蛋白质样品制备技术课件

20 七月 2024蛋白质样品制备技术蛋白质样品制备技术蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具有难度的。有难度的。有难度的。有难度的。样品制备的原则样品制备的原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。细细细细胞胞胞胞和和和和组组组组织织织织样样样样品品品品的的的的制制制制备备备备应应应应尽尽尽尽可可可可能能能能减减减减少少少少蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的降降降降解解解解，低低低低温温温温和和和和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。样样样样品品品品裂裂裂裂解解解解液液液液应应应应该该该该新新新新鲜鲜鲜鲜配配配配置置置置，并并并并且且且且分分分分装装装装冻冻冻冻存存存存于于于于-80-80-80-80。勿勿勿勿反反反反复冻融已制备好的样品。复冻融已制备好的样品。复冻融已制备好的样品。复冻融已制备好的样品。通过超速离心清除所有的杂质。通过超速离心清除所有的杂质。通过超速离心清除所有的杂质。通过超速离心清除所有的杂质。加入尿素后加温不要超过加入尿素后加温不要超过加入尿素后加温不要超过加入尿素后加温不要超过37 37 37 37，防止氨甲酰化而修饰蛋白。，防止氨甲酰化而修饰蛋白。，防止氨甲酰化而修饰蛋白。，防止氨甲酰化而修饰蛋白。一、样品的类型一、样品的类型 1.1.整体样品整体样品整体样品整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体是生物个体小的物种（如微生物），可以整体是生物个体小的物种（如微生物），可以整体是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。取样。取样。取样。2.2.组织样品组织样品组织样品组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。3.3.细胞样品细胞样品细胞样品细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。胞）和从组织中分离同类的细胞样品。胞）和从组织中分离同类的细胞样品。胞）和从组织中分离同类的细胞样品。4.4.可溶性样品可溶性样品可溶性样品可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。第一节第一节 样品破碎与分离蛋白质样品破碎与分离蛋白质二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎 为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。（一）（一）温和的裂解方法温和的裂解方法通常应用于组分比较简单的样品，例如组织通常应用于组分比较简单的样品，例如组织通常应用于组分比较简单的样品，例如组织通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。起来应用。起来应用。起来应用。1.渗透裂解渗透裂解 非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：血细胞、组织培养细胞。血细胞、组织培养细胞。血细胞、组织培养细胞。血细胞、组织培养细胞。操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。胀而释放出细胞内容物。胀而释放出细胞内容物。胀而释放出细胞内容物。2.2.冻融裂解冻融裂解 许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。细菌细胞、组织培养细胞。细菌细胞、组织培养细胞。细菌细胞、组织培养细胞。操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要使用液氮，快速反复冻融至符合实验要使用液氮，快速反复冻融至符合实验要使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。求为止。求为止。求为止。3.3.裂解液裂解裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。膜，使细胞内容物释放出来。膜，使细胞内容物释放出来。膜，使细胞内容物释放出来。应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：组织培养细胞组织培养细胞组织培养细胞组织培养细胞 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行将细胞直接置裂解液或样品液中，进行将细胞直接置裂解液或样品液中，进行将细胞直接置裂解液或样品液中，进行 悬浮处理。悬浮处理。悬浮处理。悬浮处理。4.4.酶裂解酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。和裂解。和裂解。和裂解。应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。二、剧烈的蛋白裂解二、剧烈的蛋白裂解 常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。法可以使细胞完全破碎裂解。法可以使细胞完全破碎裂解。法可以使细胞完全破碎裂解。1.1.超声裂解法超声裂解法 超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，样品处理应在冰浴中进行。样品处理应在冰浴中进行。样品处理应在冰浴中进行。样品处理应在冰浴中进行。2.2.压力杯法压力杯法 在高压下迫使细胞穿过小孔径而在高压下迫使细胞穿过小孔径而在高压下迫使细胞穿过小孔径而在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。产生剪切力，从而裂解细胞。产生剪切力，从而裂解细胞。产生剪切力，从而裂解细胞。应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：微生物细胞，如细菌、微生物细胞，如细菌、微生物细胞，如细菌、微生物细胞，如细菌、霉菌、酵母细胞及含有霉菌、酵母细胞及含有霉菌、酵母细胞及含有霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。细胞壁的细胞。细胞壁的细胞。细胞壁的细胞。操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷将细胞悬浮液置于预冷将细胞悬浮液置于预冷将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压的压力杯中，施加压的压力杯中，施加压的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。力，然后收集挤出液。力，然后收集挤出液。力，然后收集挤出液。3.3.研磨法研磨法用研钵或研杵研磨细胞用研钵或研杵研磨细胞用研钵或研杵研磨细胞用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。固体组织细胞、微生物细胞。固体组织细胞、微生物细胞。固体组织细胞、微生物细胞。操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研 磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。4.4.机械匀浆法机械匀浆法使用匀浆器破碎细胞或组织使用匀浆器破碎细胞或组织使用匀浆器破碎细胞或组织使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：固体组织，如心脏、肝固体组织，如心脏、肝固体组织，如心脏、肝固体组织，如心脏、肝 脏、肾脏组织和细胞悬脏、肾脏组织和细胞悬脏、肾脏组织和细胞悬脏、肾脏组织和细胞悬 液。液。液。液。操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：先尽量将组织剪成块，先尽量将组织剪成块，先尽量将组织剪成块，先尽量将组织剪成块，然后加有蛋白酶抑制剂然后加有蛋白酶抑制剂然后加有蛋白酶抑制剂然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆，的冷匀浆液进行匀浆，的冷匀浆液进行匀浆，的冷匀浆液进行匀浆，过滤或离心收集。过滤或离心收集。过滤或离心收集。过滤或离心收集。5.5.玻璃珠匀浆法玻璃珠匀浆法 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：应用对象：应用对象：应用对象：细胞悬液或微生物细胞悬液或微生物细胞悬液或微生物细胞悬液或微生物 操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置 于结实的管子里。每克细胞（湿重）于结实的管子里。每克细胞（湿重）于结实的管子里。每克细胞（湿重）于结实的管子里。每克细胞（湿重）加入加入加入加入1-31-31-31-3克玻璃珠，剧烈震荡克玻璃珠，剧烈震荡克玻璃珠，剧烈震荡克玻璃珠，剧烈震荡1min1min1min1min，冰浴冰浴冰浴冰浴1min1min1min1min。重复上述步骤。重复上述步骤。重复上述步骤。重复上述步骤。三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。另外，许多组织蛋白酶在另外，许多组织蛋白酶在另外，许多组织蛋白酶在另外，许多组织蛋白酶在PHPHPHPH超过超过超过超过9.09.09.09.0的时候会失活，的时候会失活，的时候会失活，的时候会失活，因此在样品裂解液中出现因此在样品裂解液中出现因此在样品裂解液中出现因此在样品裂解液中出现TrisTrisTrisTris、碳酸钠和载体两、碳酸钠和载体两、碳酸钠和载体两、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白酶抑制剂。酶抑制剂。酶抑制剂。酶抑制剂。PMSF(苯甲基磺酰氟）苯甲基磺酰氟）是一种不可逆抑制剂，通常浓度为是一种不可逆抑制剂，通常浓度为是一种不可逆抑制剂，通常浓度为是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,1mmol/L,1mmol/L,1mmol/L,灭灭灭灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（效果较好；另外，在二硫苏糖醇（效果较好；另外，在二硫苏糖醇（效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTTDTTDTTDTT）或者）或者）或者）或者-巯巯巯巯基乙醇溶液中基乙醇溶液中基乙醇溶液中基乙醇溶液中PMSFPMSF的抑制效果可能会减小，因的抑制效果可能会减小，因的抑制效果可能会减小，因的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。AEBSF 为不可逆抑制剂，通常工作浓度为为不可逆抑制剂，通常工作浓度为为不可逆抑制剂，通常工作浓度为为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L4mmol/L4mmol/L4mmol/L，作用与作用与作用与作用与PMSFPMSFPMSFPMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但相似，但溶解性较好，且毒性低。但相似，但溶解性较好，且毒性低。但相似，但溶解性较好，且毒性低。但 是是是是AEBSFAEBSFAEBSFAEBSF可能会改变蛋白的等电点。可能会改变蛋白的等电点。可能会改变蛋白的等电点。可能会改变蛋白的等电点。金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTAEDTA）乙二醇双四乙酸（乙二醇双四乙酸（乙二醇双四乙酸（乙二醇双四乙酸（EGTAEGTA）通常应用通常应用通常应用通常应用1mmol/L1mmol/L1mmol/L1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离的工作浓度，通过螯合自由的金属离的工作浓度，通过螯合自由的金属离的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。子来抑制金属蛋白酶活性。子来抑制金属蛋白酶活性。子来抑制金属蛋白酶活性。肽蛋白酶抑制剂肽蛋白酶抑制剂肽蛋白酶抑制剂肽蛋白酶抑制剂 亮抑酶肽（亮抑酶肽（亮抑酶肽（亮抑酶肽（leupetinleupetinleupetinleupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTTDTTDTTDTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；半胱氨酸蛋白酶的活性；半胱氨酸蛋白酶的活性；半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂A A A A（pepstatin Apepstatin Apepstatin Apepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（抑蛋白酶肽（抑蛋白酶肽（抑蛋白酶肽（aprotininaprotininaprotininaprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；抑制许多丝氨酸蛋白酶；抑制许多丝氨酸蛋白酶；抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素苯丁抑制素苯丁抑制素苯丁抑制素(bestatin)(bestatin)(bestatin)(bestatin),抑制氨基抑制氨基抑制氨基抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制胃蛋白酶抑制胃蛋白酶抑制胃蛋白酶抑制剂剂剂剂A A A A在在在在PH=9PH=9PH=9PH=9的时候不能抑制蛋白酶。的时候不能抑制蛋白酶。的时候不能抑制蛋白酶。的时候不能抑制蛋白酶。甲苯磺酰赖氨酸甲酮（甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCKTLCK），甲苯磺酰），甲苯磺酰 苯丙氨酰氯甲酮（苯丙氨酰氯甲酮（TPCKTPCK）通常浓度在通常浓度在通常浓度在通常浓度在0.1-0.15mmol/L0.1-0.15mmol/L0.1-0.15mmol/L0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分不，这些相同的成分不，这些相同的成分不，这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。Benzamidine 通常浓度为通常浓度为通常浓度为通常浓度为1-2mmol/L1-2mmol/L1-2mmol/L1-2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。，抑制丝氨酸蛋白酶。，抑制丝氨酸蛋白酶。，抑制丝氨酸蛋白酶。变性剂变性剂 在低温条件下处理。在低温条件下处理。在低温条件下处理。在低温条件下处理。直接加入强变性直接加入强变性直接加入强变性直接加入强变性剂剂剂剂8mol/L8mol/L8mol/L8mol/L脲、脲、脲、脲、10 10 10 10TCATCATCATCA或或或或2 2 2 2SDSSDSSDSSDS。强碱下抑制强碱下抑制强碱下抑制强碱下抑制酶活，许多组织蛋白酶在酶活，许多组织蛋白酶在酶活，许多组织蛋白酶在酶活，许多组织蛋白酶在pHpHpHpH超过超过超过超过9.09.09.09.0的时候失活。的时候失活。的时候失活。的时候失活。四、蛋白质沉淀步骤四、蛋白质沉淀步骤 这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂 质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结 果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的 样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后 并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉 淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀 （盐析）（盐析）（盐析）（盐析）原理原理原理原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。步骤：步骤：步骤：步骤：蛋白浓度大于蛋白浓度大于蛋白浓度大于蛋白浓度大于lmg/mllmg/ml，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于50mmol/L,50mmol/L,并并并并含有含有含有含有EDTA,EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min10-30min，通过，通过，通过，通过离心沉淀蛋白。离心沉淀蛋白。离心沉淀蛋白。离心沉淀蛋白。然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干扰扰扰扰IEF,IEF,必须被清除。必须被清除。必须被清除。必须被清除。TCA TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）沉淀（三氯醋酸沉淀）这是一种有效的蛋白沉淀方法，将这是一种有效的蛋白沉淀方法，将这是一种有效的蛋白沉淀方法，将这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCATCA加到提加到提加到提加到提取液中，终浓度将高达取液中，终浓度将高达取液中，终浓度将高达取液中，终浓度将高达1010-20-20。蛋白质可于。蛋白质可于。蛋白质可于。蛋白质可于 冰上沉淀冰上沉淀冰上沉淀冰上沉淀30min30min。另外，组织样品可以直接用。另外，组织样品可以直接用。另外，组织样品可以直接用。另外，组织样品可以直接用1010 -20-20 的的的的TCATCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降进行匀浆。这种方法可限制蛋白降进行匀浆。这种方法可限制蛋白降进行匀浆。这种方法可限制蛋白降 解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀，以除去淀，以除去淀，以除去淀，以除去TCATCA。然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完全再溶。残留的全再溶。残留的全再溶。残留的全再溶。残留的TCATCA必须通过乙醇或丙酮彻底清必须通过乙醇或丙酮彻底清必须通过乙醇或丙酮彻底清必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低除，若过多暴露与低除，若过多暴露与低除，若过多暴露与低PHPH溶液中可能导致某些蛋白溶液中可能导致某些蛋白溶液中可能导致某些蛋白溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。降解或修饰。降解或修饰。降解或修饰。丙酮沉淀丙酮沉淀 这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多杂质，如去污剂、脂类。杂质，如去污剂、脂类。杂质，如去污剂、脂类。杂质，如去污剂、脂类。于提取物中加入至少于提取物中加入至少于提取物中加入至少于提取物中加入至少3 3倍体积的冰丙酮，使蛋白在倍体积的冰丙酮，使蛋白在倍体积的冰丙酮，使蛋白在倍体积的冰丙酮，使蛋白在-20-20沉淀至少沉淀至少沉淀至少沉淀至少2h2h，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮通过空气干燥或冻干除去。通过空气干燥或冻干除去。通过空气干燥或冻干除去。通过空气干燥或冻干除去。在丙酮中用在丙酮中用TCATCA沉淀沉淀 两者联合应用更加有效，通常用两者联合应用更加有效，通常用两者联合应用更加有效，通常用两者联合应用更加有效，通常用1010TCATCA在在在在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.010.01-巯巯巯巯基乙醇溶液或基乙醇溶液或基乙醇溶液或基乙醇溶液或20mmol/L DTT20mmol/L DTT）。至少在）。至少在）。至少在）。至少在-20-20沉淀沉淀沉淀沉淀45min45min，通过离心沉淀蛋白，并用含，通过离心沉淀蛋白，并用含，通过离心沉淀蛋白，并用含，通过离心沉淀蛋白，并用含0.010.01-巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT20mmol/L DTT 的冰丙酮清的冰丙酮清的冰丙酮清的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。此方法仍然存在难再溶的现象。此方法仍然存在难再溶的现象。此方法仍然存在难再溶的现象。用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀 这对于杂质含量高的植物样品很有效。这对于杂质含量高的植物样品很有效。这对于杂质含量高的植物样品很有效。这对于杂质含量高的植物样品很有效。蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时较多。较多。较多。较多。在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样品脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。液剂。第二节第二节 蛋白质裂解技术蛋白质裂解技术一、裂解液一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向电泳分离效果的一个有力措施。电泳分离效果的一个有力措施。电泳分离效果的一个有力措施。电泳分离效果的一个有力措施。离液剂离液剂离液剂离液剂 尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为8mol/L8mol/L8mol/L8mol/L。尿素。尿素。尿素。尿素可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用度时，一般用度时，一般用度时，一般用2mol/L2mol/L2mol/L2mol/L硫脲和硫脲和硫脲和硫脲和5-8mol/L5-8mol/L5-8mol/L5-8mol/L的尿素联合使用。的尿素联合使用。的尿素联合使用。的尿素联合使用。还原剂还原剂还原剂主要是用来断裂蛋白分子中还原剂主要是用来断裂蛋白分子中还原剂主要是用来断裂蛋白分子中还原剂主要是用来断裂蛋白分子中CysCysCysCys残基之残基之残基之残基之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的还原剂有还原剂有还原剂有还原剂有-巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTTDTTDTTDTT）或二）或二）或二）或二硫赤藓糖醇（硫赤藓糖醇（硫赤藓糖醇（硫赤藓糖醇（DTE)DTE)DTE)DTE)和三丁基膦（和三丁基膦（和三丁基膦（和三丁基膦（TBPTBPTBPTBP）,目前常用目前常用目前常用目前常用的是的是的是的是DTTDTTDTTDTT。去污剂去污剂去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂SDSSDSSDSSDS，非离子去污剂，非离子去污剂，非离子去污剂，非离子去污剂NP-40NP-40NP-40NP-40和和和和TritonX-100TritonX-100TritonX-100TritonX-100，两性离，两性离，两性离，两性离子去污剂子去污剂子去污剂子去污剂CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或。原则上去污剂应该是非离子型或。原则上去污剂应该是非离子型或。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移位置。最初，两个相似的非离子去污剂位置。最初，两个相似的非离子去污剂位置。最初，两个相似的非离子去污剂位置。最初，两个相似的非离子去污剂NP-40NP-40NP-40NP-40和和和和TritonX-100TritonX-100TritonX-100TritonX-100被广泛应用。随后研究表明：兼性离被广泛应用。随后研究表明：兼性离被广泛应用。随后研究表明：兼性离被广泛应用。随后研究表明：兼性离子去污剂子去污剂子去污剂子去污剂CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS的效果更好。的效果更好。的效果更好。的效果更好。通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。第三节第三节 样品预分级样品预分级一、亚细胞器的分离一、亚细胞器的分离 主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度 不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密 度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组 分。分。分。分。细胞匀浆细胞匀浆细胞匀浆细胞匀浆 取待分析的组织细胞样品以取待分析的组织细胞样品以取待分析的组织细胞样品以取待分析的组织细胞样品以0.9 0.9 0.9 0.9 NaClNaClNaClNaCl溶液反复溶液反复溶液反复溶液反复 清洗，加入清洗，加入清洗，加入清洗，加入SESESESE缓冲液（缓冲液（缓冲液（缓冲液（0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L0.25mol/L蔗糖、蔗糖、蔗糖、蔗糖、1mmol/L 1mmol/L 1mmol/L 1mmol/L EDTA)EDTA)EDTA)EDTA)，在低温下研磨成匀浆备用。，在低温下研磨成匀浆备用。，在低温下研磨成匀浆备用。，在低温下研磨成匀浆备用。亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离1.1.差速离心差速离心差速离心差速离心 指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在不同离心力场的作用下沉降而分离。不同离心力场的作用下沉降而分离。不同离心力场的作用下沉降而分离。不同离心力场的作用下沉降而分离。2.2.密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心 指用一定的介质在离心管中形成连续或不指用一定的介质在离心管中形成连续或不指用一定的介质在离心管中形成连续或不指用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层分离。离心力场的作用使细胞分层分离。离心力场的作用使细胞分层分离。离心力场的作用使细胞分层分离。速度沉降速度沉降速度沉降速度沉降 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降。不同的速度沉降。不同的速度沉降。不同的速度沉降。等密度沉降平衡等密度沉降平衡等密度沉降平衡等密度沉降平衡 适用于分离密度不等的颗粒。细胞适用于分离密度不等的颗粒。细胞适用于分离密度不等的颗粒。细胞适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。二、分步裂解提取二、分步裂解提取1.1.1.1.目的与原理目的与原理目的与原理目的与原理 由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，分步提取法现已被用于提取各种不同组织的蛋白质，其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取其中通常采用以水相、有机相和表面活性剂为基础的提取溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰溶液。但是，仍然很难提取到样品的全部蛋白质组和低丰度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关度蛋白质。此外，一些疏水蛋白质，包括膜蛋白和膜相关蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质蛋白，以及高度抗性组织（如头发和皮肤组织）的蛋白质几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相几乎很难进行双向电泳分离，特别是在应用固相pHpHpHpH梯度的梯度的梯度的梯度的等电聚焦中有待进一步的研究。等电聚焦中有待进一步的研究。等电聚焦中有待进一步的研究。等电聚焦中有待进一步的研究。2.2.2.2.方法方法方法方法 MolleyMolleyMolleyMolley等等等等(1998)(1998)(1998)(1998)首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高首先提出了顺序抽提法，其步骤是和高效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：效裂解缓冲液结合起来。具体步骤如下：水溶液的提取水溶液的提取水溶液的提取水溶液的提取 约约约约5-15mg5-15mg5-15mg5-15mg细胞中加入细胞中加入细胞中加入细胞中加入2ml2ml2ml2ml裂解液裂解液裂解液裂解液（40mmol/L Tris40mmol/L Tris40mmol/L Tris40mmol/L Tris）。）。）。）。反复冻融反复冻融反复冻融反复冻融3-43-43-43-4个循环，加入适量的个循环，加入适量的个循环，加入适量的个循环，加入适量的DNase DNase DNase DNase 和和和和RNaseARNaseARNaseARNaseA，震荡，震荡，震荡，震荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。取物。取物。取物。含含含含Urea/CHAPS/DTTUrea/CHAPS/DTTUrea/CHAPS/DTTUrea/CHAPS/DTT溶液的提取溶液的提取溶液的提取溶液的提取 向第一步的沉淀中加入向第一步的沉淀中加入向第一步的沉淀中加入向第一步的沉淀中加入500ul500ul500ul500ul的裂解液的裂解液的裂解液的裂解液（8mol/L8mol/L8mol/L8mol/L的的的的UreaUreaUreaUrea，4 4 4 4CHAPSCHAPSCHAPSCHAPS，100mmol/L DTT,40mmol/LTris100mmol/L DTT,40mmol/LTris100mmol/L DTT,40mmol/LTris100mmol/L DTT,40mmol/LTris，0.5 0.5 0.5 0.5 Pharmalyte 3-10Pharmalyte 3-10Pharmalyte 3-10Pharmalyte 3-10，20ug/ml 20ug/ml 20ug/ml 20ug/ml DN