细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳培训课件

细胞凋亡的胞凋亡的DNADNA琼脂糖脂糖凝胶凝胶电泳泳细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosis/programmed cell death）细胞凋亡是为维持内环境稳定，一个由基因细胞凋亡是为维持内环境稳定，一个由基因控制的主动的有序的死亡过程，凋亡细胞将被吞控制的主动的有序的死亡过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。噬细胞吞噬。生物学意义：生物学意义：确保正常发育生长：清除多余的细胞确保正常发育生长：清除多余的细胞 维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞 积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制2细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳3细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳细胞凋亡过程中的形态学改变细胞凋亡过程中的形态学改变细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离。细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离。细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素细胞色素C到胞浆。到胞浆。核质浓缩，核膜核仁破碎，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约降解成为约180bp-200bp片片段。段。凋亡小体形成。但无内容物外溢，因此不引起周围的炎症凋亡小体形成。但无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。4细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳5细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳 其其中中最最重重要要和和最最具具有有特特征征性性的的改改变变是是Ca2+/Mg2+依依赖赖性性的的核核酸酸内内切切酶酶的的激激活活而而导导致致染染色色质质DNA在在核核小小体体连连接接部部位位断断裂裂，形形成成以以180200 bp为为最最小小单单位位的的单单体体或或寡寡聚聚体体片片段。段。6细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳凋亡和坏死的区别凋亡和坏死的区别坏死（坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞作用引起细胞无序变化无序变化的死亡过程。表现为细胞的死亡过程。表现为细胞 胀大，胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充降解不充分，引起局部严重的炎症反应。分，引起局部严重的炎症反应。凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答变化或缓和性损伤产生的应答有序变化有序变化的死亡过程。其细的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。胞及组织的变化与坏死有明显的不同。7细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳凋亡和坏死的形态学特征凋亡和坏死的形态学特征凋凋 亡亡坏坏 死死单细胞或一小群细胞单细胞或一小群细胞相邻的细胞团相邻的细胞团细胞皱缩和卷积细胞皱缩和卷积细胞肿胀细胞肿胀核固缩和和碎裂核固缩和和碎裂核溶解核溶解完整的细胞膜完整的细胞膜破坏的细胞膜破坏的细胞膜细胞质保留在凋亡小体细胞质保留在凋亡小体细胞质释放细胞质释放无炎症无炎症一般都存在炎症一般都存在炎症8细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理实验原理本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质胞染色质DNA在核小体连接处断裂，形成在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱现为梯状电泳图谱(DNA ladder)，而坏死细胞或凋，而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊的电泳后则成模糊的“涂片状涂片状”。9细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳材材 料料1.凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞2.提取提取DNA：基因组：基因组DNA抽提试剂盒（抽提试剂盒（RNA酶、酶、蛋白酶蛋白酶K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、DNA ladder 标准品等）标准品等）3.DNA电泳：电泳：1%的琼脂糖凝胶、点样缓冲液的琼脂糖凝胶、点样缓冲液4.实验器材：实验器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、台式管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、高速离心机、65水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪紫外透射仪 10细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳方方 法法一、胸腺细胞的制备：一、胸腺细胞的制备：小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含510%小牛血清的小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨，培养液中，置铜网上研磨，将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm，离心离心5min，制成，制成1107细胞悬液备用。细胞悬液备用。11细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳二、提取胸腺细胞二、提取胸腺细胞DNA：裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、液、RNaseA/蛋白酶蛋白酶K液液=A液）液）将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入100lL液和液和20lA液，充分混匀，置于液，充分混匀，置于55温浴温浴20分钟，其间来回颠倒离心管分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。次。12细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳(2)结合结合DNA阶段阶段(使用到的试剂使用到的试剂:结合缓冲液结合缓冲液=B液、液、3MNaAC,pH4.8)加入加入10l 3MNaAC，随后加入，随后加入1250l B液，充分液，充分振荡混合均匀（重要！），振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心离心3min。将上清分将上清分2次加入到离心吸附管。静置次加入到离心吸附管。静置1分钟，分钟，12000rpm离心离心30s，倒掉收集管中废液。第二次，倒掉收集管中废液。第二次同上，静置同上，静置1分钟，离心分钟，离心30s。13细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳(3)漂洗阶段（使用试剂：漂洗阶段（使用试剂：600ul漂洗缓冲液漂洗缓冲液2=W液）液）倒掉收集管中的废液，再加入倒掉收集管中的废液，再加入600ulW液，液，12000rpm离心离心30秒。秒。重复上叙步骤，再次加入重复上叙步骤，再次加入600 ulW液，液，12000rpm离心离心30秒。秒。倒掉废液，再次倒掉废液，再次12000rpm离心离心30秒。秒。14细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳(4)洗脱收获（使用试剂：洗脱收获（使用试剂：50l洗脱缓冲液洗脱缓冲液=T液）液）小心取出离心吸附柱（不可沾上小心取出离心吸附柱（不可沾上W液，因其中含液，因其中含有乙醇，会使提取有乙醇，会使提取DNA变性），将其套入一个干变性），将其套入一个干净的净的1.5ml eppendorf管中，沿吸附柱的正中间小管中，沿吸附柱的正中间小心加入心加入50l T液，静置液，静置1分钟后，于分钟后，于12000rpm离心离心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因组管中便是收集到的基因组DNA,取取10l电泳。电泳。15细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳三、三、DNA琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：(5)制板制板:将将1%的琼脂糖凝胶加热溶化，取的琼脂糖凝胶加热溶化，取20ml倒倒板板,待凝待凝,取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液至淹没过胶。至淹没过胶。(6)加样：取加样：取50 uL DNA样品与样品与10uL点样缓冲液点样缓冲液,混混匀匀,10ul/孔。（孔。（DNA marker 直接加样，直接加样，5 ul/孔）。孔）。16细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳(7)电泳：点样孔置负极，电压电泳：点样孔置负极，电压80-100V，电泳至溴，电泳至溴酚兰移出酚兰移出2/3距离时，关闭电源。距离时，关闭电源。(8)观察：取出凝胶板，置紫外透射仪上，可见绿观察：取出凝胶板，置紫外透射仪上，可见绿色色DNA区带。区带。17细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳注意事项：注意事项：a 步骤步骤2中，加入中，加入B液后一定要充分混匀。离心后，液后一定要充分混匀。离心后，小心取出上清，小心取出上清，Tips头不可吸附上白色沉淀（为头不可吸附上白色沉淀（为基因组蛋白）。基因组蛋白）。b 漂洗阶段（步骤漂洗阶段（步骤3）一定要离心充分去除漂洗缓）一定要离心充分去除漂洗缓冲液，可适当将离心时间延长。冲液，可适当将离心时间延长。c 洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。18细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳地塞米松诱导小鼠胸腺地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡细胞凋亡1：DNA marker;2-3：细胞坏死对照：细胞坏死对照4-6：细胞凋亡；：细胞凋亡；7：正常细胞对照正常细胞对照20细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳基因组基因组DNADNA抽提试剂盒抽提试剂盒SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA分离分离EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的酶活性，确保目的DNA不再降解不再降解Proteinase K：使染色质上蛋白质与：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小分离，并进一步降解为小肽肽/氨基酸氨基酸酚、氯仿：抽提除去蛋白质酚、氯仿：抽提除去蛋白质异丙醇：沉淀异丙醇：沉淀DNAGoldview：DNA萤光染料，与萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫结合形成一种光络合物，在紫外光下呈绿色萤光外光下呈绿色萤光21细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳22细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳TNF receptor-associated death domain(TRADD)Fas-associated death domain protein(FADD)cysteine-aspartic proteases（caspase）23细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳24细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞形态的改变细胞形态的改变DNA片段片段检测检测caspase，裂解的底物，调节因子和抑制因子，裂解的底物，调节因子和抑制因子细胞膜的改变细胞膜的改变线粒体改变线粒体改变25细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳细胞形态的改变细胞形态的改变电镜检测：电镜检测：可检测单个凋亡细胞的变化，但细胞凋亡早期可检测单个凋亡细胞的变化，但细胞凋亡早期无明显形态学变化的，需做其他实验证实。无明显形态学变化的，需做其他实验证实。26细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳正常胸腺细胞正常胸腺细胞凋亡胸腺细胞凋亡胸腺细胞27细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳凋亡的淋巴细胞凋亡的淋巴细胞凋亡的淋巴细胞凋亡的淋巴细胞被巨噬细胞吞噬被巨噬细胞吞噬28细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳DNA片段的检测片段的检测DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳TUNEL法法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）：）：基本原理：存在于基本原理：存在于DNA上的切口可被末端脱氧核苷酸转移酶上的切口可被末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）识别，这种酶将催化）识别，这种酶将催化dUTP添加到切口上，添加到切口上，dUTP继继而可被其它标志物所标记。此法亦可用于标记遭到严重而可被其它标志物所标记。此法亦可用于标记遭到严重DNA损伤的细胞。损伤的细胞。TUNEL染色染色法展示出小鼠法展示出小鼠肝脏中的一个肝脏中的一个凋亡细胞凋亡细胞29细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳Caspase等凋亡相关因子检测等凋亡相关因子检测western blot,immunoprecipitation Immunohistochemistry Apoptosis PCR microarrayApoptotic or anti-apoptotic regulator proteins such as Bax,Bid,and Bcl-2 can also be detected using fluorescence and confocal microscopy 30细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞膜的改变检测细胞膜的改变Annexin V基本原理：正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质基本原理：正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。检测细胞早期凋亡的灵敏指标。31细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳线粒体的改变线粒体的改变线粒体检测：线粒体检测：激光扫描共聚焦显微镜检测激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转）线粒体通透性转换（换（MPT），），2）线粒体内膜去极化，）线粒体内膜去极化，3）钙离子）钙离子流改变，流改变，4）线粒体氧化还原状态等。）线粒体氧化还原状态等。缺陷：不能区分凋亡和坏死缺陷：不能区分凋亡和坏死细胞色素细胞色素C释放：释放：荧光显微镜荧光显微镜/电镜观测电镜观测缺陷：细胞色素缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。释放到胞浆后不稳定。32细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳凋亡的生理学意义凋亡的生理学意义发育发育33细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳凋亡的生理学意义凋亡的生理学意义清除自身感染或变异的细胞清除自身感染或变异的细胞34细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳