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LOGOLOGO第六节第六节植物细胞的选育与改良植物细胞的选育与改良 筛选、诱变筛选、诱变原生质体融合、基因重组原生质体融合、基因重组CELLCELLCompany Logo为什么进行植物细胞的筛选?v植物细胞往往不均一，会显示出不同的特性，需要将具有优良特性的细胞选择出来。v植物细胞在培养过程中会发生变异，通过筛选将有利的变异细胞选出，而把不利的变异细胞去除。v诱变获得的突变体，通过原生质体融合获得的融合子和通过基因重组获得的工程细胞Company Logo自发突变v体细胞无性系变异：植物细胞在体外培养过程中往往发生不可期的突变，且突变性状可以稳定遗传。v其变异可发生在单基因控制的性状上，也可以发生在多基因控制的性状上，而且可同时发生在胞质基因和核基因控制的性状上。v染色体数目发生改变，或染色体结构发生改变如染色体易位、缺失、倒位、点突变等。v造成这些改变的原因，普遍认为是由培养条件和培养基成分尤其是激素如2，4-D、细胞分裂素引起的。v自发突变的频率约为10-810-5 v变异的类型(从表型上)主要表现在：生长习性、株高、主茎长、主枝数、产量、花色、抗除草剂、抗旱、抗盐、抗寒、代谢产物突变、抗病、抗虫Company Logo诱发突变 v提高突变频率到10-3 v物理法和化学法：X射线、射线、紫外线、中子、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基脲等。Company Logo植物细胞突变体的应用植物细胞突变体的应用 v为细胞杂交和基因导入提供选择标记如携带标记基因Gus的细胞系v细胞、分子水平的遗传和代谢研究v对农作物性状进行遗传改良v提高植物细胞中有用代谢产物的含量v从组织水平和细胞水平上筛选突变体，较之整体植物有许多优点 LOGOLOGO植物细胞筛选的方法植物细胞筛选的方法 小细胞团筛选法选择压力筛选法 CELLCELLCompany Logo小细胞团筛选法 v制备得到单细胞，在常规的培养基中经过单细胞培养，形成细胞团，通过观测细胞团的形态、颜色或者测定细胞代谢物的种类和含量，从而选出所需的细胞。v实例 筛选花色苷含量高的玫瑰茄细胞Company Logo选择压力筛选法 v通过添加某些对不同的细胞有不同作用效果的物质，淘汰部分敏感细胞，而选择得到所需的细胞。v正选择：把受选择的细胞群体置于一定的选择压力之下，部分细胞在选择压力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞可以生长，从而选择得到所需的细胞。v一步和多步选择vNaCl为选择剂选择耐盐突变体 以除草剂为选择剂选择抗除草剂突变体 v负选择：选择的对象是在一定选择压力的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。v适用于对营养缺陷型突变体的选择。Company Logo选择压力筛选法直接选择：所用的选择压力正是以后在整体植株水平上突变表现型的作用对象。v实例：抗性突变体的选择，用生长抑制剂如抗生素、代谢类似物、某些金属及非金属离子等，来分离培养植物细胞，从中选择对生长抑制剂具有抗性的突变细胞，关键是对生长抑制剂浓度的选择。间接选择：选择压力不是突变表现型对其直接表现抗性的物质。v实例：营养缺陷突变体、温度敏感型突变体及抗旱细胞突变体等的筛选 Company Logo影响细胞筛选效果的因素 v亲本材料对筛选效果的影响 v培养方式对细胞筛选效果的影响 愈伤组织培养：生长速率比较慢；并非所有的细胞都能与培养基直接接触；细胞之间的接触相当紧密；细胞悬浮培养：以大小不一的细胞团形式存在；释放的有毒物的影响较大；原生质体培养：分离和培养技术还不完善；v细胞生长速度对细胞筛选效果的影响v选择压力的施加方式对细胞筛选效果的影响 一次性施加和逐步施加 LOGOLOGO植物细胞的诱变 物理诱变化学诱变 CELLCELLCompany Logo诱变的概念、形式v诱变：指通过各种诱变剂的作用，使细胞发生变异的过程，是获得优良植物细胞的有效方法之一。v物理诱变剂包括X射线、射线、中子、a粒子、粒子、紫外线等。紫外线的能量较低，不能引起被照射物质的离子化，因而叫做非电离诱变因子；其余的物理诱变剂均能引起被照射物质的离子化，称为电离诱变因子。v化学诱变剂的种类较多，根据对DNA的作用特点，主要分三类，包括碱基类似物、烷化剂、叠氮化合物。诱发配对错误/诱发染色体断裂/改变DNA的化学结构 Company Logo如何进行诱变v诱变的基本过程：单细胞制备、预培养、诱发突变、突变细胞株的选择v诱发突变一般采用平板培养法，并在培养基中加入某种选择因子，长时间饲喂培养植物细胞，使其发生拟定目标的突变。v一般认为所得到的突变体只有满足以下条件，才能表明已发生真实的突变：离开选择压后变异表型保持稳定；突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异；变异表型能够通过有性繁殖遗传，其中变异的性状遗传稳定性是鉴定突变体最为可靠的标准，Company Logo植物细胞诱变实例 v对氨基酸和氨基酸类似物抗性的选择v抗病细胞突变体的选择v抗除草剂细胞突变体的选择v植物抗盐细胞突变体的选择v抗低温(或高温)突变体和抗旱突变体(抗逆境)v高光效突变体/营养缺陷型细胞突变体的选择 LOGOLOGO植物细胞的基因重组与转移 外源基因的获取、载体的制备、基因的体外重组、基因的转移和外源基因的表达 CELLCELLCompany Logo植物细胞基因转移的方法 v农杆菌介导法v直接转化法v基因枪法v电激法v显微注射法v脂质体介导法v病毒载体转导法 Company Logo农杆菌介导法v利用农杆菌（Agrobacterium）的Ti或Ri质粒携带外源基因进入植物细胞（组织、器官或植株）的过程称为农杆菌介导的基因转移。v植物细胞、组织、器官共培养法：该方法是以贺斯克（Horsch）等人1985年建立的叶盘法为基础发展起来的，是双子叶植物细胞基因转移的较为常用的简单有效的方法。v植株感染法：一般采用种子实生苗或试管苗作为外植体,在整体植株上造成创伤,然后把农杆菌接种于创伤面上,或用针头把农杆菌注射到植物体内,使其进行侵染转化。v原生质体共培养法：是指将处于再生壁时期的原生质体与农杆菌一起共培养。Company Logo直接转化法 v直接转化法：即用裸露的DNA经特殊处理后，直接转移到植物细胞和原生质体中，导致细胞转化的技术。v基因枪法：是由克雷因（Klein）等在1987年建立的基因导入方法。其原理是将DNA包裹于微小的金属钨或金粒的表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞核并整合表达的过程。v化学药剂诱导法：植物的原生质体在没有载体的情况下，借助一些化学试剂的诱导能够吸收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物细胞染色体中去。v电激法（electroporation）：又称电穿孔法，是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道，从而发生外源DNA的摄取。v显微注射法（microinjeceion）：这是利用特制的显微注射仪将外源遗传物质注入植物细胞的转化方法。v低能离子束法（Ionimplantation）/激光束法Company Logo其他方法v花粉管通道转化法：利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，在植物开花以后，去除柱头，直接利用外源的DNA进行涂抹，使外源的DNA借助业已形成的花粉管通道转入卵、合子或早期胚胎细胞，实现目的基因的转移。v脂质体介导转化法v病毒载体转导法Company Logo转基因植物细胞的筛选与检测 v负向筛选体系 负向筛选体系使植物产生抗性的机理是它对抗生素类，除草剂类或其它类似物具有解毒作用，使其变为解毒的抗生素的衍生物，从而使转基因的细胞对抗生素等不敏感，而未转基因的细胞对抗生素等敏感而被杀死。这些使用除草剂和抗生素作为选择性物质的筛选体系虽然目前应用的比较广泛，但是选择性标记基因与目的的基因并无关系，对植物有负面影响，它的使用和释放也给环保带来了一些问题。而且由于抗生素和除草剂等的毒性作用导致植物的转化和再生频率很低。Company Logo抗生素类筛选体系 v 卡那霉素筛选体系：应用最广泛的选择体系，它是用新霉素磷酸转移酶（NPT）基因作为选择标记基因，用卡那霉素、新霉素和G418作为选择性物质加入培养基中进行筛选。v 潮霉素筛选体系：在植物转化中使用的另一个编码解毒蛋白的基因是来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）。v 链霉素和壮观霉素筛选体系/庆大霉素筛选体系v 博来霉素筛选体系/氯霉素(chlorampenicol)的筛选体系v其它抗生素类筛选体系有抗膦丝菌素(phosphinothricin)的磷丝菌素筛选体系等。Company Logo除草剂类筛选体系 v磺胺类筛选体系vEPSPS筛选体系：将细菌的5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate合成酶(EPSPS)基因转入高等植物的叶绿体，在转基因植株中获得一种除草剂（Glyphosate）的抗性。v双丙氨酸草甘膦筛选体系v绿磺隆类筛选体系Company Logo正向筛选体系 v正向筛选体系中的选择剂兼具两种功效，首先，由于转化体细胞含有编码可以利用这种选择剂的基因，所以转化体细胞可以利用这种选择剂进行新陈代谢，促进转化体细胞的生长；其次，选择剂还可以用来筛选转化体，转化体细胞由于利用了这种物质而生长较快，生长旺盛，然而非转化体由于不能利用这种选择剂而生长缓慢或受到抑制，从而可以筛选出转化体。这种正向筛选体系可以大大提高植物转基因中转化频率和再生频率低的难题，为加速植物转基因产业化进程提供了有效的工具。Company LogoGUS筛选体系v 将葡糖苷酸酶（-glucurouidase，GUS)基因，连同于目的基因转化到植物细胞中，转化的细胞中GUS基因能激活惰性细胞激动素(苄基腺嘌呤N-3葡糖苷酸)，使其变成活性的细胞激动素(苄基腺嘌呤)，苄基腺嘌呤能够刺激转基因细胞的再生和生长，而非转化的植物细胞由于不含GUS基因则不能利用苄基腺嘌呤N-3葡糖苷酸，转化的细胞由于这种新陈代谢的优越性，所以生长旺盛，而非转化的植物细胞则生长缓慢，从而达到筛选的目的，而且选择剂(苄基腺漂呤N-3葡糖苷酸)对植物细胞无任何不利影响。Company Logo其它筛选体系v甘露糖筛选体系v木糖筛选体系v氨甲喋呤抗性基因的检测v冠瘿碱合成酶基因筛选体系v荧光素酶基因筛选体系vPCR检测v点杂交和DNA杂交/Southern杂交 vRNA杂交/Northern杂交 v蛋白质杂交/Western杂交 LOGOLOGO第七节第七节植物细胞培养技术的应用植物细胞培养技术的应用 各种代谢产物CELLCELLLOGO植物细胞培养得到的常见次级代谢物植物细胞培养得到的常见次级代谢物紫草宁小檗碱（黄连素）花青素，花黄素银杏黄酮银杏内酯白果内酯蒽醌青蒿素超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶香豆素薄荷醇人参皂甙类胰岛素紫杉醇地高辛利血平奎宁碱长春花碱尼古丁鱼腾酮迷迭香酸紫草细胞黄连细胞玫瑰茄细胞，紫苏细胞银杏细胞银杏细胞银杏细胞巴戟天细胞黄花蒿细胞大蒜细胞番木瓜细胞番木瓜细胞胡桐细胞，薰衣草细胞薄荷细胞人参细胞苦瓜细胞红豆杉细胞毛地黄细胞罗夫木细胞金鸡纳细胞长春花细胞烟草细胞鱼藤细胞鼠尾草细胞，鞘心花细胞色素，消炎消炎、止泻食用色素，抗氧化疏通血管，抗氧化治疗心血管疾病治疗大脑和神经系统疾病抗菌消炎，抗肿瘤抗疟疾，退热药抗氧化、抗辐射、抗衰老消炎，肉质嫩化治疗骨质增生，血型检测抗病毒，香精食用香精调节免疫功能，保健治疗糖尿病抗肿瘤强心药降血压抗疟疾治疗白血病杀虫杀虫消炎，抗氧化LOGO1 1、植物细胞次级代谢物生物合成的简要途径、植物细胞次级代谢物生物合成的简要途径 LOGO次级代谢物生物合成的基本途径次级代谢物生物合成的基本途径-多酮途径多酮途径v多酮(polyketone)途径又称为乙酸-丙二酸途径，是乙酰辅酶A通过直线式聚合，生成脂肪酸和环状次级代谢物的途径。v乙酰辅酶A通过多酮途径生成的环状次级代谢物，一般由410个乙酰基直线式聚合，然后环化而成。某些大环抗生素可以由1920个乙酰基聚合、环化而成。LOGO次级代谢物生物合成的基本途径次级代谢物生物合成的基本途径-莽草酸途径莽草酸途径v莽草酸（shikimic acid）途径是指磷酸烯醇丙酮酸与4-磷酸赤藓糖縮合，经过莽草酸生成芳香族氨基酸的生物合成途径。v莽草酸是1885年从八角属（illicium religiosum）植物的种子中分离得到的一种化合物。是植物和微生物中L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-色氨酸等芳香族氨基酸生物合成的关键中间体。v经过莽草酸途径生成的芳香族氨基酸，可以进一步生成生物碱、类黄酮等次级代谢物。LOGO次级代谢物生物合成的基本途径次级代谢物生物合成的基本途径-甲瓦龙酸途径甲瓦龙酸途径v甲瓦龙酸（marvelonic acid,MVA）途径，又称为甲戊二羟酸（mavalonic acid）途径,是乙酰辅酶A经过甲戊二羟酸生成异戊二烯，再合成萜类和甾体化合物等异戊二烯类次级代谢物的途径。v甲瓦龙酸途径可以分为两个阶段。第一阶段是乙酰辅酶A通过分支式聚合，生成活性异戊二烯的过程；第二阶段是活性异戊二烯(C5)聚合，生成萜类和甾体化合物等形形式式的异戊二烯类次级代谢物的过程。LOGO类黄酮的生物活性类黄酮的生物活性v类黄酮(flavonoids)是植物中分布最广泛的一大类次级代谢物。自1814年发现第一个类黄酮化合物白杨素chrysin以来,已经鉴定的类黄酮化合物将近10000种。v花青素（anthocyanins）等类黄酮在不同条件下，可以呈现多种不同颜色，而且具有抗氧化和抗菌作用，所以众多的类黄酮化合物是常用的天然食用色素和染料。v类黄酮化合物具有扩张血管、调节血管渗透性的功效，在心脑血管疾病的防治方面已经发挥了重要作用。v大多数类黄酮化合物都有较强的清除自由基和抗氧化作用，在医药和食品中广泛应用。v抗病毒、抗菌、消炎、抗肿瘤作用 LOGO类黄酮的分类和生物合成类黄酮的分类和生物合成v类黄酮的基本母核具有C6-C3-C6的结构，其中C3部分可以是脂链，也可以与C6部分形成六元或五元的氧杂环。v可以分为黄酮flavones，黄酮醇flavonols，异黄酮isoflavones,查尔酮chalcones，花青素authocyanins和噢哢aulones等类。v类黄酮的生物合成的开始阶段与香豆素的生物合成开始阶段一样，由苯丙氨酸开始，生成肉桂酸、对香豆酸，然后经过对香豆酰辅酶A，生成查尔酮，再转化为其它类黄酮化合物。LOGO银杏黄酮的生物银杏黄酮的生物合成途径合成途径LOGO萜类化合物萜类化合物v萜类化合物是指以异戊二烯（C5）为基本单位首尾相接而成的一类化合物。单萜化合物(monoterpenoids)由2个异戊二烯单位组成，在医药、香料、驱虫药等方面广泛应用。v倍半萜化合物(sesquiterpenoids)由3个异戊二烯单位组成，广泛存在于植物、微生物、海洋生物和一些昆虫中。v二萜化合物（diterpenoids）由4个异戊二烯单位组成，二萜化合物中有许多具有生物活性，丹参酮/银杏内酯/雷公藤内酯/穿心莲内酯/紫杉醇。v二倍半萜由五个异戊二烯单位组成，主要存在于海绵中，陆地生物中很少。二倍半萜是海绵中产生的防卫物质，有些具有很强的抗菌活性，有些对鱼类有毒杀作用。v三萜类化合物（triterpenoids）是由六个异戊二烯单位组成的萜类化合物。广泛存在于五加科、玄参科、豆科、桔梗科等植物中。LOGO2 2、植物细胞培养生产次级代谢物的、植物细胞培养生产次级代谢物的工艺过程及其影响因素工艺过程及其影响因素 v 一般工艺流程/培养方式v 培养基v 温度v pHv 溶解氧v 光照v 前体、刺激剂v 基因调控LOGO大规模的植物细胞培养反应器装置大规模的植物细胞培养反应器装置（机械搅拌式）（机械搅拌式）v反应器容积为20米3，其搅拌叶直径是罐体直径，在低通气条件下，通入以PVA为过滤除菌介质的无菌空气。LOGO非机械搅拌式反应器非机械搅拌式反应器(气体搅拌式反应器气体搅拌式反应器)v利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓泡反应器和气升式反应器，而气升式反应器又可分为外循环和内循环两种形式。LOGO固定化细胞培养反应器固定化细胞培养反应器(填充床反填充床反应器和流化床反应器应器和流化床反应器)v细胞固定于支持物表面或内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。填充床中单位体积细胞较多，由于混合效果不好常使床内氧的传递、气体的排出、温度和pH的控制较困难。如支持物颗粒破碎还易使填充床阻塞。v典型的流化床反应器是利用流体（液体或气体）的能量使支持物颗粒处于悬浮状态。混合效果较好，但流体的切变力和固定化颗粒的碰撞常使支持物颗粒破损，另外，流质动力学复杂使其放大困难。LOGO固定化细胞培养反应器固定化细胞培养反应器(膜反应器膜反应器)v采用具有一定孔径和选择透性的膜固定植物细胞，营养物质可以通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次级代谢产物通过膜释放到培养液中。v膜反应器主要有中空纤维反应器和螺旋卷绕反应器。LOGO生物反应器中进行大规模植物细胞生物反应器中进行大规模植物细胞悬浮培养的方式悬浮培养的方式v分批培养：在培养过程中，一次性加入培养液，在一定条件下培养一段时间后，一次性放出培养液的培养方式。分批培养方式较为简单、方便，受微生物感染的机会相对较少，是当今植物细胞悬浮培养最常用的方式。但是分批培养方式的生产周期较长，设备利用率较低。v半连续培养：在培养过程中，每隔一段时间从反应器中放出部分培养液，并补充部分新鲜培养基的培养方式。半连续培养可以提高设备利用率，可以适当提高单位体积反应器的产量。但在添加新鲜培养基的时候，要注意防止微生物的污染。v连续培养：在培养过程中，以一定的流量连续地添加培养基，同时放出相同体积的培养液，保持反应器内培养液的体积不变。该培养方式可以显著提高设备利用率，在固定化细胞培养中经常采用。v两相培养：在生物反应器中，除了植物细胞（或固定化细胞）以外，培养体系中还存在互不相溶的两相介质。两相介质系统可以是液-液两相，也可以是固-液两相。LOGO培养基对细胞生长和次级代谢物培养基对细胞生长和次级代谢物生产的影响生产的影响v在培养基的设计和配制时，应当根据细胞的特性和要求，特别注意各种组分的种类和含量，以满足细胞生长、繁殖和新陈代谢的需要，并调节至适宜的pH值。有些细胞在生长繁殖阶段和生产代谢物的阶段所要求的培养基有所不同，必需根据需要配制不同的生长培养基和生成培养基。v碳源的浓度/碳源对生物合成的代谢调节v采用一定量的硝酸盐和铵盐作为混合无机氮源，单独以铵盐或者硝酸盐为氮源，都对细胞的生长和次级代谢物的生成不利。(总量/比例)v磷酸盐/生长激素LOGO温度对细胞生长和次级代谢物温度对细胞生长和次级代谢物生产的影响生产的影响v植物细胞培养的温度一般控制在室温范围（25左右）。温度高些，对植物细胞的生长有利，温度低些，则对次级代谢物的积累有利。但是通常不能低于20，也不要高于35。v植物细胞生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。LOGO植物细胞培养反应器植物细胞培养反应器v 悬浮培养 机械搅拌反应器 非机械搅拌反应器v 固定化细胞系统 填充床反应器 流化床反应器 膜反应器 LOGO前体的调节前体的调节v前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。处于代谢途径上游的化合物，在特定酶的催化作用下生成其下游的化合物，上游化合物作为酶的底物，其浓度的高低决定了催化反应速度的大小。浓度高，则反应速度大。v为了提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量，在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。LOGO刺激剂的调节刺激剂的调节v刺激剂（Elicitor）可以促使植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行，从而强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的产率。所以在植物细胞培养过程中添加适当的刺激即可以显著提高某些次级代谢物的产量。v常用的刺激剂有微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。v茉莉酸/茉莉酸甲酯等植物激素LOGO基因的调节基因的调节v生物合成途径上的某个关键酶(关键的生物转化步骤)v生物合成途径的基因群调控(次级代谢产物)v基因的调节控制主要有诱导作用、反馈阻遏作用和分解代谢物阻遏作用等v影响酶活性的因素主要有酶浓度、底物浓度、温度、pH值以及激活剂和抑制剂的浓度等。在植物细胞培养生产次级代谢物的过程中，细胞内酶浓度的高低受到基因的调节控制；底物浓度可以通过添加前体的方法而提高；温度和pH值则通过工艺条件进行优化控制；除此以外，酶的激活和抑制作用对酶的催化活性有显著的影响。LOGOpHpH值对细胞生长和次级代谢物值对细胞生长和次级代谢物生产的影响生产的影响v培养基的pH值往往会发生变化。这种变化的情况与细胞特性有关，也与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。v植物细胞培养的pH值一般控制在微酸性范围，即pH56。培养基配制时，pH值一般控制在5.55.8范围，在植物细胞培养过程中，通常pH值变化不大。LOGO溶解氧对细胞生长和次级代谢物溶解氧对细胞生长和次级代谢物生产的影响生产的影响v在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。v溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定。v细胞对溶解氧的需要量与细胞的呼吸强度及培养基中的细胞浓度密切相关。v溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。LOGO光照对植物细胞生长和次级代谢物光照对植物细胞生长和次级代谢物生产的影响生产的影响v大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定波长的光的照射，并对光照强度和光照时间有一定的要求，而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制。v在植物细胞培养过程中，应当根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调节控制。尤其是在植物细胞的大规模培养过程中，如何满足植物细胞对光照的要求，是反应器设计和实际操作中要认真考虑并有待研究解决的问题。结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
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