肺结核的新诊断技术-课件

新诊断技术及其在新诊断技术及其在NTP中的应用中的应用江苏省结核病参比实验室江苏省结核病参比实验室1NTP中现行实验室技术中现行实验室技术涂片：萋尼染色显微镜检涂片：萋尼染色显微镜检培养：固体培养基：简单法、离心法培养：固体培养基：简单法、离心法药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法菌种鉴定：鉴别培养基生化试验菌种鉴定：鉴别培养基生化试验传统实验室技术不能适应不断深入的结核病传统实验室技术不能适应不断深入的结核病防治工作的需要防治工作的需要2实验室新诊断技术总览细菌学检测方法发光二极管荧光显微镜（LED）液体培养分子生物学检测方法GenexpertHAINGenechip免疫学检测方法ELISOPT&TSPOT 和Quantiferon血清学诊断方法3荧荧光光光光 比色比色比色比色 (MIGIT)(MB Bact Alert)(MIGIT)(MB Bact Alert)Ruthenium complex CO2 pH液体培液体培养养4BACTEC TB460原理：原理：原理：原理：标本经前处理接种至含有标本经前处理接种至含有14C-棕榈酸的棕榈酸的12B培养基，培养基，37C培培养。分枝杆菌分解养。分枝杆菌分解14C-棕榈酸，产生棕榈酸，产生14CO2，BACTEC TB460仪自动检测，仪自动检测，14CO2含量，并换算成生长指数（含量，并换算成生长指数（GI）。）。优点：优点：优点：优点：快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的2-8周缩短周缩短至至3-14天，将药敏试验的报告时间由常规方法的天，将药敏试验的报告时间由常规方法的4周缩短至周缩短至1周。周。操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。缺点：缺点：缺点：缺点：放射性同位素污染。放射性同位素污染。仪器与试剂价格昂贵。仪器与试剂价格昂贵。未实现全自动化未实现全自动化污染率高污染率高5原理：原理：原理：原理：是是BACTEC TB460的换代产品。标本经前处理后接种到系统配套的的换代产品。标本经前处理后接种到系统配套的液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，当细菌生长液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，当细菌生长代谢消耗培养基中的氧时，氧浓度降低，荧光被激发，系统可以连续检代谢消耗培养基中的氧时，氧浓度降低，荧光被激发，系统可以连续检测荧光水平，自动报告结果。测荧光水平，自动报告结果。优点：优点：优点：优点：系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。解决了解决了BACTEC TB460的同位素污染问题。的同位素污染问题。24小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。缺点：缺点：缺点：缺点：仪器与试剂价格更昂贵。仪器与试剂价格更昂贵。未能解决高污染率的问题未能解决高污染率的问题BACTEC MGIT 960 分枝杆菌生分枝杆菌生长指示管长指示管6液体培养液体培养1Cruciani M,et al.JCM 2004;42:2321-23252 Mean of 14 studies in MGIT960=10.7%(2.0-30.0)=acceptable range7MGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 ml+SMGIT 7 ml+IMGIT 7 ml+RMGIT 7 ml+EGCSIRE0,8 ml BACTEC MGIT SIRE 补充剂每种药物每种药物0,1 ml转移 0,5 ml 阳性 MGIT 培养物0,1 ml 阳性 MGIT 培养物9,9 ml 蒸馏水转移 0,5 ml插入BACTEC MGIT 960BACTEC MGIT 960 TB 药药敏敏试验试验 S.I.R.E.8LED显微镜显微镜发光二级管发光二级管(LED)技术技术提供价廉、稳定的光源提供价廉、稳定的光源寿命寿命 150,000 h反复开关不影响寿命反复开关不影响寿命不释放有毒气体不释放有毒气体不需要暗室不需要暗室操作人员工作负荷减轻操作人员工作负荷减轻910快速药敏快速药敏-商业化线性探针检测（商业化线性探针检测（LPAs）GenoType MTBDRplus,HAIN检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的突变检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的突变检测检测XDR的试剂盒也已经发布的试剂盒也已经发布INNO-Lipa Rif TB检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼WHO 鼓励使用的工具鼓励使用的工具可使用涂阳痰标本和培养物进行操作可使用涂阳痰标本和培养物进行操作快速、简便易用，仅需基本快速、简便易用，仅需基本PCR技术技术然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外的突然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变变1111MTBDRplus 操作流程1)DNA提取提取用用NALC/NaOH处理痰理痰标本本2)PCR扩增增3)杂交交扩增增产物和物和 固化在固化在膜上的特异性探膜上的特异性探针杂交交4)结果判果判读12rpoB 野生型探针:WT1-WT8rpoB 突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L 野生型缺失 野生型突变MTBDRplus rpoB511513516518522526531533rpoB WT2rpoB WT4rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7rpoB MUT1(D516V)rpoB MUT3(S531L)rpoB MUT2A(H526Y)rpoB MUT2B(H526D)514 515rpoB WT1rpoB WT3rpoB WT550950850513katG 基因突变MTBDRplus katG14MTBDRplus inhAinhA 基因突变15MTBDRplus 反应条带(示范)16南非的经验：南非的经验：Genotype MTBDR plus assay:直接从涂片阳性标本中检测直接从涂片阳性标本中检测rpob基因突变基因突变(耐利福平耐利福平),katG 基因基因(高浓度异烟肼耐药高浓度异烟肼耐药),inhA 基因基因(低浓度异烟低浓度异烟肼耐药肼耐药)灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值耐利福平耐利福平 98.9,99.4,97.9,和和99.7耐异烟肼耐异烟肼 94.2,99.7,99.1,和和 97.9耐耐MDR-TB 98.8,100,100,和和 99.7Barnard M,et al.Am J Respir Crit Care Med 2008;177:787-9217结核耐药检测基因芯片激光共焦扫描仪软件判读结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书样品制备仪杂交仪n通量：两个一线抗结核药n速度：6小时（比传统药敏试验法快50-100倍）n灵敏度：103CFU/反应n特异性：对照设计严谨；自动判读基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）18获国家医疗器械证书和欧盟CE认证18Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌检测结核分枝杆菌检测利福平耐药检测利福平耐药直接标本检测直接标本检测100分钟可获得结果分钟可获得结果19工作流程工作流程痰简单，仅需1个步骤的准备工作获得结果的时间 16 样本/天/模块不需要生物安全规综合控制性能性能对 MTB特异敏感性与培养相似通过rpoB 基因检测利福平耐药产品和系品和系统设计GeneXpert 系统的检测模块测试模块的扩大和交换 对非分枝杆菌实验室人员仅需要最多1天的培训GeneXpert样本准本准备、扩增、增、检测自自动化化MTB/MTB/利福平耐利福平耐利福平耐利福平耐药药性性性性检测检测痰痰标本可以直接放本可以直接放入模入模块中，而无需中，而无需与任何与任何试剂进行混行混合合处理理20报告结果时间报告结果时间:1 h 45 minGeneXpertDNA 分子与分子与PCR试剂混合试剂混合样本自动过滤和清洗样本自动过滤和清洗超声裂解捕获的生物体，释超声裂解捕获的生物体，释放放DNA半嵌套实时半嵌套实时PCR扩增扩增&检测检测集成反应管集成反应管456浓缩细菌去除抑制剂浓缩细菌去除抑制剂12标本液化和作用标本液化和作用15分钟后转移分钟后转移 2 ml3 结束手工工作结束手工工作7结果可打印结果可打印Xpert MTB/RIF21单中心评估研究（初步结果）单中心评估研究（初步结果）不同研究设计和研究人群，肺结核和肺外结核标本不同研究设计和研究人群，肺结核和肺外结核标本检测结核检测结核汇总的未经校正的敏感性汇总的未经校正的敏感性 92%汇总的未经校正的特异性汇总的未经校正的特异性 98%检测利福平耐药检测利福平耐药汇总的未经校正的敏感性汇总的未经校正的敏感性 98%汇总的未经校正的特异性汇总的未经校正的特异性 99%22操作方面操作方面废弃物管理废弃物管理 如痰标本容器如痰标本容器储存和供应储存和供应 反应盒庞大反应盒庞大,2-28C,有效期有效期12个月个月 电力供应电力供应 UPS(400 VA)或电池组或电池组 培训培训 需求不高需求不高(使用计算机、预防污染使用计算机、预防污染)生物安全生物安全 与涂片镜检相同与涂片镜检相同每年校正每年校正 模块更换模块更换安全安全 防盗防盗(计算机计算机)23世界卫生组织快速开展快速开展Xpert MTB/RIF诊断试验诊断试验技术和实施方面的考虑技术和实施方面的考虑2011年3月24WHO对对Xpert MTB/RIF的建议摘要：的建议摘要：高度推荐用于怀疑高度推荐用于怀疑MDR-TB以及合并以及合并HIV感染的结核感染的结核病病人的初诊诊断病病人的初诊诊断对于对于MDRTB、HIV不严重的地区，可以在涂片之后不严重的地区，可以在涂片之后考虑使用考虑使用Xpert MTB/RIF，特别是用于诊断涂阴病人，特别是用于诊断涂阴病人（取决于费用）（取决于费用）肺外标本的有关证据尚有限肺外标本的有关证据尚有限增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加适用于儿童适用于儿童不能替代传统涂片、培养、药敏试验不能替代传统涂片、培养、药敏试验25步骤 1:特异抗原激发淋巴细胞IFN-释放阴性对照ESAT-6或CFP-10孵育孵育显影步骤 2:用ELISA 检测 IFN-Y Y YYYYY Y YYYY洗涤Y Y YYYY 洗涤Y Y YQuantiFERON TB Gold实验26T-SPOT TB(ELISPOT)技术 单核细胞分离TB抗原刺激，IFN-释放一抗捕获IFN-与标记的二抗结合 酶作用标记物显色每一斑点代表释放IFN-的一个细胞Y Y Y YY Y Y YY Y Y YYYYYY Y Y YYYYYIFN-抗原27小小 结结NTP中如何应用中如何应用 给谁用？哪里做？怎么用？给谁用？哪里做？怎么用？28国家国家结核病参比核病参比实验室推荐建室推荐建议液体培养用于液体培养用于:结核病可疑症状者检查,可以作为结核病（耐药）的诊断依据和结核病患者治疗效果判断,液体培养可以代替可以代替传统培养培养推荐理由推荐理由:1.液体培养在已液体培养在已经在我国注册；在我国注册；2.国内外研究国内外研究显示其敏感性和示其敏感性和TAT优于于传统培养；培养；3.数据数据显示在我国具有可行性示在我国具有可行性,符合成本效果；符合成本效果；推荐使用推荐使用层级:区区县、地市和省、地市和省级（医医疗机构和疾病机构和疾病预防机构）防机构）29国家国家结核病参比核病参比实验室推荐建室推荐建议GenXpert 即将可以用于即将可以用于:结核病可疑症状者检查,可以作为结核病的辅助诊断方法和结核病患者治疗效果判断,它有望代替代替传统的培养和利福平的培养和利福平的的药敏敏试验（可疑耐（可疑耐药结核病患者）核病患者）推荐理由推荐理由:1.即将在我国即将在我国获得注册得注册证书；2.国内外研究国内外研究显示其敏感性和特异性，阳性示其敏感性和特异性，阳性结果果报告告时间优于于传统方法；方法；3.WHO 在全球推荐在全球推荐4.数据数据显示在我国具有可行性示在我国具有可行性,符合成本效果；符合成本效果；可能使用可能使用层级:区区县（？）、地市和省（？）、地市和省级（医（医疗机构和疾病机构和疾病预防机构）防机构）30国家国家结核病参比核病参比实验室推荐建室推荐建议LPA可以用于可以用于:可疑耐可疑耐药结核病患者核病患者查,它有望代替利福平和异烟代替利福平和异烟肼的的传统药敏敏试验推荐理由推荐理由:1.在我国在我国获得注册得注册证书；2.国内外研究国内外研究显示其敏感性和特异性（示其敏感性和特异性（TAT)较好；好；3.WHO 在全球推荐在全球推荐4.数据数据显示在我国具有可行性示在我国具有可行性,符合成本效果；符合成本效果；可能使用可能使用层级:地市和省地市和省级（医（医疗机构和疾病机构和疾病预防机构）防机构）31国家国家结核病参比核病参比实验室推荐建室推荐建议基因芯片可以用于基因芯片可以用于:可疑耐可疑耐药结核病患者核病患者查,它有望代替利福平和异烟代替利福平和异烟肼的的传统药敏敏试验推荐理由推荐理由:1.在我国在我国获得注册得注册证书；2.国内研究国内研究显示其敏感性和特异性和示其敏感性和特异性和(TAT)较好；好；3.民族品牌民族品牌4.数据数据显示在我国具有可行性示在我国具有可行性,符合成本效果；符合成本效果；可能使用可能使用层级:地市和省地市和省级（医（医疗机构和疾病机构和疾病预防机构）防机构）32国家国家结核病参比核病参比实验室推荐建室推荐建议 干扰素释放试验可以用于可以用于:结核菌潜伏感染核菌潜伏感染筛查,儿童和老年人以及免疫力低下者结核病的辅助诊断（参考）推荐理由推荐理由:1.在我国在我国获得注册得注册证书，国家，国家对一些特殊一些特殊诊断断试剂的的规定；定；2.国内外研究国内外研究显示其敏感性和（特异性）示其敏感性和（特异性）较好；好；3.数据数据显示在我国具有可行性示在我国具有可行性可能使用可能使用层级:县区、地市和省区、地市和省级（医（医疗机构和疾病机构和疾病预防机构）防机构）33我国新诊断技术应用设想1.根据国家结核病防治规划的需要，按照不同级别的实验室职能定位选择相应的（通过系统评估）适宜新诊断方法；2.依据各地实际情况，在县级同时开展培养，地市级同时开展药敏试验工作。依据：1.尽管新诊断技术快简和灵敏，目前还没有哪种新技术的灵敏度和特异性都完全超过传统培养；2.耐多药结核病的治疗需要关注其他抗结核药物的耐药谱3.目前的分子生物学方法的结果还不足以作为疗效评价的指标4.疾病的分子监测和动态趋势，需要分离病原体3435