--花药与花粉培养课件

第六章第六章 花药与花粉培养花药与花粉培养第一节第一节 概述概述图图8.1 8.1 花药（花药（A A）和花粉（）和花粉（P P）培养的雄核发育和单倍体植株的各种方式图解）培养的雄核发育和单倍体植株的各种方式图解第二节第二节 小孢子的形成和花粉的发育途径小孢子的形成和花粉的发育途径一、小孢子的正常发育一、小孢子的正常发育二、花药培养时花粉发育途径二、花药培养时花粉发育途径1 1营养细胞发育途径（营养细胞发育途径（A A型）型）2 2生殖细胞发育途径生殖细胞发育途径3 3营养细胞和生殖细胞并进发育途径营养细胞和生殖细胞并进发育途径4 4花粉均等分裂途径花粉均等分裂途径一、小孢子的正常发育一、小孢子的正常发育第一期第一期:四分孢子形成期四分孢子形成期 第二期第二期:单核期单核期特点：特化的细胞壁逐渐形成。特点：特化的细胞壁逐渐形成。可分为：单核早、中、晚（靠边）可分为：单核早、中、晚（靠边）第三期：双核期第三期：双核期 第四期：三核期第四期：三核期 二、花药培养时花粉发育途径二、花药培养时花粉发育途径1 1、营养细胞发育途径（、营养细胞发育途径（A A型）型）花粉花粉 生殖核（小）生殖核（小）-不分裂或分裂几次后退化不分裂或分裂几次后退化 营养核（大）营养核（大）-经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增殖经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增殖 而突破花粉壁，细胞持续分裂形成类胚体或愈而突破花粉壁，细胞持续分裂形成类胚体或愈 伤组织，最后形成单倍体植株伤组织，最后形成单倍体植株 常见的植物：烟草、大麦、光叶曼陀罗、小麦、小黑麦和辣椒常见的植物：烟草、大麦、光叶曼陀罗、小麦、小黑麦和辣椒2 2、生殖细胞发育途径、生殖细胞发育途径只在天仙子中出现只在天仙子中出现 完全不再分裂完全不再分裂 只分裂有限几次即停止只分裂有限几次即停止营养细胞营养细胞生殖细胞生殖细胞多次分裂多次分裂多细胞团多细胞团发育发育愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体单单倍倍体体植植株株3 3、营养细胞和生殖细胞并进发育途径、营养细胞和生殖细胞并进发育途径营养细胞营养细胞多次分裂多次分裂大的多细胞团大的多细胞团生殖细胞生殖细胞多次分裂多次分裂小的多细胞团小的多细胞团同时发育同时发育愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体单单倍倍体体植植株株只见于南洋金花中只见于南洋金花中 DNA复制两种营养核两种营养核发生融合发生融合发育发育2n2n、3n3n或或4n4n胚状体胚状体有两种情况有两种情况 1 1 2 2 4 4、花粉均等分裂途径、花粉均等分裂途径这个途径在南洋金花中相当普遍这个途径在南洋金花中相当普遍生殖细胞生殖细胞多次分裂多次分裂多细胞团多细胞团发育发育愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体单单倍倍体体植植株株营养细胞营养细胞花花粉粉均等分裂均等分裂营养核营养核生核核生核核第三节第三节 花药培养花药培养 概念：概念：花药培养（花药培养（anther cultureanther culture）：）：指用无菌操作指用无菌操作技术将成熟或未成熟的花药接种在人工培养技术将成熟或未成熟的花药接种在人工培养基上，诱导花粉单性发育形成植株的过程基上，诱导花粉单性发育形成植株的过程。一、花药培养的一般操作程序一、花药培养的一般操作程序1.1.培养基的选择培养基的选择2.2.材料选取材料选取3.3.材料预处理材料预处理4.4.材料消毒材料消毒5.5.接种接种6.6.脱分化培养脱分化培养7.7.再分化培养再分化培养8.8.花粉植株移植花粉植株移植9.9.染色体加倍染色体加倍1.1.培养基的选择培养基的选择Nitsch HNitsch H、MSMS被广泛用于双子叶植物的花药培养。被广泛用于双子叶植物的花药培养。B5B5：被广泛用于十字花科及豆科植物的花药培养。：被广泛用于十字花科及豆科植物的花药培养。禾谷类植物的花药培养，早期多采用禾谷类植物的花药培养，早期多采用MillerMiller培养基、培养基、MSMS培养基、培养基、N6N6培养基和马铃薯培养基和马铃薯2 2号培养基。号培养基。Sunderland(1984)Sunderland(1984)设计了设计了C17C17培养基，用于水稻、小培养基，用于水稻、小麦、大麦、小黑麦、黑麦、玉米和甘蔗等禾谷类作物麦、大麦、小黑麦、黑麦、玉米和甘蔗等禾谷类作物的花药培养。的花药培养。2.2.材料选取材料选取植植物物种种减数分裂减数分裂中期中期减数分裂减数分裂晚前期晚前期四分体四分体单核期核期双核期双核期成熟期成熟期水水稻稻小小麦麦玉玉米米油油菜菜大大麦麦番番茄茄茄茄子子辣辣椒椒拟南南 芥芥 菜菜甘甘蓝苹苹果果葡葡萄萄烟烟草草小小黑黑麦麦小小 黑黑 麦麦 羊羊茅茅杨树0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 0不同植物花药培养的合适花粉发育时期 3.3.材料预处理材料预处理低温：高温生长素其他方法处理常能提高愈伤组织和苗分化的频率。4.4.材料消毒材料消毒取回的材料，在接种前进行表面灭菌，一般用7075酒精，将表面擦洗即可。5.5.接种接种在无菌接种室或超净工作台上进行接种操作，在无菌接种室或超净工作台上进行接种操作，采用直径采用直径3cm3cm的试管，每管接种花药的试管，每管接种花药30306060粒。粒。必须注意：在操作过程中，不应使花药受到损必须注意：在操作过程中，不应使花药受到损伤，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体的伤，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体的愈伤组织。损伤的花药要淘汰。愈伤组织。损伤的花药要淘汰。6.6.脱分化培养脱分化培养根据材料不同，选取适宜的基本培养基、根据材料不同，选取适宜的基本培养基、适当的生长素比例和最适的温度进行培养，适当的生长素比例和最适的温度进行培养，经经10103030天可诱导愈伤组织形成。天可诱导愈伤组织形成。7.7.再分化培养再分化培养愈伤组织增殖到愈伤组织增殖到1 13mm3mm大小时，应及时进大小时，应及时进行再分化培养以获得花粉植株。行再分化培养以获得花粉植株。要选择含适当激素水平的培养基进行培养，要选择含适当激素水平的培养基进行培养，约经约经20203030天就能诱导苗的分化。天就能诱导苗的分化。8.花粉植株移植当花粉植株的根系生长良好时，就要及时进行炼苗并移至苗床或大田。试管中花粉植株的移植是一个由异养转变异养转变为自养为自养的过程，必须细心管理，保持幼苗的水分平衡和促进新根的发生。9.染色体加倍人工方法：用0.020.020.4%0.4%秋水仙素秋水仙素处理处理植株，双子叶植物处理生长点或腋芽，禾本科植物在分蘖期处理。单倍体植株可以通过自发的核内有丝分裂产生的二倍体。二、花药培养的方法二、花药培养的方法琼脂固体培养法琼脂固体培养法在培养基中加入在培养基中加入0.50.50.7%0.7%琼脂，使培养基呈半固体状态。加琼脂，使培养基呈半固体状态。加入的琼脂量因琼脂质量而定。入的琼脂量因琼脂质量而定。琼脂浓度一般以花药有琼脂浓度一般以花药有1/3浸入而又不沉没于琼脂中为宜。浸入而又不沉没于琼脂中为宜。液体培养法液体培养法液体培养的培养基厚约液体培养的培养基厚约0.5cm,若能让花药漂浮在液若能让花药漂浮在液面上面上,效果最好。效果最好。加入聚蔗糖加入聚蔗糖(Ficoll),可使花药不下沉而漂浮在液面可使花药不下沉而漂浮在液面上上。第四节第四节 花粉培养花粉培养 u含义：含义：u花粉培养花粉培养(pollen culture)是指把花粉从花药中剥离出来，在无菌的人工环境是指把花粉从花药中剥离出来，在无菌的人工环境中，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养使其进一步生长发育的技术。中，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养使其进一步生长发育的技术。u优点：优点：u在于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是在于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株，不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细胞植单倍体植株，不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细胞植株。株。u花粉是研究细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机制的较为理想的材料。建花粉是研究细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机制的较为理想的材料。建立花粉培养实验系统也可为深入开展细胞工程、遗传工程和分子生物学的研立花粉培养实验系统也可为深入开展细胞工程、遗传工程和分子生物学的研究提供技术基础。究提供技术基础。一、花粉培养的一般操作程序一、花粉培养的一般操作程序花粉培养与花药培养的一般操作程序基本相同。花粉培养与花药培养的一般操作程序基本相同。花粉培养在花粉培养在材料消毒后要将花粉从花药中分离材料消毒后要将花粉从花药中分离出出来，再进行接种，其基本操作程序可参照花药培来，再进行接种，其基本操作程序可参照花药培养。养。二、花粉的分离方法二、花粉的分离方法自然散落法自然散落法把花药从未开的花中在无菌条件下取出，直接插接在无菌培养把花药从未开的花中在无菌条件下取出，直接插接在无菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，让花粉继续培养生长。如果是液体培养基，可接种大量花药，让花粉继续培养生长。如果是液体培养基，可接种大量花药，经经12天，大量花粉散落入培养基中，经离心浓缩收集，再接天，大量花粉散落入培养基中，经离心浓缩收集，再接种培养。种培养。机械挤压法机械挤压法优点：操作简便优点：操作简便缺点：花粉中混杂有体细胞并且所得的悬浮液中花缺点：花粉中混杂有体细胞并且所得的悬浮液中花粉密度也不易控制。粉密度也不易控制。三、花粉培养的方法三、花粉培养的方法u直接培养法直接培养法u从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中分离花粉粒，直接接种到培从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中分离花粉粒，直接接种到培养基中进行培养的方法为直接培养。养基中进行培养的方法为直接培养。u预培养法预培养法u将花药在基本培养基中预培养将花药在基本培养基中预培养36天，然后取出花粉，经离心冲洗后，天，然后取出花粉，经离心冲洗后，在液体培养基中进行培养，密度为在液体培养基中进行培养，密度为105个个/ml。培养三周后，可见到各。培养三周后，可见到各个阶段的花粉胚；个阶段的花粉胚；45周后，可发育成小植株。周后，可发育成小植株。u看护培养法看护培养法u先把植物的完整花药放在半固体琼脂培养基表面，然后在花药上覆盖先把植物的完整花药放在半固体琼脂培养基表面，然后在花药上覆盖一张滤纸小圆片，用移液管吸取一张滤纸小圆片，用移液管吸取0.5ml花粉悬浮液，密度是每毫升含花粉悬浮液，密度是每毫升含有有20个花粉粒，滴在滤纸圆片上，置于个花粉粒，滴在滤纸圆片上，置于26下培养。下培养。u条件培养法条件培养法u在合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花粉进行培养。在合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花粉进行培养。u由于失活的花药提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养由于失活的花药提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功。添加花药提取物的浓度随植物的种类而异。成功。添加花药提取物的浓度随植物的种类而异。u哺养培养哺养培养u微室培养微室培养u将花粉粒接种在盖玻片或载玻片制作的一个微室的环境中进行培养。将花粉粒接种在盖玻片或载玻片制作的一个微室的环境中进行培养。四、影响花药和花粉培养的因素四、影响花药和花粉培养的因素u材料的基因型材料的基因型u供体植株的生活环境供体植株的生活环境u个体发育的时期：开花早期的花药比开花后期的更易产生花粉个体发育的时期：开花早期的花药比开花后期的更易产生花粉植株植株u离体花药预处理离体花药预处理u低温预处理：预处理温度一般最低为低温预处理：预处理温度一般最低为2，最高为，最高为14，处理时间短的仅，处理时间短的仅6小小时，长的达时，长的达35天，天，u高温处理高温处理u其他处理：其他处理：u低温、高温、高渗、饱和水汽、离心磁场、低温、高温、高渗、饱和水汽、离心磁场、Y射线、射线、pH、CO2、ABA、丁酸钠、放线菌素、丁酸钠、放线菌素D，甲基磺酸乙酯，甲基磺酸乙酯u培养基成分培养基成分u基本培养基成分：主要是基本培养基成分：主要是MS、N6，Blaydes(即即Miller)，B5、Nitsch。u植物激素植物激素u生长素，如生长素，如2,4-D、吲哚乙酸（、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（）、萘乙酸（NAA）等，）等，u细胞分裂素如激动素（细胞分裂素如激动素（6-呋喃氨基嘌呤、呋喃氨基嘌呤、KT、K2N）、）、6-BA（6-苄基氨基嘌呤）和玉苄基氨基嘌呤）和玉米（米（ZT、ZEA）u糖：糖：在花药培养中，其蔗糖浓度一般以25%为宜。麦芽糖更佳。upH：当pH值达到5.8时，效果最好。不同浓度蔗糖对烟草花药出苗率的影响不同浓度蔗糖对烟草花药出苗率的影响蔗糖蔗糖（%）接种花药接种花药数数出苗花药出苗花药数数出苗率出苗率0 019190 00 01 17171171723.9323.932 25353202037.7337.733 36464252539.0639.064 47979141417.7217.72第五节第五节 花药与花粉培养的应用及前花药与花粉培养的应用及前景景一、花药培养和花粉培养的应用一、花药培养和花粉培养的应用首先，花药培养可用于常规育种首先，花药培养可用于常规育种u从品种间杂交的杂种一代或二代、三代的花药可培育出纯合二倍体花粉植株，用于品从品种间杂交的杂种一代或二代、三代的花药可培育出纯合二倍体花粉植株，用于品种的选择和鉴定。种的选择和鉴定。u在这种情况下常规育种所必需的多代自交的程序可以被省去，育种的时间也可大大缩在这种情况下常规育种所必需的多代自交的程序可以被省去，育种的时间也可大大缩短，这种方法也可以称为单倍体育种。短，这种方法也可以称为单倍体育种。其次，来源于花粉的纯合二倍体可以作为自交系用于异花传粉植物的杂种优势其次，来源于花粉的纯合二倍体可以作为自交系用于异花传粉植物的杂种优势利用。利用。第三，花药培养技术可用于远缘杂交的育种计划，它可以解决以下三个问题。第三，花药培养技术可用于远缘杂交的育种计划，它可以解决以下三个问题。u从亚种之间的杂种获得稳定而能育的品系。从亚种之间的杂种获得稳定而能育的品系。u从一个种向另一种转移基因。从一个种向另一种转移基因。u产生染色体附加系和代换系产生染色体附加系和代换系u用于细胞诱变选择用于细胞诱变选择第四，用于细胞诱变选择。第四，用于细胞诱变选择。芦笋有性杂交和花药培养程序的比较芦笋有性杂交和花药培养程序的比较（s1、s2、s6代表自交代表自交1代、代、2代、代、6代，代，M1代表组培代表组培1代）代）自花传粉作物常规杂交育种和单倍体育种程序比较自花传粉作物常规杂交育种和单倍体育种程序比较二、花药和花粉培养的局限性二、花药和花粉培养的局限性u我国组织培养工作的老前辈罗士韦（1983）在东京召开的第五次国际组织培养会议上指出：u由于有有用用的的基基因因组的的产生生频率率是是如如此此之之低低，还不不能能认为有有实际的的应用价用价值。u因为诱导所得到的单倍体植株之中，在农艺上有价值的基因型出现的频率比人们所预期的要低的多，这一就是为什么用单倍体育种得到的实用栽培品系非常少的原因。u基础知识还很贫乏：u如单倍体的诱发机制u一个未成熟的小孢子如何能发育成完整植株u如何控制花粉植株的染色体倍性等第六节第六节 花药和花粉培养的应用实花药和花粉培养的应用实例例草莓的花药培养草莓的花药培养1、当花粉发育到单核期时，取花蕾置于洁净培养皿中，皿内放一层滤纸，滴加、当花粉发育到单核期时，取花蕾置于洁净培养皿中，皿内放一层滤纸，滴加蒸馏水保湿，放入蒸馏水保湿，放入34的冰箱中低温预处理的冰箱中低温预处理34天。然后常规灭菌，剥取天。然后常规灭菌，剥取花药接种。用醋酸洋红压片法镜检花粉发育时期。花药接种。用醋酸洋红压片法镜检花粉发育时期。2、愈伤组织诱导以、愈伤组织诱导以MS为基本培养基（为基本培养基（Rosati等用等用GD培养基），附加培养基），附加0.4mg/L、0.5mg/LKT和和2.0mg/L IAA。接种后花药壁很快失水干瘪，似枯死状态。接种后花药壁很快失水干瘪，似枯死状态。20天后陆续产生乳白色带有光亮的愈伤组织。天后陆续产生乳白色带有光亮的愈伤组织。3、将愈伤组织转移到改良、将愈伤组织转移到改良1/2A培养基（除去生物素），附加培养基（除去生物素），附加0.1mg/L GA3、0.5mg/LBA和和4mg/L三十烷醇的分化培养基中，愈伤组织很快转绿，三十烷醇的分化培养基中，愈伤组织很快转绿，15天后天后在表面分化出半球形小突起，在表面分化出半球形小突起，20天后分化出幼叶、幼茎，天后分化出幼叶、幼茎，4、将分化出的高、将分化出的高0.3厘米具厘米具2片小叶的新梢切离愈伤组织，转移到片小叶的新梢切离愈伤组织，转移到MS附加附加0.5mg/LBA、100mg/L LH培养基上增殖壮苗。培养基上增殖壮苗。5、壮苗后的新梢转移到、壮苗后的新梢转移到MS基本培养基上，基本培养基上，6天后形成天后形成34条根。条根。