第一节DNA和RNA的提取与纯化课件

第一节第一节DNA和和RNA的提取与纯化的提取与纯化制备纯的高分子量的制备纯的高分子量的DNA是基因工程操作的基础之一是基因工程操作的基础之一第一节DNA和RNA的提取与纯化制备纯的高分子量的DNA 1一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法化学性质化学性质比较稳定比较稳定潜在的反应基团隐藏在中央螺旋内，并经氢键紧密连接。它的潜在的反应基团隐藏在中央螺旋内，并经氢键紧密连接。它的碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层的保护，这种保护因内碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强。在的碱基堆积力而进一步加强。1.DNA的性质：的性质：一、DNA提取的基本原理与方法化学性质比较稳定潜在的反应基团2核苷核苷酸碱基碱基核苷核苷酸碱基3 高分子质量高分子质量DNA长而弯曲，仅具有极微的侧向稳定性，因长而弯曲，仅具有极微的侧向稳定性，因而容易受到最柔和的流体剪切力的伤害。双链而容易受到最柔和的流体剪切力的伤害。双链DNA在溶液中随在溶液中随机卷曲，并由于碱基堆积力和机卷曲，并由于碱基堆积力和DNA骨架上磷酸基团间的静电排骨架上磷酸基团间的静电排斥力而变得黏滞。斥力而变得黏滞。由吸液，振荡，搅拌所导致的水流对黏滞的盘绕物产生拖由吸液，振荡，搅拌所导致的水流对黏滞的盘绕物产生拖拉力，能切断拉力，能切断DNA的双链。的双链。DNA分子越长，断裂所需的力越弱。分子越长，断裂所需的力越弱。因此，基因组因此，基因组DNA容易成片段地获得，所需分子质量越大，获容易成片段地获得，所需分子质量越大，获得的难度也相应增加。得的难度也相应增加。物理性质 高分子质量DNA长而弯曲，仅具有极微的侧向稳定性，因而42.2.天然天然DNADNA的来源和用途的来源和用途n n天然DNA包括染色体DNA,病毒DNA(噬菌体DNA),质粒DNA,线粒体及叶绿体DNA等,可从不同的生物体中提取.2.天然DNA的来源和用途天然DNA包括染色体DNA,病毒5染色体DNA.原核和真核生物均含有染色体DNA.其分子巨大,可长达106kb,小的也有1000kb左右.是生物界含量最丰富的DNA资源,蕴藏着地球上极大部分的遗传信息.是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料,也可提供构建染色体载体和染色体基因整合平台系统之用.病毒和噬菌体DNA.含DNA的病毒和噬菌体的种类很多,能在相应的原核生物和真核生物宿主细胞内大量增殖.由于此类DNA可被体外包装,所以主要用于构建基因克隆载体,承载较大片段的外源DNA,经体外包装,导入受体细胞.此类DNA也编码一些结构基因,可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料.染色体DNA.原核和真核生物均含有染色体DNA.病毒和噬菌体6质粒DNA很多微生物细胞内含有质粒DNA,游离于细胞质中,所以被称为染色体外遗传物质.每种质粒都有复制起始位点,能自我复制.主要用于构建载体.也要用于分离目的基因和基因表达调控因子.线粒体和叶绿体DNA.真核生物特有的染色体外遗传物质,分别含有与呼吸作用和光合作用有关的基因.可用于分离目的基因及构建载体质粒DNA线粒体和叶绿体DNA.7 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法8（一）（一）DNA提取的基本原理提取的基本原理DNA分子是极性分子，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机分子是极性分子，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离太更易溶于水。溶剂，其钠盐比游离太更易溶于水。酸性溶液中，酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。生物细胞中大部分生物细胞中大部分DNA集中在细胞核，多以脱氧核糖核蛋白集中在细胞核，多以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。而形式存在。而DNP在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的显著影响，显著影响，0.14mol/LNaCl溶液中最低，仅为水中溶解度的溶液中最低，仅为水中溶解度的1%，浓度升高，溶解度增加，到，浓度升高，溶解度增加，到1mol/L时，比纯水高时，比纯水高2倍。倍。而核糖核蛋白而核糖核蛋白(RNP)在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在在0.14mol/LNaCl的溶解度较大。据此，可分享的溶解度较大。据此，可分享DNP和和RNP.（一）DNA提取的基本原理9 一般一般DNA提取都分为两步，即先是温和或机制裂解细胞及提取都分为两步，即先是温和或机制裂解细胞及溶解溶解DNA，接着采用几种化学和酶学方法中的任一种，接着采用几种化学和酶学方法中的任一种，以去以去除蛋白、除蛋白、RNA及其它的大分子。及其它的大分子。一般DNA提取都分为两步，即先是温和或机制裂解细胞及溶101生物材料的准备生物材料的准备 选选用用的的材材料料应应该该是是处处于于提提取取DNADNA得得率率最最高高的的生生长长期期,或或者者是是DNADNA容容易易提提取取和和含含量量高高的的组组织织.对对于于细细菌菌,一一般般取取对对数数生生长长后后期期.对对于于植植物物一一般般取取幼幼嫩嫩的的植植株株,并并且且暗暗培培养养1-21-2天天,甚甚至至黄黄化化苗苗.提取动物肝脏提取动物肝脏DNADNA应清除胆囊应清除胆囊,因其含有多种高活性酶因其含有多种高活性酶.1生物材料的准备112细胞的裂解和细胞的裂解和DNADNA的溶解的溶解细胞不裂解,则DNA释放不出来.裂解不完全,得率就低.如果细胞裂解过于激烈,会导致DNA的断裂.裂解方法因物种而异.对于原核生物,可用溶菌酶处理.用NaOH,SDS,用煮沸及冰冻,超声波处理等方法使细胞裂解.2细胞的裂解和DNA的溶解12对结构复杂的动植物材料要进行磨样对结构复杂的动植物材料要进行磨样(粉碎粉碎)。一般方法是将材料。一般方法是将材料放入研钵（放在冰中预冷），加入液氮，快速磨碎成粉状。然放入研钵（放在冰中预冷），加入液氮，快速磨碎成粉状。然后再参照裂解原核生物细胞的方法裂解细胞后再参照裂解原核生物细胞的方法裂解细胞.一般用一般用SDS、CTAB、溶菌酶和蛋白酶、溶菌酶和蛋白酶K来裂解细胞。来裂解细胞。所用缓冲液一般为所用缓冲液一般为TE（TrisC-HCl EDTA）缓冲液。）缓冲液。提取缓冲液：提取缓冲液：100mmol/L Tris Cl(pH8.0),50mmol/L EDTA(pH8.0),500mmol/L NaCl,10mmol/L 巯基乙醇。巯基乙醇。在提取时，将在提取时，将10SDS加入缓冲液中于加入缓冲液中于65预热一定时间。然预热一定时间。然后加入到装有样品的离心管中，于后加入到装有样品的离心管中，于65保温保温6090min。其间。其间轻轻摇动数次。轻轻摇动数次。4下下12000rpm离心离心10min,将上清转入另一离心管中将上清转入另一离心管中,上清即为上清即为DNA的粗提物。的粗提物。对结构复杂的动植物材料要进行磨样(粉碎)。一般方法是将材料放13正常条件下，由于细胞的区室化隔离，DNA酶，氧化酶等分布于特定区隔中，不与DNA接触。细胞破碎，则容易导致DAN降解。因此提取过程中对DNA的保护显得非常重要。措施：（）利用液氮超低温下研磨，减少损失。（）快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。加入EDTA和抗氧化剂及PVP等正常条件下，由于细胞的区室化隔离，DNA酶，氧化酶等分布于特143核酸的纯化核酸的纯化主主要要根根据据核核酸酸的的性性质质,使使其其与与细细胞胞内内其其它它成成分分分分离离开开来来,从中进一步抽提从中进一步抽提DNA.DNA.（杂质的去除）（杂质的去除）核酸通过有机溶剂抽提并进行纯化。污染的RNA通过RNase消化清除。在粗提物中加入等体积的氯仿异戊醇（或酚氯仿异戊醇）轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min，上清液为DNA的水溶液，根据需要，还可以重复这一步或用氯仿/异戊醇颠倒混匀再离心.此过程目的是用酚和氯仿去除蛋白质。3核酸的纯化15在提取DNA时有机溶剂的使用酚和氯仿为非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚和氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。在提取DNA时有机溶剂的使用酚和氯仿为非极性分子，水是极性分16 作为表面变性的酚和氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊.酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合使用。作为表面变性的酚和氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊17在抽提DNA时，为了混合均匀，必须振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊醇之比为24：1，也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24：1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。酚的平衡和饱和酚的饱和：因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其在抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节其PH值到8.0称为酚的平衡，其原因是DNA分子在此条件下，比较稳定。在抽提DNA时，为了混合均匀，必须振荡容器数次，这时在混合液184沉淀沉淀DNA用无水乙醇（异丙醇）沉淀用无水乙醇（异丙醇）沉淀DNA，这是实验中最常用的方法。这是实验中最常用的方法。具具体体方方法法是是将将上上面面所所提提的的上上清清液液加加入入2倍倍体体积积的的无无水水乙乙醇醇和和0.2-0.4mol/L的的NaCl，颠颠倒倒混混匀匀，冰冰冻冻30min.可可以以观观察察到到絮絮状状的沉淀的沉淀,即为即为DNA，经离心，除去上清液。，经离心，除去上清液。DNA溶液是溶液是DNA以水合状态存在，当加入乙醇时，乙醇会夺以水合状态存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去去DNA周围的水分子，使周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，失水而易于聚合。一般实验中，是加是加2倍体积的无水乙醇与倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占相混合，其乙醇的最终含量占67左右。也可改用左右。也可改用95乙醇来替代无水乙醇（价格考虑）。乙醇来替代无水乙醇（价格考虑）。4 沉淀DNA 19 在PH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCL,使Na离子中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，因为过多的盐杂质杂在，影响DNA的酶切等后续反应。在PH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，205DNA的溶解和贮存的溶解和贮存回收的DNA沉淀在溶解以前须在实验台上敞口放置一段时间，使残余的乙醇挥发掉（或真空抽干），然后加入适当体积的TE缓冲液，使DNA溶解。DNA的TE溶液贮存于超低温冰箱（长时间）或20冰箱。5 DNA的溶解和贮存21(二二)DNA提取的几种方法提取的几种方法根据细胞破碎后，分离根据细胞破碎后，分离DNA与蛋白质所采用的技术策略与蛋白质所采用的技术策略不同，可分为以下几种：不同，可分为以下几种：1浓盐法浓盐法原理：原理：RNP和和DNA在电解溶液中溶解度不同，从而分离。在电解溶液中溶解度不同，从而分离。方法：用方法：用1mol/LNaCl抽提，得到的抽提，得到的DNP黏液中加入含有黏液中加入含有少量辛醇的氯仿一起揺荡，使之乳化，再离心，使蛋白质少量辛醇的氯仿一起揺荡，使之乳化，再离心，使蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中。位于上层水相中。回收水相，用回收水相，用2倍体积倍体积95%乙醇可将乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。钠盐沉淀出来。(二)DNA提取的几种方法222.SDS法法细胞破碎后，加入细胞破碎后，加入SDS使细胞膜裂解，并同时使蛋白使细胞膜裂解，并同时使蛋白质变性，将蛋白质和多糖等杂质与质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA分开，加入分开，加入乙酸钾，可使乙酸钾，可使SDS-蛋白质复合物转变成溶解度更小的蛋白质复合物转变成溶解度更小的钾盐形式，沉淀更加完全。钾盐形式，沉淀更加完全。3.CTAB法法细胞破碎后，加入细胞破碎后，加入CTAB分离缓冲液，将分离缓冲液，将DNA溶解出来溶解出来再经氯仿异戊醇抽提，除去蛋白，得到再经氯仿异戊醇抽提，除去蛋白，得到DNA2.SDS法234.苯酚抽提法苯酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用。酶的降解作用。苯酚处理后，蛋白质分子溶于酚相，而苯酚处理后，蛋白质分子溶于酚相，而DNA溶于水相，溶于水相，离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并水相，用离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并水相，用乙醇沉淀乙醇沉淀DNA.5.水抽提法水抽提法利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中，使然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解充分溶解于水中，离心后收集上清液，在上清中加入于水中，离心后收集上清液，在上清中加入NaCl调节至调节至2.6mol/L，加入，加入2倍体积的倍体积的95%乙醇，立即用搅拌法搅出，乙醇，立即用搅拌法搅出，然后用不同浓度的乙醇洗涤。空气干燥。然后用不同浓度的乙醇洗涤。空气干燥。4.苯酚抽提法24有多种从细菌中提纯质粒有多种从细菌中提纯质粒DNA的方法，无一例外都包括以下的方法，无一例外都包括以下三个步骤：三个步骤：培养细菌培养细菌氯霉素的加入氯霉素的加入收集和裂解离心收集和裂解离心寄主细胞裂解：可采用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂寄主细胞裂解：可采用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂或碱处理及加热处理等。根据质粒大小、菌株和裂解后用于或碱处理及加热处理等。根据质粒大小、菌株和裂解后用于纯化质粒纯化质粒DNA的技术，采用不同的方法。的技术，采用不同的方法。用溶菌酶或十二烷基硫酸钠（）用溶菌酶或十二烷基硫酸钠（）(三）质粒的提取三）质粒的提取质粒的提取是基因工程研究中经常性的工作。质粒的提取是基因工程研究中经常性的工作。有多种从细菌中提纯质粒DNA的方法，无一例外都包括以下(三）25纯化质粒纯化质粒DNA染色体分子以高分子量的形式释放，可用高染色体分子以高分子量的形式释放，可用高速度心方法除去得到清裂解液。但仍然会含有相当速度心方法除去得到清裂解液。但仍然会含有相当数量的片段化的染色体分子。因此必须进行数量的片段化的染色体分子。因此必须进行纯化。纯化。纯化质粒DNA26铯是铯是5555号元素，由号元素，由WihelmBunsenWihelmBunsen于于18551855年发现。由于铯原子很年发现。由于铯原子很重，重，CsClCsCl的浓缩液在高速离心数小时后即可形成密度梯度。大分的浓缩液在高速离心数小时后即可形成密度梯度。大分子物质的浮力密度如与密度梯度中某一位置的子物质的浮力密度如与密度梯度中某一位置的CsClCsCl浓度相符，大浓度相符，大分子物质就会准确地漂浮在这一位置上分子物质就会准确地漂浮在这一位置上.离心管中离心管中CsClCsCl起始溶液的密度通常要进行调整起始溶液的密度通常要进行调整,使其与有待研究的使其与有待研究的分子或颗粒的密度相对应。分子或颗粒的密度相对应。如多数双链线状如多数双链线状DNADNA分子的浮力密度约为分子的浮力密度约为1.70g/ml,1.70g/ml,形成梯度形成梯度的的CsClCsCl溶液的起始密度应为溶液的起始密度应为1.70g/ml1.70g/ml1氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法铯是55号元素，由Wihelm Bunsen于1855年发现27细胞裂解及分离过程中，大分子量的细菌染色体容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒则由于其分子量较少，结构紧密，所以仍保持完整状态。根据此差别进行密度梯度离心纯化。细胞裂解及分离过程中，大分子量的细菌染色体容易发28 利用在浓缩的盐溶液中，溴化乙锭（EB)扁平分子在碱基对之间的嵌入作用。染色体分子线性片段具有游离的末端而易于解旋，可结合大量的EB分子。而质粒的共价闭合环状的分子，由于没有游离末端，只能发生有限的解旋反应，结合分子的数量少。分子结合数量越多，则密度越小。密度梯度离心后，处于不同的位置，从而达到纯化质粒之目的。利用在浓缩的盐溶液中，溴化乙锭（EB)扁平分子在29第一节DNA和RNA的提取与纯化课件30第一节DNA和RNA的提取与纯化课件312碱变性抽提法碱变性抽提法染色体DNA为线性DNA分子，质粒DNA为超螺旋共价闭合环状DNA.根据共价闭合环状质粒与线性染色体片段之间在拓扑学的差异而发展出来的。通过加热，尤其在pH值介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性的会被变性，而cccDNA则不会变性。即根据染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。2碱变性抽提法32变性处理过的质粒和染色体混合物，通过致冷或恢复中性pH，便会迅速地复性。在复性过程中，两种构型的分子，其双链再结合的精确性有本质上的差别，所以复性快而准确。而随机断裂产生的线性的染色体分子，彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会迅速。常聚集成网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及一道沉淀下来。从而分离。变性处理过的质粒和染色体混合物，通过致冷或恢复33碱变性法一般要用到三种溶液即:溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部 EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉.Tris-Cl 控制溶液的pH 溶液II，新鲜的0.4 N的NaOH和1的SDS等体积混合；新鲜的NaOH,是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性这一步要注意:第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦.碱变性法一般要用到三种溶液即:34这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀.SDS专门和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。2M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了.溶液溶液III，3M 醋酸钾醋酸钾/2 M 醋酸。醋酸。溶液溶液III加入后就会有大量的沉淀加入后就会有大量的沉淀.这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sul353影响质粒产量的因素影响质粒产量的因素1.寄主菌株的遗传背景使用endA基因突变的菌株，失去了合成具有功能活性的核酸内切酶能力，从而增进所含有的质粒分子的稳定性。2.质粒的拷贝数及分子大小理论产量=质粒拷贝数*分子量大小*每亳升培养液中的大肠杆菌细胞总数3影响质粒产量的因素1.寄主菌株的遗传背景使用endA36RNARNA性质与结构性质与结构核糖核酸。因为核糖残基在2 带有羟基,所以RNA比DNA的化学性质活跃,易被污染的RNA酶（具有水解核糖残基和磷酸二酯键能力的酶）切割。二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法（一）总（一）总RNA提取的原理与方法提取的原理与方法1.总总RNA提取的原理提取的原理RNA性质与结构二、RNA提取的基本原理与方法（一）总RN37(1)(1)单链状，但许多区单链状，但许多区域可自身进行碱基配对，域可自身进行碱基配对，形成回折。形成回折。(1)单链状，但许多区域可自身进行碱基配对，形成回折。38(2)(2)碱基配对规则：碱基配对规则：A-UA-U，G-CG-C，不能配对，不能配对区域形成突起。区域形成突起。(3)RNA(3)RNA分子比分子比DNADNA分子小得多，一般含几分子小得多，一般含几十至几千个核苷酸十至几千个核苷酸核苷酸之间的连结方核苷酸之间的连结方式：式：3,5-3,5-磷酸二酯磷酸二酯键键(2)碱基配对规则：A-U，G-C，不能配对区域形成突起。39提取提取RNA的关键的关键分离纯化完整的分离纯化完整的mRNAS是进行分子克隆和基因表达分析是进行分子克隆和基因表达分析的基础，真核生物的基础，真核生物RNA分子方要分布于细胞质和核仁，其中分子方要分布于细胞质和核仁，其中mRNA占总占总RNA的的1-5%，分子量大小不一，多数与蛋白质结，分子量大小不一，多数与蛋白质结合成核蛋白体的形式存在。合成核蛋白体的形式存在。能否成功地提取真核生物的能否成功地提取真核生物的RNA,关键在于能否完全抑制或关键在于能否完全抑制或除去除去RNA酶活性，分离获得全长酶活性，分离获得全长RNA。提取RNA 的关键40 RNARNA酶的特点酶的特点酶的特点酶的特点(1)RNA酶的稳定性酶的稳定性由于RNA酶链内二硫键的存在，使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。所以RNA酶很稳定酶很稳定。(2)RNA酶分布的广泛性酶分布的广泛性RNA酶是所有生物生存所必须的酶.玻璃器皿、操作平台、以及浮尘中,人类的身体表面都有。RNA酶的特点41(3)RNA酶的活性酶的活性和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子酶不需要二价阳离子激活激活，因此难以被缓冲溶液中加入的EDTA或其他金属离子螯合剂失活。所以在提取RNA时，防止RNA酶的降解是最重要的环节。防止RNA酶的最好办法就是在第一步即避免污染。(3)RNA酶的活性42外源性的外源性的RNA酶通常有两个来源：酶通常有两个来源：（1）被被污污染染的的缓缓冲冲液液：由于粗心的无菌操作，使缓冲液被细菌或其他的微生物污染。不能通过高压灭菌而除去，被污染的溶液或怀疑可能污染的溶液必须丢弃。（2）移移液液装装置置：如果自动移液器以前被用来分配含有RNA酶的溶液，那么使用一次性没有RNA酶的移液器头已经没有意义。如果移液器枪管或金属枪栓与试管的边缘接触，它就成了非常有效的散布RNA酶的载体。外源性的RNA酶通常有两个来源：43 进行RNA操作时，为了防止RNA酶，所采取的措施包括：（1 1）仪仪器器和和缓缓冲冲液液专专用用，如移液器，电泳槽、玻璃器皿、塑料制品和缓冲液。对于移液器，用声誉好的厂家证明无RNA酶的一次性移液器枪头和微量离心管。为了减少污染的机会，当从原包装取出这些小的器具放到实验室架子上时最好用无菌的镊子。所用的溶液以及玻璃器皿以及电泳装置等都要用RNA酶抑制剂进行处理。（2）在分离RNA的过程中，用抑制剂以抑制抑制剂以抑制RNA酶的活性酶的活性。进行RNA操作时，为了防止RNA酶，所采取的措施44RNARNA酶的抑制剂类型酶的抑制剂类型酶的抑制剂类型酶的抑制剂类型焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC）是一种高活性的烷化剂，通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNA酶的活性。用来灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNA酶。氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性。因为该复合物不能共价修饰RNA酶，因此在提取纯化RNA的各个步骤中都必须应用。由于该复合物强烈抑制RNA聚合酶和RNA在体外的翻译，因此必须用0.1%的羟基喹啉的苯酚多次抽提以从最终产物中除去。RNA酶的抑制剂类型焦碳酸二乙酯（DEPC）氧钒核糖核苷复合45RNA酶的蛋白质抑制剂酶的蛋白质抑制剂 这类蛋白质可以与RNA酶非共价的结合，形成复合物从而使RNA酶失活。不同商家出售的商业名称不同，如RNAsin,Promega,PrimeInhibitor,5Prime3Primer等。由于它们不能在变性剂如SDS和胍存在时使用，所以在裂解细胞时，不能加此类蛋白。但在随后的纯化RNA的所有步骤中均可使用。由于可以被抽提用的苯酚除去，所以在纯化过程中需补充几次抑制剂。RNA酶的蛋白质抑制剂46提取提取RNA的关键点：的关键点：细胞的有效破碎细胞的有效破碎使核蛋白复合体充分变性，解离，使核酸释放到溶液中。使核蛋白复合体充分变性，解离，使核酸释放到溶液中。有效的抑制有效的抑制RNARNA酶的活性酶的活性将将RNARNA和和DNADNA、蛋白质和多糖分开。、蛋白质和多糖分开。方法：方法：（）先提总核酸，然后用氯化锂将（）先提总核酸，然后用氯化锂将RNARNA沉淀出来。沉淀出来。（）直接在酸性条件下酚氯仿混合液抽提，低（）直接在酸性条件下酚氯仿混合液抽提，低pHpH的酚将的酚将使使RNARNA进入水相，使其与仍留在有机相中的蛋白质和进入水相，使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNADNA分开。分开。水相中的水相中的RNARNA分子用异丙醇沉淀浓缩，然后复溶于异硫氰酸胍分子用异丙醇沉淀浓缩，然后复溶于异硫氰酸胍溶液中，再用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，溶液中，再用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质与无机盐。即可去除所有残留的蛋白质与无机盐。提取RNA的关键点：47RNA的贮存的贮存用去离子甲酰胺溶解并贮存于20。RNA的贮存482.总总RNA的提取方法的提取方法酚异硫氰酸胍酚异硫氰酸胍(GIT)提取法提取法原原理理如如下下：GIT与与巯巯基基乙乙醇醇共共同同作作用用抑抑制制RNase的的活活性性；GIT与与十十二二烷烷基基肌肌氨氨酸酸钠钠（Sarcosyl）作作用用使使蛋蛋白白质质变变性性，从从而而释释放放RNA；酸酸性性条条件件下下DNA极极少少发发生生解解离离，同同蛋蛋白白质质一一起起变变性性被被离离心心下下来来，RNA则则溶溶于于上上清清中中。该该法法所所提提RNA纯纯度度高高,完完整整性性好好较较适适合合纯纯化化mRNA，逆逆转转录录及及构构建建cDNA文文库库，因因此此为为大大多多数数人人采采用用。与与氯氯化化铯铯方方法法比比较较，虽虽然然纯纯度度稍稍差差一一些些，小小分分子子RNA，如如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。离心分离法离心分离法利利用用RNA吸吸附附硅硅胶胶或或玻玻璃璃质质离离心心管管代代替替有有同同溶溶剂剂提提取取步步骤骤，可可避避免免有有机机溶溶剂剂的的损损伤伤。如如Qiagen公公司司开开发发设设计计的试剂的试剂盒盒.2.总RNA的提取方法49（二）（二）mRNA的提取的提取1、RNA的种类及其结构（二）mRNA的提取1、RNA的种类及其结构50tRNA分子功能：tRNA：转运RNA，负责运送氨基酸tRNA分子功能：tRNA：转运RNA，负责运送氨基酸51tRNA分子特点：v数百种，分子量小，只有数百种，分子量小，只有73-9373-93个核苷酸组成，个核苷酸组成，主要特点为含稀有核苷主要特点为含稀有核苷。v有较多的修饰成分有较多的修饰成分tRNA分子特点：数百种，分子量小，只有73-93个核苷酸组52vA-UA-U，G-CG-C碱基对双螺旋碱基对双螺旋区为臂，其它区域为环。区为臂，其它区域为环。四臂四环。四臂四环。v33端都为端都为CCACCA，用以接，用以接受氨基酸，叫叶柄；受氨基酸，叫叶柄；55端都为端都为pGpG v有十几个恒定的核苷酸，有十几个恒定的核苷酸，对于维持其空间结构和对于维持其空间结构和实现生物功能起重要作实现生物功能起重要作用用tRNA分子A-U，G-C碱基对双螺旋区为臂，其它区域为环。四臂四环。353vA-UA-U，G-CG-C碱基对双螺旋碱基对双螺旋区为臂，其它区域为环。区为臂，其它区域为环。四臂四环。四臂四环。v33端都为端都为CCACCA，用以接，用以接受氨基酸，叫叶柄；受氨基酸，叫叶柄；55端都为端都为pG pG v有较多的修饰成分有较多的修饰成分有较多的修饰成分有较多的修饰成分tRNA分子A-U，G-C碱基对双螺旋区为臂，其它区域为环。四臂四环。354v反密码环由反密码环由反密码环由反密码环由7 7 7 7个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸组成，有组成，有组成，有组成，有3 3 3 3个反密码子个反密码子个反密码子个反密码子v可变环，由可变环，由3-183-18核苷核苷酸组成酸组成v二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶(D(D环环)tRNA分子vT TCC(为假尿苷为假尿苷)反密码环由7个核苷酸组成，有3个反密码子可变环，由3-18核553、tRNA的三级结构倒倒L L型型：一端是一端是CCACCA，另一端是反密码子环。，另一端是反密码子环。二级结构：三叶草形二级结构：三叶草形四环四环 二氢尿嘧啶环（二氢尿嘧啶环（D D环）、反密码环、额外环、环）、反密码环、额外环、T T C C环环四臂四臂 氨基酸臂、二氢尿嘧啶臂、反密码臂、氨基酸臂、二氢尿嘧啶臂、反密码臂、T T C C臂臂结结构构为为行行使使功功能能提提供基础供基础tRNA分子3、tRNA的三级结构 倒L型：一端是CCA，另一端是反56第一节DNA和RNA的提取与纯化课件57rRNA分子v占细胞内总占细胞内总RNARNA的的8080左右，由左右，由120-5000120-5000个核苷酸组成，个核苷酸组成，但种类很少，只有但种类很少，只有3-43-4种。种。rRNA分子占细胞内总RNA的80左右，由120-500058rRNA分子结构特点v与蛋白质结合，组成大小亚基。与蛋白质结合，组成大小亚基。v具有酶功能，如核酶。具有酶功能，如核酶。v合成蛋白质的场所。合成蛋白质的场所。v二级结构可形成茎环结构。二级结构可形成茎环结构。rRNA分子结构特点与蛋白质结合，组成大小亚基。具有酶功能59也呈茎也呈茎环结构环结构大肠杆菌大肠杆菌 5S rRNA 5S rRNA 的二级结构模型的二级结构模型rRNA分子也呈茎环结构大肠杆菌 5S rRNA 的二级结构模型rRNA60大肠杆菌大肠杆菌 5S rRNA 5S rRNA 的三级结构模型的三级结构模型rRNA分子大肠杆菌 5S rRNA 的三级结构模型rRNA分子61mRNA分子原核生物和真核生物的原核生物和真核生物的原核生物和真核生物的原核生物和真核生物的mRNAmRNAmRNAmRNA在结构上有所不同：在结构上有所不同：在结构上有所不同：在结构上有所不同：1)1)原原核核生生物物的的mRNAmRNA是是多多顺顺反反子子的的，真真核核生生物物的的mRNAmRNA是单顺反子的；是单顺反子的；2)2)原原核核mRNA mRNA 55端端无无帽帽子子结结构构，真真核核mRNA mRNA 55端端有一段帽子结构（有一段帽子结构（m m7 7GpppNmpNmpGpppNmpNmp-）；）；3)3)原核原核mRNA 3mRNA 3端无端无PolyAPolyA，真核，真核mRNA 3mRNA 3端有端有PolyAPolyA。mRNA分子原核生物和真核生物的mRNA在结构上有所不同：162mRNA分子v含量少，单链分子大小不一，也能形成茎环结构。含量少，单链分子大小不一，也能形成茎环结构。vmRNAmRNA是蛋白质生物合成的模板。是蛋白质生物合成的模板。v每一种蛋白质都有对应的每一种蛋白质都有对应的mRNAmRNA，种类多。，种类多。mRNA分子含量少，单链分子大小不一，也能形成茎环结构。mR632、真核生物mRNA的分离（1)得到总RNA后，可用可用oligo(dT)-纤维素层析法提取纤维素层析法提取mRNApoly(A)+RNA.其原理是大多数真核mRNA3端带有足够长的多聚腺苷酸残基，可通过其与挂有寡聚d(T)的纤维素亲和形成稳定的RNADNA杂合链，不含polyA的RNA从介质中洗去后，应用低盐缓冲液解离双链结构，并从介质中洗脱poly(A)+RNA,从而使mRNA得以纯化。这些相异的mRNA分子合起来，实际上编码了细胞内所有的多肽。有柱层析的方法和批量层析两种。2、真核生物mRNA的分离（1)得到总RNA后，可用olig64（2)2)提提取取mRNA的的另另一一种种方方法法是是包包被被抗抗生生素素蛋蛋白白链链菌菌素素的的聚乙烯磁珠法聚乙烯磁珠法其优点是可以直接从含异硫氰胍的裂解液中分离mRNA。在典型的实验中，组织、细胞或细胞悬液用硫氰胍裂解，将带生物素的oligo（dT）引物直接加入裂解液，放置一段时间，使引物与细胞mRNApoly(A)尾杂交，然后加入交联抗生素蛋白链菌素的磁珠。抗生素蛋白链菌素抓住带生物素的oligo(dT)+复合物，使它们附于磁珠上，然后用磁体将磁珠从裂解液中回收，以便用高高盐盐溶溶液液洗洗涤涤磁磁珠珠。最后，用水将poly(A)+mRNA从磁珠上洗脱，用乙醇沉淀收集。用磁珠法获得的poly(A)+mRNA与传统的oligo(dT)-纤维素层析相当或更多。（2)提取mRNA的另一种方法是包被抗生素蛋白链菌素的聚乙烯65最大的优点是操作快，配体结合仅需几分钟，磁力分离只需几秒钟，洗涤和洗脱在大多数时候仅需5min或更短的时间完成。但磁珠法有两个最大的问题：（1）一次只能处理最多1g组织或细胞，（2）磁珠昂贵。最大的优点是操作快，配体结合仅需几分钟，磁力分离只需几秒钟，66三、核酸浓度纯度和相对分子质量的测定三、核酸浓度纯度和相对分子质量的测定广泛用于测定制备物中核酸的质量的方法有两类。1若若样样品品较较纯纯时时，可通过分光光度法测定碱基吸收紫外线的量，既简便又准确。其原理是由于核酸是在260nm处有强吸收的化合物。三、核酸浓度纯度和相对分子质量的测定1若样品较纯时，可通过分67常用260nm和280nm处吸收光度的比值检查DNA和RNA制品中蛋白类杂质的污染程度。由于DNA和RNA的比吸光系数均受溶液中离子强度和PH值的影响，因此只有在仔细控制PH值且离子强度较低时才能测定准确。溶液体积小时吸光度难以测定。该方法仅在很窄的浓度范围内可靠（590l/ml）。常用260nm和280nm处吸收光度的比值检查DNA和RNA68定量：一般根据260nm处的读数可计算出样品中的核酸浓度，1个OD值相当于约50gml双链DNA、40gml单链DNA和RNA及33gml单链寡核苷酸。纯度：DNA和RNA纯制品的OD260：OD280值分别为1.8和2.0，若样品中蛋白或酚的污染严重则OD260：OD280较低。OD260OD230应大于2.0，在230处的强吸收则提示污染有酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物。对于DNA制备，如果OD260OD280大于1.9则说明有RNA污染。小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。定量：69纯的RNA溶液OD260：OD280的比值应介于1.7-2.0，OD260OD230应大于2.0。RNA样品OD260OD280的比值小于1.7，说明有蛋白质或苯酚污染。比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍等污染。OD260OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质。纯的RNA溶液702若若样样品品中中DNA或或RNA含含量量较较低低或或含含有有较较多多的的杂杂质质，则可通过溴化乙锭或Hoechst33258发出的荧光估测核酸含量。（不常用，如需要可查分子克隆）2若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多的杂质，则可通过溴713DNA质量的电泳测定质量的电泳测定在一般分子标记试验时要通过琼脂糖电泳结合分光光度分来对DNA质量进行检测。植物总（核）DNA样品在琼脂糖电泳时呈现一条迁移率很小的整齐条带，如果有拖尾情况（即溴酚兰前有弥散的荧光区出现）则表明样品中存在着RNA杂质，如果电泳时不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明DNA已严重降解，提取失败。3 DNA质量的电泳测定72在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋(SC)的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂则形成线状DNA(L)分子.三种构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，73第一节DNA和RNA的提取与纯化课件744DNA质量的酶切检测质量的酶切检测对于需要进行酶切试验，如果必要的话，还要进行酶切检测。方法：取2gDNA,用10单位(U)Hind酶切过夜,0.7%agarose胶上电泳,检测能否完全酶解4 DNA质量的酶切检测75