细胞实验技术-课堂-第一讲-细胞培养概述331课件

细胞培养概述Cell Culture细胞生物学细胞生物学教研室教研室授授课对象：研究生象：研究生授授课教材：教材：细胞培养，司徒振胞培养，司徒振强、吴、吴军正主正主编等主等主编，世界世界图书出版出版西安有限公司西安有限公司授授课教教师：顾芸，王彩萍，刘芸，王彩萍，刘晓宇宇带教研究生：教研究生：一一组负责人：彭人：彭苏组员：龚佳佳欢、刘鑫、吴建成、叶永契刘鑫、吴建成、叶永契二二组负责人：何春人：何春娇组员：王盛燃、：王盛燃、张薛杰、薛杰、查广彬广彬从猛从猛神神经再生重点再生重点实验室室/神神经科学系科学系学号学号姓名姓名组别组别带教带教14180014曹澄君曹澄君超净台超净台1龚佳欢龚佳欢彭苏彭苏15180002印丽锋印丽锋15180004刘珍珍刘珍珍15180007俞盛楠俞盛楠15180009陈晓旭陈晓旭超净台超净台2刘鑫刘鑫15180010钱秀荣钱秀荣15180012朱晓玥朱晓玥15180020程鑫程鑫15180021张晟张晟超净台超净台3吴建成吴建成15180022邢凤军邢凤军15180023殷开治殷开治15160001李雯李雯15160003陈美美陈美美超净台超净台4叶永契叶永契15160006吉磊吉磊15160007王守艳王守艳15160010俞少露俞少露15160015吴丽婷吴丽婷超净台超净台5王盛燃王盛燃何春娇何春娇15160016周琪周琪15160017夏瑜椰夏瑜椰15160018杨春朝杨春朝15160019季兆东季兆东超净台超净台6张薛杰张薛杰15160021王昆王昆15160022陈璐陈璐15160023何理何理15160024胡静静胡静静超净台超净台7查广彬查广彬15160026华桥华桥15160027单延凤单延凤15160028李洁莹李洁莹15160029张庆婕张庆婕超净台超净台8从猛从猛15160030陆建锋陆建锋15160031韦玉芳韦玉芳15160032薛均薛均15160033施维施维课程内容介绍课程内容介绍第一讲：细胞概论-4.11（周一）18:30 第二讲：细胞株传代培养-4.12（周二）18:00 第三讲：台盼蓝染色及细胞计数-4.14（周四）18:00第四讲：细胞冻存及种细胞（为真核转染及细胞分裂指数做准备）-4.15（周五）18:00第五讲：真核细胞转染-4.16（周六）18:00第六讲：细胞分裂指数，细胞活力鉴定及细胞固定（为细胞周期测定做准备）-4.17（周日）18:00第七讲：冻存细胞复苏、观察转染效果及讲解细胞周期、细胞活力测定结果 -4.18（周一）18:00第八讲：原代细胞的培养-4.19（周二）18:00第九讲：观察原代培养结果，流式细胞实验演示，课程复习和总结 -4.21（周四）18:00？WHY据据CCTV4报道，报道，13年年10月中国台湾地区台北荣民总医院在干细胞研究月中国台湾地区台北荣民总医院在干细胞研究方面有重大突破，研究人员利用干细胞已分化出网膜和心肌细胞，目方面有重大突破，研究人员利用干细胞已分化出网膜和心肌细胞，目前该研究正处于临床实验阶段，未来有望生产干细胞药品有效治疗失前该研究正处于临床实验阶段，未来有望生产干细胞药品有效治疗失明、心脏病等明、心脏病等。一口一口好牙不但能给出一个美丽的笑好牙不但能给出一个美丽的笑容，还是健康的标志。但由于疾病容，还是健康的标志。但由于疾病或意外事故，我们可能失去牙齿。或意外事故，我们可能失去牙齿。镶颗金牙吧，有损整体美观。现在镶颗金牙吧，有损整体美观。现在好了，科学家成功利用人的尿液衍好了，科学家成功利用人的尿液衍生的细胞诱导形成干细胞获得再生生的细胞诱导形成干细胞获得再生牙齿雏形。牙齿雏形。7月月30日，这项研究成果日，这项研究成果刊登在学术期刊刊登在学术期刊细胞再生细胞再生上，上，同时也引发国际社会广泛讨论同时也引发国际社会广泛讨论。CLSCLS生物治疗的原理是利用自身免疫杀灭肿瘤细生物治疗的原理是利用自身免疫杀灭肿瘤细胞。胞。20112011年诺贝尔医学奖获得者斯坦曼博士在年诺贝尔医学奖获得者斯坦曼博士在19731973年发现了激活免疫系统的关键细胞年发现了激活免疫系统的关键细胞DCDC细胞。细胞。在在2020世纪世纪8080年代，科学家又培养出了具有肿瘤强年代，科学家又培养出了具有肿瘤强杀伤效应的杀伤效应的CIKCIK细胞。这两种细胞是肿瘤生物治细胞。这两种细胞是肿瘤生物治疗的关键。疗的关键。CLSCLS生物治疗通过体外实验万倍扩增生物治疗通过体外实验万倍扩增这两类细胞，再输回患者体内实现肿瘤大面积杀这两类细胞，再输回患者体内实现肿瘤大面积杀伤治疗。伤治疗。CLSCLS多细胞生物免疫治瘤多细胞生物免疫治瘤-有效延长生命有效延长生命长度长度3-53-5年年,保证提升生物质量保证提升生物质量,实现瘤自我康复实现瘤自我康复 .细胞培养的应用细胞培养的应用细胞培养的应用细胞培养的应用p研究哺乳动物个体发生发育规律p研究细胞分化用于制造组织，器官p研究基因功能p生产转基因动物p疾病治疗与治疗性克隆p研究细胞癌变机理及新药物的筛选从分子到细胞，我们如何去思考？从分子到细胞，我们如何去思考？细胞培养的优点细胞培养的优点1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动活动2.可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段可可控制调节条件：物理、化学、生物等控制调节条件：物理、化学、生物等因素因素可可采用各种研究技术、记录方法：采用各种研究技术、记录方法：倒置倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等。激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等。3.样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。4.经济、规模和机械化经济、规模和机械化细胞培养的局限性细胞培养的局限性人工模拟体内环境的技术已经很高人工模拟体内环境的技术已经很高,但人工所模拟的条件与体但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。缺乏体内的系统作用、失去神经内实际情况仍不完全相同。缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响体液的调节和细胞相互间的影响。当当细胞被置于体外培养后细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中，必生活在缺乏动态平衡的环境中，必然发生变化。然发生变化。细胞培养的基本条件细胞培养的基本条件无菌无菌/灭菌条件：灭菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，滤器，洁净层流罩，生物安全柜，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，超净工作台，紫外灯，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养板，培养瓶，培养瓶，CO2CO2培养箱，培养基，血清培养箱，培养基，血清细胞检测条件：细胞检测条件：倒置显微镜，倒置显微镜，酶标仪酶标仪 ，微孔板震荡器，微孔板震荡器，高速离心机，移液器高速离心机，移液器 细胞保存条件：细胞保存条件：液氮罐液氮罐实验室安全：实验室安全：生物实验室安全，生物实验室安全，P1,P2,P3 P1,P2,P3 实验室安全实验室安全设计原则：防止微生物和有害物质的影响，要求环境整洁，空气清新、设计原则：防止微生物和有害物质的影响，要求环境整洁，空气清新、无尘、干燥。细胞培养室按功能可分为准备室，缓冲室，培养室。无尘、干燥。细胞培养室按功能可分为准备室，缓冲室，培养室。冰箱超净台倒置显微镜离心机 载物台橱柜物品柜培养箱 恒温箱显微镜缓冲室培养室准备室工作台水池试剂柜干燥箱Cell Biology Lab净化工作室-我国药品生产洁净室（区）空气洁净度标准-洁净度级别尘粒最大允许数/立方米尘粒最大允许数0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15细胞培养室细胞培养室初级过滤高级过滤无菌空间超净工作台超净工作台SterileworkarealaminarflowcabinetclassII-HEPAfilter(0.3m)-UV250-270nmIncubator(humid CO2 incubator recommended)CO2incubator，37oC，AppropriateCO2大容量高压灭菌器 全自动手提式灭菌器 湿热灭菌装置湿热灭菌装置自动双重纯水蒸馏器 纯水仪细胞培养用水装置细胞培养用水装置酶标仪 微孔板震荡器水平离心机水平离心机倒置显微镜倒置显微镜invertedmicroscope水浴箱水浴箱干燥箱干燥箱29Liquid N2Long-term storage of cells液氮罐液氮罐移液器滤 器大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。Zeiss滤器(过滤除菌)：培养基过滤除菌装置负压负压正压正压 Filtrate Filtrate：suckfilter0.22umpressfilter0.22umMediasterilizationthrougha0.22mmembranefilterassembledinafilterholderA:ThevacuumpumpB:GlassorplasticpipettesFiltrate培养瓶、培养皿实验器材的清洗和灭菌实验器材的清洗和灭菌清洗的重要性清洗的重要性1.1.除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等2.2.使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。不要让污染了的器皿变干！不要让污染了的器皿变干！灭菌的重要性灭菌的重要性除去微生物污染除去微生物污染一、玻璃制品的一、玻璃制品的清洗清洗清洗工作包括；浸泡、超声、浸酸、冲洗清洗工作包括；浸泡、超声、浸酸、冲洗四步。1、浸泡；器皿在加中性洗涤剂的液体中浸泡数小时。新购的玻璃器皿必须彻底清洗。2、超声；在加有中性洗涤剂的超声槽中超声30min。3、冲洗，用水冲净，稍凉干后浸酸。4、浸酸-清洁液，一般浸泡6h以上。以配制中等强度清洁液为以配制中等强度清洁液为例；重铬酸钾120g、浓硫酸200ml、蒸馏水200ml。5、冲洗，及时冲净（不挂水为止）6、烘干。三：金属三：金属器皿器皿金属金属器皿不能泡酸，器皿不能泡酸，洗洗涤涤时时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干烘干或空气中晾干。放放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。二、塑料及橡胶二、塑料及橡胶制品制品 用水浸泡用水浸泡超声超声冲洗冲洗浸酸（浸酸（1%盐酸，盐酸，6h）冲洗冲洗烘干。烘干。四、四、物品的包装及物品的包装及消毒消毒 1、洗净、烘干的物品应及时包装，常用牛皮纸、棉布、铝盒、以及洗净、烘干的物品应及时包装，常用牛皮纸、棉布、铝盒、以及专用金属消毒筒等。物品应标明品名、日期。专用金属消毒筒等。物品应标明品名、日期。2、消毒；、消毒；用用压力蒸气灭菌，玻璃器皿一般压力蒸气灭菌，玻璃器皿一般15压力（压力（ibf)-121.压力维持压力维持30min。培养用的液体以及塑料、橡胶制品常以。培养用的液体以及塑料、橡胶制品常以10ibf-115，维持，维持10min。过滤除菌过滤除菌；有塑料、不锈钢微孔滤膜滤器，用正压过滤除菌。塑料；有塑料、不锈钢微孔滤膜滤器，用正压过滤除菌。塑料的一般为针式滤器，直径的一般为针式滤器，直径25mm和和50mm两种。不锈钢微孔滤膜滤器有两种。不锈钢微孔滤膜滤器有500和和1000ml两种。除菌用微孔滤膜，孔径为两种。除菌用微孔滤膜，孔径为0.22um。注意滤完后要检。注意滤完后要检查滤膜是否完整。查滤膜是否完整。电离电离辐辐 射灭菌；核素产生的射灭菌；核素产生的r射线或电子加速器产生的加速离子辐射线或电子加速器产生的加速离子辐射物品杀细菌和微生物的方法。射物品杀细菌和微生物的方法。环氧乙烷环氧乙烷，化学灭菌。，化学灭菌。培养用液培养用液 体外体外培养离不开细胞在体外生存和生长的各种液体环境培养离不开细胞在体外生存和生长的各种液体环境-培养用液，因培养用液，因此其各种成份必需严格选择，有严格的制备操作过程。此其各种成份必需严格选择，有严格的制备操作过程。培养培养用液主要包括用液主要包括:培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清、培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清、PH调整液、调整液、抗生素液等。所有用液均除菌后标明名称、日期、抗生素液等。所有用液均除菌后标明名称、日期、PH值，在适当温度下贮值，在适当温度下贮存。存。一、水与缓冲液一、水与缓冲液 （一）（一）水水:是培养用液最主要的溶剂，是细胞赖依生存的环境。是培养用液最主要的溶剂，是细胞赖依生存的环境。对水质要求高；三蒸水、去离子水、超纯水。此外，水的贮存也对水质要求高；三蒸水、去离子水、超纯水。此外，水的贮存也很重要；贮存于密封、洗净玻璃并内，时间很重要；贮存于密封、洗净玻璃并内，时间2W，最好是现制现用。，最好是现制现用。（二）缓冲液缓冲液 由由弱酸弱酸/弱酸强碱组成的盐或弱碱弱酸强碱组成的盐或弱碱/弱碱强酸组成的盐如碳酸弱碱强酸组成的盐如碳酸/碳酸氢钠，碳酸氢钠，磷酸二氢钠磷酸二氢钠/磷酸氢二钠磷酸氢二钠。细胞细胞生活环境中无机盐种类很多，因细胞、组织的不同而不同，在所有生活环境中无机盐种类很多，因细胞、组织的不同而不同，在所有细胞中无机盐都以离子状态存在。细胞中无机盐都以离子状态存在。培养用液培养用液 二、培养基二、培养基（一）、营养成分：（一）、营养成分：1 1、氨基酸：主要需要以下、氨基酸：主要需要以下1212种必须氨基酸种必须氨基酸，它们，它们都是都是L L型的。型的。2 2、单糖：六碳糖是主要的能源，也是合成氨基酸的原料、单糖：六碳糖是主要的能源，也是合成氨基酸的原料，吸吸收收能力最强的是葡萄糖、半乳糖最低。能力最强的是葡萄糖、半乳糖最低。3 3、维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，因此是必不可少的。、维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，因此是必不可少的。4 4、无机离子和微量元素：、无机离子和微量元素：细胞生长过程中除需要细胞生长过程中除需要钠、钾、钠、钾、钙、镁钙、镁等基本元素外，还需要一些微量元素，铁、锌等基本元素外，还需要一些微量元素，铁、锌、锰、钼等。培养用液培养用液 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液（二）、促生长因子及激素（二）、促生长因子及激素 体内生长需要因子的刺激、调节，体外同样需要，愈来愈体内生长需要因子的刺激、调节，体外同样需要，愈来愈多的实验证明各种激素、生长调节因子对于维持细胞的功能、多的实验证明各种激素、生长调节因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。保持细胞的状态具有十分重要的作用。（三）、渗透压（三）、渗透压 细胞必须生活在等渗的环境中，大多数细胞对渗透压有一定的细胞必须生活在等渗的环境中，大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。人血浆的渗透压是耐受性。人血浆的渗透压是290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理可视为培养人体细胞的理想渗透压。对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在想渗透压。对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围内都适宜。的范围内都适宜。（四）、（四）、pH 大多数细胞的适宜大多数细胞的适宜pH为为7.27.4，偏离此范围对细胞产生，偏离此范围对细胞产生有害影响，培养基应具有一定的缓冲能力。造成培养基有害影响，培养基应具有一定的缓冲能力。造成培养基pH波波动的主要物质是细胞代谢产生的动的主要物质是细胞代谢产生的CO2,在在封闭式培养过程中封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为了解决这一问题，很快下降。为了解决这一问题，合成培养基中采用了合成培养基中采用了NaHCO3-CO3缓冲缓冲系统，并采用开放式培系统，并采用开放式培养的方式，使细胞产生的养的方式，使细胞产生的CO2及时逸出培养器皿，再通过稳定及时逸出培养器皿，再通过稳定调节温箱中的调节温箱中的CO2气体的浓度（气体的浓度（5%），使之与培养基中的），使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。处于平衡状态。Na NaHCO3+H2O Na+HO+H2O+CO2（五）、无毒、无污染（五）、无毒、无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质无任何抵抗体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质无任何抵抗力。因此，培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染、力。因此，培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染。无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染。培养基分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。（六六）、培养基的种类）、培养基的种类合成培养基合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199TC199、MEMMEM、RPMI-RPMI-16401640、DMEMDMEM等等。优点优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。缺点缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。水：新鲜配置的三蒸水或去离子水水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液平衡盐溶液(balanced salt solution(balanced salt solution，BSS)BSS)又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。配液时注意：（1）用水；配制先后顺序；称量，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等。（2）物质的纯度，常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种。（3）物质的可溶性，避免沉淀析出。（4）物质的稳定性，如葡萄糖只能在10磅下维持1520分钟。（5）贮存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。常用的缓冲液：生理盐水、PB、PBS(注意有无钙镁离子)、Hanks液（含有钙镁离子、葡萄糖、酚红）细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制pH调节液调节液(1)碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，密封，4冰箱保存。市售有5%10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液或以CO2调节之。(2)Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为1015mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节pH至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4冰箱保存。消化液消化液(1)胰蛋白酶溶液，一种黄白色粉末，易受潮，应密封放置阴暗干燥处。它的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来。常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA(乙烯二胺与乙酸或Versene)溶液 EDTA是一种化学螯合剂，毒性小，对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0.02%。称0.1gVersene溶解于500ml无钙镁离子磷酸缓冲液中，15磅30分钟高压灭菌，4或室温保存。(3)胰蛋白酶EDTA的配制 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4ml，无钙镁离子缓冲液100ml。抗生素抗生素溶液溶液在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100g。配制时取青霉素1106和链霉素1106g,溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量为青霉素1104U/ml，链霉素1104g/ml，使用时每100ml培养液中加入0.51ml。庆大霉素：每毫升100单位-方便、广谱、稳定。基础培养基基础培养基 8080一一9595血清血清 5 5一一2020碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/L2.0 g/L青、链霉素青、链霉素 各各100100单位毫升单位毫升完全培养基的组成完全培养基的组成血清血清中含有：中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；多种金属离子；多种金属离子；激素；各种生长因子；激素；各种生长因子；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；胰酶抑制因子；胰酶抑制因子；转移蛋白；转移蛋白；不明成分。不明成分。血血 清清血清质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56 56，30 30 分钟。分钟。血清的消毒：过滤除菌。血清的消毒：过滤除菌。血清的使用血清的使用一般说来，含一般说来，含5 5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加死，但支持细胞生长一般需加1010血清。血清。对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。复杂成分至今尚未完全清楚。血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用用无血清培养基无血清培养基培养细胞。培养细胞。血清的作用血清的作用无血清培养基无血清培养基细胞培养细胞培养的基本操作的基本操作技术技术一、无一、无菌菌技技术术微生物污染一直是细胞培养的主要问题。无菌程度梯度示意图培养室的灭菌培养室的灭菌实验人员的无菌准备实验人员的无菌准备工作面无菌原则工作面无菌原则正确的工作台面布局正确的工作台面布局物品在工作台中部洁净区围成新月状，酒精灯位于中央。保持台面整齐保持台面整齐Good！Bad！无菌操作无菌操作凡是带入超净工作台凡是带入超净工作台内瓶子内瓶子均要用均要用75酒精擦拭瓶子的外表面酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精灯火焰操作。靠近酒精灯火焰操作。玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必须过火灭菌玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必须过火灭菌打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近。打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近。无菌级别高的物品不能触碰无菌级别低的物品。手不能从敞开的瓶口无菌级别高的物品不能触碰无菌级别低的物品。手不能从敞开的瓶口上方经过上方经过各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。到废液缸。吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端。手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端。尽可能移走不需要的物品，在操作中经常用酒精擦拭台面。尽可能移走不需要的物品，在操作中经常用酒精擦拭台面。尽可能减少开盖时间。尽可能减少开盖时间。随时擦去任何溢出物。随时擦去任何溢出物。无菌操作无菌操作倾倒倾倒废液时防止溅起和瓶口回流。废液时防止溅起和瓶口回流。在视野范围内工作。在视野范围内工作。无菌的无菌的思想贯穿到细胞培养思想贯穿到细胞培养的任何操作的任何操作步骤步骤二、培养二、培养细胞的细胞的观察观察（一）肉眼观察培养物颜色及混浊度（二）倒置显微镜观察细胞生长状态培养培养细胞的生物学细胞的生物学特征特征 1.体外培养细胞的分型 2.培养细胞的生长和增殖过程 3.体外培养细胞的种类4.细胞系或细胞株的命名 体外体外培养细胞的分型培养细胞的分型 1.贴附型：贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：成纤维细胞成纤维细胞上皮型细胞上皮型细胞游走细胞型游走细胞型多型细胞型多型细胞型2.悬浮型：悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。成纤维细胞型：成纤维细胞型：贴附型细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。上皮型细胞：上皮型细胞：游走细胞型游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。多形细胞多形细胞型：型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。2.悬浮型概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)细胞生物学技术课件73悬浮细胞培养培养细胞的生长和增殖过程细胞的生长和增殖过程 1.1.培养细胞生命期（培养细胞生命期（Life Span of Culture CellsLife Span of Culture Cells）指细胞在整个离体培养过程中持续增殖和生长的时间，分为：原代培养期、传代期和衰退期。2.2.组织培养细胞一代生存期组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增(Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。概念概念“代代”细胞分裂一次？错！培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。细胞生物学技术课件77原原代代培培养养传传代培养代培养每代贴附生长细胞的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期平台期游离:悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形;吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁;潜伏期:可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相.细胞贴壁过程1.细胞密度：细胞密度：接种的细胞密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长。2.细胞类型：细胞类型：传代培养的细胞潜伏期比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞,一般为624h;原代2496h或更长。单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢。连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系与正常二倍体细胞的短。来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长；成体组织:长。3.细胞机能状态：细胞机能状态：不良者慢。4.培养条件：培养条件：培养液,pH,底物等，不利：污染,有毒；慢。滞留时间的长短与：细胞种类、接种的细胞密度、培养条件等因素有关。初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。潜伏期潜伏期指数生长期指数生长期停滞期停滞期有丝分裂指数有丝分裂指数(MI):指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。一般细胞的MI约为0.1 0.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%5%。细胞细胞群体倍增时间：群体倍增时间：培养物种中细胞数量翻倍的平均时间MTT法：法：反映细胞内线粒体中一种酶活性程度标记核苷酸标记核苷酸(3H-TdR)掺入量掺入量：反映DNA合成判断细胞生长的指标判断细胞生长的指标：指数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性)可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标。1.1.初初代培养代培养 又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。2.2.细胞系细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。3.3.细胞株细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。体外体外培养细胞培养细胞的种类的种类 4.4.二倍体二倍体细胞细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有810代，人胚神经胶质细胞1530代。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种，用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。5 5.遗传缺陷细胞遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。6 6.肿瘤细胞系或株肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（NIH）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。细胞系细胞系或细胞株的命名或细胞株的命名 细胞系或株的鉴定、管理和使用 培养简历：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等；冻冻 存存 液：液：培养基和防冻液名称；细胞活力：细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性；培培 养养 液：液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量；细胞形态：细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性核核 型：型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无无污染检测：无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等物种检测：物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测免疫检测：免疫检测：一两种血清学检测细胞建立者：细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名如：ATCC入库细胞要求检测项目同时附有照片（高低密度）细胞培养的污染和检测细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。肉眼直接观察法、培养检查法、显微镜观察法细菌和真菌的污染和检测支原体的污染和检测造成支原体高污染率的原因有多种 1.支原体大小0.10.8 m，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 m）；2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞、培养基、血清 等。相差显微镜观察法 Hayflick培养基直接培养法 DNA荧光染色法 PCR方法 特异引物扩增支原体 DNA支原体的检测支原体污染后的抗生素处理:第一种方法：使用泰乐菌素（tylosin，Sigma)，泰乐菌素是一种兽用抗生素,常用在鸡、猪的食料辅料，可以防止支原体感染引起的支气管哮喘，至今尚未见有耐药菌株，是治疗支原体感染的特效药。第二种方法：M-Plasmocin,InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。第三种方法：用BM-Cyclin-1/2，效果很好，方法如下：细胞传代同时加BM-Cyclin-1 10g/ml，37培养3天，加入BM-Cyclin-2 5 g/ml，37培养3天；（不需传代，因为支原体污染的细胞生长非常慢！）如果细胞生长恢复正常，即可结束。否则加BM-Cyclin-1 20 g/ml，37培养3天，加入BM-Cyclin-2 10 g/ml，37培养3天。怀疑是支原体污染的就可以试试，对细胞不会有太大影响。3.病毒的污染和检测 细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 免疫学检查 PCR技术常用抗生素用量和效应抗生素抗菌谱细菌 真菌 支原体 常用浓度青霉素 G+100IU/ml链霉素 G-100g/ml庆大霉素 G+,G-200g/ml四环素 G+,G-10g/ml 卡那霉素 G+,G-50g/ml 两性霉素 2 g/ml 制霉菌素 25 g/ml 细胞培养中的研究细胞培养中的研究方法方法内容提要内容提要一、细胞生长状况观察一、细胞生长状况观察二、细胞活力测定二、细胞活力测定三、细胞凋亡检测三、细胞凋亡检测四、流式细胞术四、流式细胞术五、常用单细胞分离五、常用单细胞分离技术技术六、真核细胞转染六、真核细胞转染一、细胞生长状况观察一、细胞生长状况观察 1 1.常规观察常规观察 2 2.细胞计数细胞计数 3 3.细胞生长曲线细胞生长曲线 4 4.细胞分裂指数细胞分裂指数 5.5.细胞贴壁率细胞贴壁率 6.6.细胞周期细胞周期 1.1.常规观察常规观察 倒置显微镜倒置显微镜下观察，生长状态好的细胞透明度大，细胞内下观察，生长状态好的细胞透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡。包膜清晰。培养液清澈透明，无悬浮细胞颗粒少，没有空泡。包膜清晰。培养液清澈透明，无悬浮细胞和碎片。和碎片。从从培养基颜色判断：正常桃红色，当变浅变黄，需换液或培养基颜色判断：正常桃红色，当变浅变黄，需换液或传代。传代。培养液培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌，表示微生物污染。浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌，表示微生物污染。细胞细胞生长变慢，支原体污染。生长变慢，支原体污染。2.2.细胞计数细胞计数血球计数板计数血球计数板计数法法电子计数仪计数法电子计数仪计数法n n电子计数仪计数法电子计数仪计数法电子计数仪计数结果电子计数仪计数结果3.3.细胞生长曲线细胞生长曲线 实验实验用细胞必须生长特征稳定，可采用细胞计数法测定并绘用细胞必须生长特征稳定，可采用细胞计数法测定并绘制细胞生长曲线来观察细胞状态。制细胞生长曲线来观察细胞状态。方法：方法：取生长状态较好细胞接种取生长状态较好细胞接种2424孔板，每天或隔天计数（孔板，每天或隔天计数（3 3 个复个复孔），计数孔），计数1-21-2周，以细胞数对时间作图绘制生长曲线。周，以细胞数对时间作图绘制生长曲线。用用MTTMTT法测定法测定9696孔板中细胞生长孔板中细胞生长4.4.细胞分裂指数细胞分裂指数 指指分裂细胞占全分裂细胞占全部细胞中的比例，可部细胞中的比例，可反映细胞增殖旺盛程反映细胞增殖旺盛程度，一般计算观察度，一般计算观察10001000个细胞。个细胞。5.5.细胞贴壁率细胞贴壁率6.6.细胞周期：细胞周期：同位素标记、流式细胞仪同位素标记、流式细胞仪二、细胞活力测定细胞活力测定细胞活力测定是体外是体外研究中应用最广的技术手段研究中应用最广的技术手段之一之一任任何何培培养养瓶瓶内内生生长长的的细细胞胞都都由由死死细细胞胞和和活活细细胞胞组组成成，从形态上区别死、活细胞是困难的。从形态上区别死、活细胞是困难的。1.细胞克隆形成率实验测定单个细胞的增殖能力测定单个细胞的增殖能力单个细胞在体外增殖单个细胞在体外增殖6 6代以上，其后代所组成的细胞群体代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数克隆形成率比克隆形成数接种细胞数缺点：操作繁琐缺点：操作繁琐优点：精确、可靠优点：精确、可靠常见方法：平板克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验常见方法：平板克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验2.2.台盼蓝排斥试验台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。活细胞总数活细胞总数100100活细胞率（活细胞率（）活细胞总数死细胞总数活细胞总数死细胞总数注意：简单，最常用。染色时间不宜过长注意：简单，最常用。染色时间不宜过长3.3.四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法或比色法或 CCK8CCK8检测检测测定细胞存活和生长。测定细胞存活和生长。快速、简单、灵敏度高快速、简单、灵敏度高三、细胞凋亡检测三、细胞凋亡检测1.1.形态学观察形态学观察2.2.电泳法电泳法3.3.原位切口末端标记法（原位切口末端标记法（TUNELTUNEL）4.4.流式细胞术测定法流式细胞术测定法1.1.形态学观察形态学观察2.2.电泳法电泳法3.3.原位切口末端标记法（原位切口末端标记法（TUNELTUNEL）4.流式细胞术测定法流式细胞术测定法五、常用单细胞分离技术五、常用单细胞分离技术 指指从细胞群体中分离出一个细胞使其在体外繁殖从细胞群体中分离出一个细胞使其在体外繁殖成新的细胞群体。成新的细胞群体。用于用于细胞纯化及比较不同亚群的形态和功能细胞纯化及比较不同亚群的形态和功能。方法：方法：有限稀释法、平皿克隆分离法、软琼脂克隆分有限稀释法、平皿克隆分离法、软琼脂克隆分离法。离法。细 胞 库American Type Culture Collection(ATCC)http:/www.ACTT.org中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库http:/ http:/ End