实时荧光定量pcr原理及应用课件

实时荧光定量PCR原理及应用上海吉泰生物科技有限公司上海吉泰生物科技有限公司张达威张达威张达威张达威实时荧光定量PCR原理及应用上海吉泰生物科技有限公司张达威1 1主要内容荧光定量PCR原理荧光定量PCR方法与应用主要内容荧光定量PCR原理2 2荧光定量PCR定义 在在PCR反应体系中，加入荧光集团，反应体系中，加入荧光集团，利用利用荧光信号的累积荧光信号的累积对对PCR反应过程反应过程实时监控实时监控，最终对初始，最终对初始模板进行定量模板进行定量。荧光定量PCR定义 3 3传统传统PCR定量与实时定量定量与实时定量PCR 传统的传统的PCR定量是一种终点法的检测定量是一种终点法的检测：动态范围受限 检测重现性极差 实时定量实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检依靠荧光信号的扩增进行检测：测：灵敏度高 重复性 好 动态范围宽 高通量传统PCR定量与实时定量PCR 传统的PCR定量是一种终点法4 4Gel-based quantification11,500 counts/5200 counts=2.2 fold differenceGel-based quantification11,5005 5Real-time quantificationCt 18 and Ct 22,2(4 Ct shift)=16 fold differenceReal-time quantificationCt 18 6 6Ct终点检测终点检测重复性好精确度高误差小传统传统PCR与实时定量与实时定量PCRCt终点检测重复性好传统PCR与实时定量PCR7 7阈值阈值threshold：在荧光信号指数扩增阶段，在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，一般我们将荧光阈值的缺省设置是一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 3-15 个个循环的荧光信号的标准偏差的循环的荧光信号的标准偏差的10 10 倍。倍。CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信号即阈值循环数：荧光信号达到阈值设定值时达到阈值设定值时PCR所经历的循环数所经历的循环数。阈值与CT值阈值threshold：在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线8 8检测极限DNACycle CtCtCt阈值thresholdC(t)值与阈值检测极限DNACycle CtCtCt阈值thresho9 9荧光定量PCR原理原理起始模板浓度的对数起始模板浓度的对数与与C(t)值成反比值成反比荧光定量PCR原理起始模板浓度的对数与C(t)值成反比1010如何定量绘制标准曲线所测样本C(t)值定量如何定量绘制标准曲线1111标标 准准 曲曲 线线通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据 Log起始拷贝量与Ct的线性关系，就可以计算出样品中所含的模板量标 准 曲 线1212荧光定量PCR方法荧光染料法荧光探针法荧光定量PCR方法荧光染料法1313SYBR Green ITaqManMolecular BeaconsDNA bindingProbe based detectionTaqTaq染料和探针SYBR Green IDNA bindingProbe1414SYBR Green:最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm 染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度增强1000倍 不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异性产物需要做熔解曲线分析产物的单一性SYBR green 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势，在试验验证和问题分析上非常有用。SYBR Green法作用机理SYBR Green:SYBR green 是一个很好的初级1515熔解曲线分析单一峰，无非特异性产物，定量准确有杂峰，有非特异性产物，定量不准确熔解曲线分析单一峰，无非特异性产物，定量准确有杂峰，有非特异1616unbound probefree in solutionLight emissionLightenergy transferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLight emissionLight特点：特点：特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测完全实时监测：一分子荧光信号对应一条DNA链的产生多通道检测：可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列Taqman探针法Taqman探针：是与目的序列互补的寡聚核苷酸，5端标记荧光报告集团，3端标记荧光淬灭集团，探针完整时不发出荧光，水解后发出荧光。unbound probefree in solution1717HCV(FAM)RNA virus65bp ampliconHIV-1(HEX)RNA Virus74bp ampliconHBV(CY5)DNA virus 81bp ampliconTaqman 三通道实验三通道实验Daniel Candotti-Cambridge,UKHCV(FAM)HIV-1(HEX)HBV(CY51818绝对定量相对定量SNP分析实时定量实时定量PCR应用应用绝对定量实时定量PCR应用1919应用之一：病原体检测与定量绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数病原绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数病原体的多少）体的多少）标准品（如质粒）：做系列梯度稀释标准品（如质粒）：做系列梯度稀释待测样本待测样本阴性对照（阴性对照（NTCNTC）应用之一：病原体检测与定量绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝2020应用之一：病原体检测与定量1 14 43 32 2应用之一：病原体检测与定量14322121应用之一：病原体检测与定量应用之一：病原体检测与定量2222应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数倍数两种样品：两种样品：CalibratorCalibrator（对照，如正常组织）（对照，如正常组织）与与SampleSample（待测样品）（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因两个基因：目的基因与看家基因应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被2323Normalizer看家基因看家基因应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGene of Interest目的基因目的基因CtCtCtCt Ct1 Ct2Normalizer应用之二：基因表达差异分析Calibra2424应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析基因表达差异基因表达差异2 /2 Ct1 Ct22 Ct1-Ct2应用之二：基因表达差异分析基因表达差异2 /22525应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析RNA抽提抽提RT定量定量PCRcDNA产物产物系列稀释系列稀释两个基因的扩增效率两个基因的扩增效率应用之二：基因表达差异分析RNA抽提RT定量PCRcDNA产2626应用之二：基因表达差异分析应用之二：基因表达差异分析1 12 23 34 4应用之二：基因表达差异分析12342727 应用之二：基因表达差异分析 应用之二：基因表达差异分析2828两条探针分别针对不同等位基因两条探针分别针对不同等位基因A AC CGGT TA AC CGGT T应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析两条探针分别针对不同等位基因ACGTACGT应用之三：SNP2929应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析FAMFAMTETTETFAMFAMTETTET1 12 2应用之三：SNP分析FAMTETFAMTET123030应用之三：应用之三：SNPSNP分析分析2 21 1应用之三：SNP分析213131Thank you！选择吉泰，选择成功！选择吉泰，选择成功！Thank you！选择吉泰，选择成功！3232本文观看结束！本文观看结束！4747谢 谢欣 赏！谢 谢4848实时荧光定量pcr原理及应用课件4949