概念（尽管当的调节因子概念（尽管当时并不知道它是蛋白质还是时并不知道它是蛋白质还是RNARNA）。）。当时人们刚知道当时人们刚知道mRNA，对转录的细，对转录的细节一无所知！节一无所知！7/27/202439遗传学经典基因表达调控附：阻遏物的分离和鉴定阻遏物的含量极少，每细胞不超过阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。份。直到直到1966年，年，Walter Gilbert和和Benno Muller-Hill从从lacI的超量突变菌株中，利的超量突变菌株中，利用透析（用透析（dialysis）的方法，通过）的方法，通过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。白质。Gilbert及其同事又用放射自显影证明它及其同事又用放射自显影证明它能与能与lacO DNA结合。结合。分离分离鉴定鉴定7/27/202440遗传学经典基因表达调控放射性标记的阻遏物能与野生型O区结合7/27/202441遗传学经典基因表达调控放射性标记的阻遏物不能与突变型O区结合7/27/202442遗传学经典基因表达调控Lac阻遏物的空间结构两个两个binding domian:四聚体聚合区四聚体聚合区CN一个四聚一个四聚体聚合区体聚合区7/27/202443遗传学经典基因表达调控阻遏物与DNA的结合i）电镜观察）电镜观察Lac repressor7/27/202444遗传学经典基因表达调控ii）X-ray分析两个单体结合在一个完整的两个单体结合在一个完整的lacO区；区；7/27/202445遗传学经典基因表达调控四聚体可以结合两个四聚体可以结合两个lacO。7/27/202446遗传学经典基因表达调控iii）DNA测序分析阻遏物所结合的阻遏物所结合的DNA有有26bp（-5 +21）。）。位于位于RNA多聚酶结合部位的下游内部。多聚酶结合部位的下游内部。GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTATGmRNAproteinRNA pol binding siterepressor binding site对称轴对称轴7/27/202447遗传学经典基因表达调控乳糖操纵子的正调控（乳糖操纵子的正调控（positive control）Jacob-Monod 模型没能回答一个关键性模型没能回答一个关键性的问题：的问题：为什么为什么E.coli 在既含有葡萄糖（在既含有葡萄糖（glucose）又）又含有乳糖的（含有乳糖的（lactose）的培养基（）的培养基（medium）中不启动中不启动lac 操纵子的转录？操纵子的转录？Answers to this question emerged from molecular studies carried out long after publication of the operon theory.7/27/202448遗传学经典基因表达调控（1）正调控因子（positiveregulator）在有些启动子上，在有些启动子上，RNA pol结合后并不能结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开子）的帮助才能打开DNA双链。双链。CAP是是lac operon的正调节因子。的正调节因子。（2）CAP的作用原理的作用原理 cAMP+CAP cAMP-CAP复合体复合体7/27/202449遗传学经典基因表达调控 cAMP-CAP与与lac操纵子启动基因上的操纵子启动基因上的一个位置结合后一个位置结合后，RNA聚合酶才能与启聚合酶才能与启动子结合。动子结合。cAMP是由是由ATP经过腺苷酸环化酶经过腺苷酸环化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。）的作用形成。ATPcAMPAdenyl cyclase7/27/202450遗传学经典基因表达调控 葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，从而从而间接地抑制了间接地抑制了Lac操纵子的转录。操纵子的转录。CAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖系统在半乳糖和阿拉伯糖操纵子中也起作用。操纵子中也起作用。葡萄糖浓度cAMP 葡萄糖浓度cAMP7/27/202451遗传学经典基因表达调控7/27/202452遗传学经典基因表达调控（3）CAP与DNA的结合lac操纵子中，操纵子中，CAP结合位点位于结合位点位于RNA pol结合位点的上游（结合位点的上游（-22bp）。）。结合部位位置结合部位位置不同的操纵子中，不同的操纵子中，CAP的结合位置不同。的结合位置不同。operator CAP promotor 结构基因结构基因半乳糖半乳糖乳糖乳糖阿拉阿拉伯糖伯糖结构基因结构基因operatorpromotorCAP operator CAP promotor结构基因结构基因7/27/202453遗传学经典基因表达调控7/27/202454遗传学经典基因表达调控以二聚体形式与以二聚体形式与DNA结结合。使合。使DNA弯曲弯曲90度。度。结合形式7/27/202455遗传学经典基因表达调控TGTGAGTTAGCTCACACACTCAATCGAGTG结合处DNA的保守序列回文顺序每一部分结合一个每一部分结合一个CAP。7/27/202456遗传学经典基因表达调控 调节基因的产物作为阻遏物与操纵调节基因的产物作为阻遏物与操纵基因结合，从而关闭操纵子，称为基因结合，从而关闭操纵子，称为负负控制控制。调节基因的产物（例如调节基因的产物（例如CAPCAP蛋白）作为激活因子开启转录，增加蛋白）作为激活因子开启转录，增加酶或蛋白质的合成。称为酶或蛋白质的合成。称为正控制正控制。7/27/202457遗传学经典基因表达调控7/27/202458遗传学经典基因表达调控7/27/202459遗传学经典基因表达调控7/27/202460遗传学经典基因表达调控真正的诱导物是别乳糖。别乳糖的产生需要半乳糖苷酶。问题：第一个别乳糖是如何产生的？答案:存在本底组成型合成。7/27/202461遗传学经典基因表达调控本底组成型合成本底组成型合成 阻遏蛋白与阻遏蛋白与lacO的结合有一个的结合有一个1020分钟分钟的半衰期：的半衰期：RNA聚合酶抓住阻遏蛋白脱离聚合酶抓住阻遏蛋白脱离lacO的极短时间，转录产生的极短时间，转录产生1-2个个mRNA,翻译翻译生成三种酶生成三种酶.7/27/202462遗传学经典基因表达调控小结有葡萄糖存在时，7/27/202463遗传学经典基因表达调控