限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类课件

基基 因因 工工 程程四川大学四川大学 李永红李永红基 因 工 程四川大学 李永红5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程酵母基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念基因工3 3 基因工程的基本条件基因工程的基本条件C C 用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞B B 用于用于基因克隆的载体基因克隆的载体A A 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶3 基因工程的基本条件C 用于基因转移的受体菌或细胞EnzymesA 用于核酸操作的工具酶Enzymes限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA修饰酶修饰酶核酸外切酶核酸外切酶单链单链DNADNA内切酶内切酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA修饰酶核酸外切一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNA分子中的某分子中的某种种特定核苷酸序列特定核苷酸序列（48bp），并由），并由此处此处切割切割DNA双链双链的核酸的核酸内切酶内切酶。（Restriction endonuclease）一、限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶是一类能够识别2.性质性质内切酶。内切酶。原核生物。原核生物。即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。自我保护作用。自我保护作用。3.功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/M体系）体系）1.来源来源2.性质内切酶。原核生物。即在核酸分子链的内部制造切口的酶限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNA切成小片断。切成小片断。（1）限制（）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制细菌自身的细菌自身的DNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲甲基化修饰所保护，不能被自身的限基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。制性内切酶识别切割。（2）修饰（）修饰（Modification）Dam甲基化酶甲基化酶GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二序列在第二个个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的限制性内切酶。的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型II 类限制性内切酶类限制性内切酶 III类限制性内切酶类限制性内切酶 I 型限制性内切酶 目前鉴定出三种不同类型的限制性内首先由首先由M.Meselson和和R.Yuan在在1968年从大肠杆菌年从大肠杆菌 B株株和和 K株株分离的。分离的。（1）识别位点序列）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性内切酶型限制性内切酶 如如 EcoB和和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理）作用机理在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机随机切开一条切开一条单链单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点）切割位点需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理首先由首先由H.O.Smith和和K.W.Wilcox在在1970年从流感嗜血菌中分离出来。年从流感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链双链DNA上的特殊上的特殊靶序列（多数是回文序列）。靶序列（多数是回文序列）。与与DNA的来源无关。的来源无关。2.II类限制性内切酶类限制性内切酶 分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind 首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端产生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端产生平齐末端（2）切割位点）切割位点切开切开双链双链DNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。EcoR I 5-GAATTC-3 EcoR V （3）粘性末端（）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型：5端凸出（如端凸出（如EcoR I切点）切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5（3）粘性末端（sticky ends，cohensive CTGCAG 3端凸出（如端凸出（如Pst I切点）切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC CTGCAG 3端凸出（如Pst I切点）GACG 连接便利连接便利（4）粘性末端的意义）粘性末端的意义i）不同的）不同的DNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个）同一个DNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以通过两个相同的粘性末端可以连接成连接成环形分子环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。连接便利（4）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类课件 补平成平齐末端补平成平齐末端凸出的凸出的3端端可以通过末端转移酶添可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）造成人工粘性末端。等）造成人工粘性末端。5末端标记末端标记凸出的凸出的5末端末端可用可用DNA多核苷酸多核苷酸激酶进行激酶进行32P标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶补平成聚合酶补平成平齐末端。平齐末端。补平成平齐末端凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚识别位点的序列相同的限制性内切酶。识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂酶（）同裂酶（Isoschizomers)完全同裂酶：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。识别位点和切点完全相同。如如Hind 和和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂酶（IsoscXma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。如如Xma I 和和 Sma I。不完全同裂酶：不完全同裂酶：Xma I 5-CCCGGG-3 识别位点相识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等等（6）同尾酶）同尾酶(Isocaudamers）5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；代表嘌呤；Y代表嘧啶。代表嘧啶。识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bg5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点新位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3A5-GATC-3 Sau 3A同尾酶的粘性末端互限制性内切酶的识别和酶切活性一般在限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、一定的温度、离子强度、pH等条件下才等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。表现最佳切割能力和位点的专一性。（7）限制酶的酶活性）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（切割效率，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（星号（*）活性）活性限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的 5 5 M NaAc pH 5.4M NaAc pH 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！7EcoR I和BamH I等都有*活性。在低盐、高pH（8在离它的在离它的不对称识别位点不对称识别位点一侧一侧的的特定距离特定距离处切割处切割DNA双链。双链。（8）s型限制性内切酶型限制性内切酶移动切割（移动切割（shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNNNN 5 3 在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（8）3.III类限制性内切酶类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要，但反应需要ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG3.III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性特性特性特性I I类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶II类内切酶类内切酶IIIIII类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶限制和修饰活限制和修饰活限制和修饰活限制和修饰活性性性性单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶内切酶和甲基化酶内切酶和甲基化酶分开分开共同亚基的双功能酶共同亚基的双功能酶共同亚基的双功能酶共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白内切酶的蛋白内切酶的蛋白内切酶的蛋白结构结构结构结构3 3种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基单一成分单一成分2 2种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基限制作用所需限制作用所需限制作用所需限制作用所需要的辅助因子要的辅助因子要的辅助因子要的辅助因子ATPATP、MgMg2+2+和和和和SAMSAMMg2+ATPATP、MgMg2+2+和和和和SAMSAM寄主特异性位寄主特异性位寄主特异性位寄主特异性位点识别序列点识别序列点识别序列点识别序列EcoBEcoB：TGA(N)TGA(N)8 8TGCT TGCT EcoKEcoK：AAC(N)AAC(N)6 6GTGCGTGC回文序列回文序列（IIs型除外）型除外）EcoP1:EcoP1:AGACC AGACC EcoP15:EcoP15:CAGCAGCAGCAG核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶I切割位点切割位点在距离识别位点在距离识别位点至少至少1000 bp处随机切开一处随机切开一条单链。条单链。位于寄主特异性位于寄主特异性位点或其附近位点或其附近距寄主特异性位距寄主特异性位点点3端端2426bp处处酶催转换酶催转换不能不能能能能能DNA易位作用易位作用能能不能不能不能不能甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进识别未甲基化的序列进行切割行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割不是不是是是是是基因工程中的用途基因工程中的用途无用无用十分有用十分有用切割位点在距离识别位点至少1000 位于寄主特异性位点或其附1973年年H.O Smith和和D.Nathans提议提议的命名系统，命名原则如下：的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名1.用用属名属名的第一个字母和的第一个字母和种名种名的头两个字的头两个字母组成母组成3个字母的略语表示个字母的略语表示寄主菌寄主菌的物的物种名。种名。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用）用Hin表示。表示。1973年H.O Smith和D.Nathans提议的命名4.限制酶前面要带上限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上修饰酶前面要带上M（Modification）。）。（现已省略）。（现已省略）。2.用一个右下标的大写字母表示用一个右下标的大写字母表示菌株或菌株或型型。如。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，（现在都写成平行，如如EcoRI）。）。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如母表示。如EcoR I，EcoR V。4.限制酶前面要带上R（Restriction)，2.DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度的纯度 四、影响限制性内切酶活性的因素四、影响限制性内切酶活性的因素纯化纯化DNA 加大酶的用量加大酶的用量 延长保温时间延长保温时间 扩大反应体积（扩大反应体积（20 l）一般采取一般采取DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：2.DNA的甲基化程度的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）；）；dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCA/TGG的的C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。失活突变的菌株。大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是大多数是37 oC，少数要求，少数要求40-65 oC。酶酶酶酶最适温度最适温度最适温度最适温度o oC C酶酶酶酶最适温度最适温度最适温度最适温度o oC C酶酶酶酶最适温度最适温度最适温度最适温度o oC CApa I Apa I Bcl I Bcl I Mae II Mae II Taq ITaq I30 30 50 50 50 50 6565Apy I Apy I BstE II BstE II Mae IIIMae III30 30 60 60 5555Ban I Ban I Mae I Mae I Sma ISma I50 50 45 45 25253.温度温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液缓冲液(Buffer)（1）缓冲液的化学组成）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供提供Mg2+和离子强度；和离子强度；Tris-HCl：维持维持pH；二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)五、限制性内切酶对五、限制性内切酶对DNA的消化的消化1.内切酶与识别序列的结合模式内切酶与识别序列的结合模式 1986年年J.A.McClarin等通过等通过X射线射线晶体衍射发现晶体衍射发现II类限制酶是以类限制酶是以同型同型二聚体二聚体的形式与靶序列结合。的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG五、限制性内切酶对DNA的消化1.内切酶与识别序列的结合模内切酶在内切酶在DNA上的上的所有所有识别位点都识别位点都被切开。被切开。2.完全消化完全消化 12 341234内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2.完全消化 只有有限数量的酶切位点被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。少酶的用量可达到局部消化的目的。3.局部消化局部消化 12 3414?只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温大多数酶可用大多数酶可用65 oC温育温育5分钟失活。分钟失活。或用或用乙醇乙醇沉淀沉淀DNA。4.限制酶酶切反应的终止限制酶酶切反应的终止 5.几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。4.限制酶酶切反应限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类课件6.限制性内切酶识别序列的交叉列表限制性内切酶识别序列的交叉列表 AATT AATT ACGT ACGT AGCT AGCT ATAT ATAT CATG CATG CCGG CCGG *MaeII MaeII HpaHpac c MspIMspIc c *Alu I Alu I*A A *T*T Nla Nla A*A*T*T ApoIApoI HindHind Afl IIIAfl III AgeI AgeI BsrFI BsrFI A*A*T*T A*A*T*T SspI SspI A*A*T T 6.限制性内切酶识别序列的交叉列表 AATT ACGT AAATT AATT ACGT ACGT AGCT AGCT ATAT ATAT CATG CATG CCGG CCGG A*A*T T Nsp7524 Nsp7524 C C *G*G NcoI NcoI StyI StyI Dsa IDsa I XmaI XmaI AvaI AvaI C*C*G*G NdeI NdeI C*C*G*G Pml I Pml I BsaAI BsaAI PvuII PvuII NspBIINspBII SmaI SmaI C*C*G*G C*C*G G GG *C*C EcoRI EcoRI ApoI ApoI NgoMI NgoMI BsrFI BsrFI AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG AATT AATT ACGT ACGT AGCT AGCT ATAT ATAT CATG CATG CCGG CCGG G*G*C*CBseHI BseHI G*G*C*CEcl136II Ecl136II EcoRV EcoRV NaeI NaeI G*G*C*CG*G*C C AatII AatII SacI SacI BanII BanII HgiAI HgiAI Bsp1286Bsp1286 SphI SphI Nsp7524 Nsp7524 T T *A*A BspHI BspHI BspMII BspMII T*T*A*A T*T*A*A SnaBI SnaBI BsaAIBsaAI T*T*A*A T*T*A A AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG CGCG CGCG CTAG CTAG GATC GATC GCGC GCGC GGCC GGCC *MboIMboIc c Sau3AISau3AIc c *BfaI BfaI HinpI HinpI*BstUI BstUI DpnI DpnI HaeIII HaeIII*HhaIHhaIA A *T*T A*A*T*T MluI MluI Afl III Afl III SpeI SpeI Bgl II Bgl II BstYI BstYI A*A*T*T A*A*T*T Eco47III Eco47III StuI StuI A*A*T T CGCG CTAG GATC GCGC GGCC*CGCG CGCG CTAG CTAG GATC GATC GCGC GCGC GGCC GGCC A*A*T T HaeIIHaeIIC C *G*G DsaI DsaI AvrII AvrII StyI StyI EagI EagI EaeI EaeI GdiIIGdiII C*C*G*G C*C*G*G NspBII NspBII C*C*G*G SacII SacII PvuI PvuI C*C*G G BsiEI BsiEI BsiEI BsiEI GG *C*C BssHII BssHII NheI NheI BamHI BamHI BstYI BstYI KasI KasI BanI BanI Bsp120I Bsp120I CGCG CTAG GATC GCGC GGCC A*CGCG CGCG CTAG CTAG GATC GATC GCGC GCGC GGCC GGCC G*G*C*CNarI NarI BsaHI BsaHI G*G*C*CG*G*C*CG*G*C C T T *A*A BbeI BbeI HaeII HaeII ApaI ApaI BanII BanII Bsp1286Bsp1286 T*T*A*A XbaI XbaI Bcl I Bcl I EaeI EaeI T*T*A*A NruI NruI FspI FspI MscI MscI T*T*A*A T*T*A A CGCG CTAG GATC GCGC GGCC G*GTAC TATA TCGA TGCA TTAA *Csp61 TaqI MseI*RsaI*A*T A*T A*T ClaI AseI A*T ScaI A*T GTAC TATA TCGA TGCA TTAA*GTAC GTAC TATA TATA TCGA TCGA TGCA TGCA TTAA TTAA A*A*T T Nsi I Nsi I C C *G*G Bsi WI Bsi WI SfcI SfcI XhoI XhoI AvaI AvaI AvaI AvaI SfcI SfcI C*C*G*G C*C*G*G C*C*G*G C*C*G G PstI PstI GG *C*C Asp718Asp718BanI BanI Sal I Sal I ApaLI ApaLI GTAC TATA TCGA TGCA TTAA A*GTAC GTAC TATA TATA TCGA TCGA TGCA TGCA TTAA TTAA G*G*C*CAccI AccI AccIAccI G*G*C*CBsrl107I Bsrl107I HincII HincII HpaI HpaI HincII HincII G*G*C*C G*G*C C KpnI KpnI Bsp1286 Bsp1286 HgiAI HgiAI T T *A*A T*T*A*A BstBIBstBIT*T*A*A DraI DraI T*T*A*A T*T*A A GTAC TATA TCGA TGCA TTAA G*从细菌从细菌DNA环化现象推测，必定存环化现象推测，必定存在一种能把两条在一种能把两条DNA双链连接到一双链连接到一起的酶。起的酶。第二节第二节 DNA 连接酶连接酶一、一、DNA连接酶（连接酶（ligase)的发现的发现DNA复制一定有断口。复制一定有断口。从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接（1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1.两种两种DNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端粘性末端。二、二、DNA ligase的特点的特点（2）T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，不但能连接粘性末端，还能连接还能连接齐平末端齐平末端。（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。（1）必须是两条）必须是两条双链双链DNA。（2）DNA3端有游离的端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。（3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中：NAD+2.连接条件连接条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的-OH1.ATP（NAD+)提供激活的提供激活的AMP。三、连接反应的机理三、连接反应的机理2.ATP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的与连接酶的赖氨酸赖氨酸-氨基氨基相连。相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理4.AMP随后从连接酶的赖氨酸随后从连接酶的赖氨酸-氨氨基转移到基转移到DNA一条链的一条链的5端端P上，形上，形成成“DNA-腺苷酸腺苷酸”复合物。复合物。-OHHO-P-AMP-OH O-P-AMP4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5.3-OH对磷原子作亲核攻击，形成对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出磷酸二脂键，释放出AMP。5.3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出A连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37 C。四、连接反应的温度四、连接反应的温度1.最佳温度最佳温度但在但在37下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2.实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416 C。连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的温度1.最佳增加插入片段与载体的接触机会，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。减少载体自我连接的现象。1.插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 2.反应温度反应温度12.5。五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素1020倍。倍。一般一般1416增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1.第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 2.Klenow fragment 3.T7 DNA聚合酶聚合酶 4.T4 DNA聚合酶聚合酶 5.修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 6.逆转录酶逆转录酶第三节 DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆1.共同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3OH端。端。2.主要区别主要区别T7 DNA聚合酶可以连续添加数千聚合酶可以连续添加数千个个dNTPs而不从模板上掉下来。而不从模板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多多个个dNTPs就会从模板上解离下来。就会从模板上解离下来。二、常用的二、常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3OH端。2.DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶3355外切外切外切外切酶活性酶活性酶活性酶活性5533外切外切外切外切酶活性酶活性酶活性酶活性聚合聚合聚合聚合速率速率速率速率持续持续持续持续能力能力能力能力大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶低低低低有有有有中中中中低低低低Klenow fragmentKlenow fragment低低低低无无无无中中中中低低低低T4DNAT4DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶高高高高无无无无中中中中低低低低T7DNAT7DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶高高无无无无快快快快高高高高化学修饰化学修饰化学修饰化学修饰T7DNAT7DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶低低低低无无无无快快快快高高高高遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶无无无无无无无无低低低低中中中中Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶无无无无有有有有快快快快高高高高3.常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率三、三、DNA聚合酶在基因工程中的用途聚合酶在基因工程中的用途1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。（1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽。53外切酶活性位于外切酶活性位于N端。端。用枯草杆菌蛋白酶处理可以切用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉掉N端的端的53外切酶活性外切酶活性部分。部分。就成为就成为Klenow fragment。三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大肠杆菌DNA聚合酶 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）Mg2+带有带有3OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反应条件）的反应条件-OH5 3 dNTPs 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP标记标记 核酸探针（核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。聚核酸分子。（3）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制备探针制备探针已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交标记 核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断 探针的标记方式探针的标记方式标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5 3 标记已知序列的核酸片断 探针的标记方式标记已知序列的核酸片 DNA聚合酶聚合酶I 对探针序列的标记对探针序列的标记切口转移法切口转移法(nick translation)：a.放射性同位素标记：放射性同位素标记：DNA聚合酶聚合酶I 同时具备同时具备53外切酶外切酶活性和活性和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外切酶活性）。外切酶活性）。DNA聚合酶I 对探针序列的标记切口转移法(nick t53外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的切口的下一段下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的的上一段上一段DNA的的3一侧补上一个新的核苷酸。一侧补上一个新的核苷酸。切口切口切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制造单链制造单链切口切口DNA Pol I 进进行切口转移行切口转移一种一种-32P-dNTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标记8纯化的DNA片断DNase I 制造单链切口DNA Pol 2.Klenow fragment具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性。（性。（失去了失去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性质的性质DNA Pol I Klenow fragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶2.Klenow fragment具有53聚合酶活性 3端补平端补平5 5 klenow DNA 3末端标记末端标记补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端隐蔽端。在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途）主要用途 3端补平5 5 klenow DNA 3末端标3隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片断片断Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选根据末端的顺序选择一种择一种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA 限制性内切酶切限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h3隐蔽末端的DNA片断Klenow fragment补平根 cDNA第二链的合成第二链的合成mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物引物 cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA（1）T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质3.T4 DNA聚合酶聚合酶从从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由离纯化。由噬菌体基因噬菌体基因43编码。编码。有有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活性外切酶活性（降解单链更快）。（降解单链更快）。来源来源 酶活性酶活性（1）T4 DNA聚合酶的性质3.T4 DNA聚合酶从T 特点特点当没有当没有dNTP时，时，T4DNA聚合酶行使聚合酶行使35外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出3隐蔽端。隐蔽端。如果只有一种如果只有一种dNTP，则降解到该，则降解到该dNTP的位置。的位置。特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶聚合酶无无dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs5 5 5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA（2）T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途标记末端（取代合成法）标记末端（取代合成法）用用35外切酶活性作用于外切酶活性作用于所有末端所有末端形式的形式的3端端（平端、（平端、3隐蔽端、隐蔽端、5隐隐蔽端）制造出蔽端）制造出3隐蔽端。隐蔽端。再利用它的再利用它的53聚合酶活性补平，聚合酶活性补平，并加入放射性标记的并加入放射性标记的dNTP。补平隐蔽末端补平隐蔽末端 DNA 3末端标记末端标记（2）T4 DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3酶切中间产酶切中间产生两个末端生两个末端标记标记加入某种加入某种32P-dNTP和和dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶（35外切）外切）DNA酶切片断酶切片断T4 DNA聚合酶聚合酶（53聚合）聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 内切酶切内切酶切无无dNTPs酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsa.放射性标记的放射性标记的优缺点优缺点：制作简单、制作简单、高比放射性、高比放射性、放射自显影效果好。放射自显影效果好。优点：优点：缺点：缺点：半衰期短（半衰期短（32P只有只有14.3天）、天）、不易保存、不易保存、对人体有害。对人体有害。要求在专门实验室操作。要求在专门实验室操作。a.放射性标记的优缺点：制作简单、优点：缺点：半衰期短（b.非放射性标记非放射性标记i）生物素标记：）生物素标记：生物素（生物素（biotin），又称维生素），又称维生素H、辅酶、辅酶R可以与可以与dNTP酰化结合成为生物素酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素生物素-1,4-dATP、生物素、生物素-1,1-dUTP等。等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化）催化与蛋白质共价结合。与蛋白质共价结合。b.非放射性标记i）生物素标记：生物素（biotin），又纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制造单制造单链缺口链缺口DNA Pol I 进进行缺口转移行缺口转移生物素生物素-dTTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 生物素生物素-dTTP生物素生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中探针中纯化的DNA片断DNase I 制造单链缺口DNA Pol 光促生物素标记光促生物素标记生物素生物素 连接臂连接臂 光敏基因光敏基因探针序列探针序列探针序列探针序列生物素生物素 连接臂连接臂 光敏基因光敏基因+光照光照光促生物素标记生物素连接臂光敏基因探针序列探针序列生物素连接抗生物素蛋白（抗生物素蛋白（avidin）：）：链霉抗生物素蛋白（链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：）：生物素的识别生物素的识别亲和素亲和素：是一种是一种鸡鸡卵清蛋白。卵清蛋白。细菌细菌中中avidin的类似物。的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：抗生物素蛋白（avidin）：链霉抗生物素蛋白（streptii）地高辛标记：）地高辛标记：可以与可以与dNTP连接成地高辛连接成地高辛-dUTP等，等，参入参入DNA合成过程。形成地高辛标合成过程。形成地高辛标记的记的DNA探针。探针。生物素和地高辛标记的探针都有商生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒品化的试剂盒(kit)。地高辛的结合物是地高辛的结合物是抗地高辛抗体抗地高辛抗体。ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类课件iii）偶联酶及其底物）偶联酶及其底物常用的两种酶：常用的两种酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRPO）碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AP）催化一些特殊的反应，反应的过程中催化一些特殊的反应，反应的过程中发出发出荧光荧光（或生成（或生成有色的产物有色的产物）。）。酶的作用：酶的作用：iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶 催化一些化学发光底物化学发光底物化学发光底物HRPO和和AP的显色反应底物的显色反应底物HRPO和AP的显色反应底物发光反应机理发光反应机理发光反应机理iv）用非放射性标记的探针检测原理）用非放射性标记的探针检测原理生物素生物素 探针序列探针序列待测基因待测基因亲和素亲和素酶酶底物底物中间产物中间产物产物产物发光发光探针探针DNA用用生物素或地高辛生物素或地高辛标记。标记。亲和素或地高辛抗体与亲和素或地高辛抗体与酶酶偶联。偶联。酶酶催化一个催化一个发光或显色反应发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体亲和素或地高辛抗体与与生物素或地高辛结合生物素或地高辛结合。iv）用非放射性标记的探针检测原理生物素探针序列待测基因亲和核酸核酸探针探针杂交筛杂交筛选法的缺点是：选法的缺点是：只检测是否有外只检测是否有外源源DNA插入，而插入，而不论该不论该DNA是否是否表达出产物。表达出产物。核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不4.T7 DNA聚合酶聚合酶（1）来源）来源从从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：纯化出来的，由两个亚基组成：T7T7基因基因5 5编码的大亚基：编码的大亚基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。大肠杆菌编码的小亚基：大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。硫氧还蛋白。增加大亚基对增加大亚基对模板的亲和性模板的亲和性。4.T7 DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细（2）T7 DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 持续合成能力强持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。合成互补链。35外切酶活性高外切酶活性高单链和双链都能降解。单链和双链都能降解。不受不受DNADNA二级结构的影响二级结构的影响其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二级结构的阻碍二级结构的阻碍（2）T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强一旦与模板结 进行末端标记进行末端标记 以大分子量以大分子量DNA为模板的合成为模板的合成如如M13 补平隐蔽末端补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途取代合成法标记取代合成法标记3末端。末端。与与T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成补平补平3隐蔽末端；隐蔽末端；水解水解修平修平3突出末端。突出末端。进行末端标记 以大分子量DNA为模板的合成如M135.修饰后的修饰后的T7 DNA聚合酶聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰聚合酶的化学修饰去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了聚合能力和聚合速率提高了3倍。倍。（2）修饰后的）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 DNA测序测序双脱氧法。双脱氧法。标记标记DNA 3隐蔽末端隐蔽末端 更有效地补平末端更有效地补平末端5.修饰后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学6.逆转录酶逆转录酶最普遍使用的是来源于最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）：）：依赖依赖RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA指导的指导的DNA聚合酶）。聚合酶）。（1）来源）来源RNA肿瘤病毒。肿瘤病毒。（2）AMV的性质的性质由由 和和 两条多肽链组成。两条多肽链组成。6.逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（av 链链有反转录活性和有反转录活性和 RNaseH活性。活性。RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以以53或或35方向特异地水解方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNA链链。RNaseHRNA DNARNA DNA 链有反转录活性和 RNaseH活性。RNaseH：R（3）逆转录酶的用途）逆转录酶的用途 链链RNA-DNA杂交双链中杂交双链中53DNA外切酶活性。外切酶活性。合成合成cDNA以以oligo dT为引物（与为引物（与mRNA的的polyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA（3）逆转录酶的用途 链RNA-DNA杂交双链中53 合成合成DNA探针探针用随机引物（用随机引物（random primer）或或oligo dT做引物。做引物。随机引物：随机引物：随机顺序形成的寡聚随机顺序形成的寡聚DNA片断。片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）（理论上它能与各种序列的模板结合）RT-PCR用的模板用的模板克隆某个基因时，用其克隆某个基因时，用其mRNA反转反转录出录出cDNA第一链。第一链。合成DNA探针用随机引物（random primer）或第四节第四节 DNA修饰酶修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1.来源来源小牛胸腺。小牛胸腺。2.组成组成大小两个亚基。大小两个亚基。3.特性特性53DNA聚合酶活性聚合酶活性（terminal transferase）第四节 DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1.来源小 不需要模板不需要模板！需要需要3OH、二甲胂酸缓冲液。、二甲胂酸缓冲液。底物可以是单链底物可以是单链DNA、是是3OH突出的双链突出的双链DNA、平末端平末端在在Co2+代替代替Mg2+下也可以。下也可以。随机添加的随机添加的dNTPs。如果只有一种如果只有一种dNTP，就添加上，就添加上同聚物同聚物。DNA 5 3 TTTdTTP，末端转移酶，末端转移酶 不需要模板！需要3OH、二甲胂酸缓冲液。底物4.末端转移酶的用途末端转移酶的用途（1）同聚物加尾）同聚物加尾给给外源外源DNA片断片断和和载体载体分子分别分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。们有效地连接。外源外源DNADNA载体载体DNADNA5 3 5 3 CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶末端转移酶4.末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体（2）再生酶切位点）再生酶切位点便于回收克隆片断。便于回收克隆片断。AAGCTT TTCGAA5 5 Hind酶切酶切A TTCGAAGCTT AKlenow补平补平（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTT 5 5AAGCT TTCGAAGCTT TCGAAAAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA末端转移酶末端转移酶dTTPAAAAAA外源外源DNAAAGCT AGCTT AAGCATTT （3）非放射性标记）非放射性标记DNA片断的片断的3端端AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAAHind位点位点Hind位位点点连接连接催化非放射性标记物参入催化非放射性标记物参入DNA片断片断的的3端。（生物素端。（生物素-11-dUTP等）等）（3）非放射性标记DNA片断的3端AAGCTTTT 二、二、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.来源来源T4噬菌体的噬菌体的pseT基因编码。基因编码。从从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2.功能功能催化催化 磷酸从磷酸从ATP转给双链或单链转给双链或单链DNA或或RNA的的5-OH端。端。不论不论5-OH端突出与否。端突出与否。二、T4多核苷酸激酶1.来源T4噬菌体的pseT基因编码。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 P-OH5 3 HO-P5 ATPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶如果如果ATP的的 磷酸带有磷酸带有32P标记，就会标记，就会被转移到被转移到DNA的的5端。端。但天然的但天然的DNA的的5端都是磷酸化的。端都是磷酸化的。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 P-3.多核苷酸激酶的用途多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、标记端磷酸化、标记DNA的的5端。端。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5 3 HO-32P5(-32P)ATP多核苷酸激酶多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 碱性磷酸酶碱性磷酸酶（1）正向反应（）正向反应（forward reaction）3.多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、标记DN（2）交换反应标记法）交换反应标记法反应混合物中具有超量反应混合物中具有超量(-32P)ATP和和ADP时，时，多核苷酸激酶能催化多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的的-32P与与DNA5端的磷酸端的磷酸交换交换。3 P-OH5 3 HO-P5 3 32P-OH5 3 HO-32P5(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶多核苷酸激酶反应效果不理想。反应效果不理想。（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)AT