第六章酶工程制药part教学课件

第六章第六章 酶工程制药酶工程制药7/17/20241一、酶工程简介（Enzyme Engineering）酶工程是酶学和工程学相互渗透结合，发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。1953年，Grubhoger 和 Schleith 提出了酶固定化技术。1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。第一节 概 述7/17/20242现代酶工程的主要内容：a.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应监测；c.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d.酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e.有机相中酶反应的研究；f.酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g.抗体酶、核酸酶的研究；h.模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。7/17/20243二、酶的来源和生产商1、酶的来源：酶的生产目前只宜直接从生物体中提取 分离。早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是：A.微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都从微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都从 微生物中得到；微生物中得到；B.微生物繁殖快，生产周期端，培养简便，并可通过控制微生物繁殖快，生产周期端，培养简便，并可通过控制 培养条件来提高酶的产量；培养条件来提高酶的产量；C.微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌株。能培育出新的高产菌株。7/17/20244二、酶的来源和生产商2、酶的生产菌 对菌种的要求：a a、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最好是、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最好是 产生胞外酶的菌；产生胞外酶的菌；b b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不 产生毒素；产生毒素；c c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；d d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。7/17/20245 生产菌的来源：a a、菌种保藏机构和有关研究部门获得。、菌种保藏机构和有关研究部门获得。b b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种 的主要来源，土壤，深海，温泉，火山，森林等的主要来源，土壤，深海，温泉，火山，森林等 都是菌种采集地。都是菌种采集地。筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛，纯化，筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛，纯化，复筛和生产性能检定等。复筛和生产性能检定等。菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变，基菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变，基 因转移和基因克隆。因转移和基因克隆。7/17/20246 目前常用的产酶微生物 A、E.coil：是应用最广泛的产霉菌。分泌胞内酶，：是应用最广泛的产霉菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸 脱羧酶，天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、脱羧酶，天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳半乳 糖苷酶。糖苷酶。B、枯草杆菌：主要用于生产、枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、淀粉酶、-葡萄葡萄 糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包 等。等。D、曲酶（黑曲霉和黄曲霉）：主要生产糖化酶、曲酶（黑曲霉和黄曲霉）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰 化酶和脂肪酶。化酶和脂肪酶。E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉 菌等。菌等。7/17/20247第二节 酶和细胞的固定化一、什么是固定化酶？7/17/20248定义：定义：定义：定义：指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。7/17/20249酶的固定化技术和固定化酶酶的固定化技术和固定化酶7/17/202410二、固定化酶的特点：1.可以在较长时间内多次使用，而且在多数情况下，2.酶的稳定性提高。3.2.反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留4.酶，易于纯化，产品质量高。5.3.反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自6.动化控制。7.4.酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶8.量减少。9.5.比水溶性酶更适合于多酶反应。优点;7/17/202411二、固定化酶的特点：缺点：1.固定化时，酶活力有损失。2.增加了生产成本，工厂初始投资大。3.只能用于可溶性底物，而且较适合于小分子底物4.，对大分子底物不适宜。5.4.胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。6.5.与完整菌体相比不适宜用于多酶反应，特别是需要7.辅助因子的反应。7/17/202412三、酶的固定化方法与制备技术一、载体结合法一、载体结合法二、交联法二、交联法三、包埋法三、包埋法 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 微囊型 胶囊型7/17/2024131.1.物理吸附法物理吸附法用物理方法将酶吸附于不溶性载体的一种固定方法此类载体很多。无机载体：活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、等。天然高分子载体：淀粉、谷蛋白、纤维素等7/17/2024141.1.物理吸附法物理吸附法 静止法静止法静止法静止法 电沉积法电沉积法电沉积法电沉积法 反应器上直接吸附法反应器上直接吸附法反应器上直接吸附法反应器上直接吸附法 混合浴或震荡浴吸附法混合浴或震荡浴吸附法混合浴或震荡浴吸附法混合浴或震荡浴吸附法7/17/202415优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体；固定化过程可与纯化过程同时实现；酶失活后载体仍可再生。缺点：吸附酶量无规律可循，对不同载体和不同酶的吸附条件不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系；酶与载体之间结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物7/17/2024162.2.离子结合法离子结合法 离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换的水不溶性载体上的固定化方法，此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素。7/17/2024172.2.离子结合法离子结合法优点：操作简单、处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的强度下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。7/17/202418酶分子 含有离子交换基团的固相载体第一个离子结合法固定化酶 DEAECellulose 固定化过氧化酶第一个工业化的固定化酶 DEAESephadex A-50 固定化氨基酰化酶2.2.离子结合法离子结合法7/17/2024193.3.共价结合法共价结合法 共价结合法使酶以共价结合于载体上的固定化方法。也就是使酶分子上非活性部位功能团与载体表面活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接方法。它是研究最广泛、内容最丰富的固定化方法。7/17/2024203.3.共价结合法共价结合法优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺点：反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。7/17/202421二、交联二、交联法法 交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。7/17/2024227/17/202423二、交联二、交联法法 交联法的反应条件比较激烈，固定化酶的酶活回收率一般比较低，但是尽可能降低交联剂的浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。一般用交联法所得到的固定化酶颗粒小、结构性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。如：先用明胶包埋，在用戊二醛交联。7/17/202424双功能试剂：常用的是戊二醛第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶7/17/2024257/17/2024267/17/2024277/17/2024287/17/2024297/17/2024307/17/202431三、包埋法三、包埋法包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网络型，将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。适于：小分子的底物和酶7/17/202432微囊型7/17/202433首先被采用的胶格包埋法是胶格包埋法 固定化胰蛋白酶固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 -淀粉淀粉酶酶Enzyme+N，N-甲叉双丙稀酰胺，丙烯酰胺引发剂-inactiation7/17/202434三、包埋法三、包埋法包埋法制备固定化酶的条件温和，不改变酶的结构，操作时保护剂及稳定剂均不影响酶的包埋率，适用于多种酶、粗酶制剂、细胞器和细胞的固定化。7/17/202435四、固定化酶在工业生产上的应用四、固定化酶在工业生产上的应用7/17/2024367/17/2024371、固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术，被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。细胞固定化技术是酶固定化技术的发展，因此固定化细胞也成为第二代固定化酶技术的发展，因此固定化细胞也称为第二代固定化酶。固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，比固定化酶应用普遍。四、固定化细胞的制备7/17/2024382、固定化细胞的特点 无需进行酶的分离纯化无需进行酶的分离纯化无需进行酶的分离纯化无需进行酶的分离纯化 细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高 细胞内酶比固定化酶的稳定性高细胞内酶比固定化酶的稳定性高细胞内酶比固定化酶的稳定性高细胞内酶比固定化酶的稳定性高 细胞内酶的辅因子可以自动再生细胞内酶的辅因子可以自动再生细胞内酶的辅因子可以自动再生细胞内酶的辅因子可以自动再生 细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 抗污染能力强抗污染能力强抗污染能力强抗污染能力强7/17/2024393、固定化细胞的制备技术 载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点优点优点优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。缺点缺点缺点缺点：吸附容量小结合强度低。包埋法制备技术：与包埋法相同。交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞技术。通过助滤剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。7/17/2024404、酶和细胞的固定化载体 吸附载体：无机物和有机物。包埋载体：卡拉胶、海藻胶（工业上常用方法）共价结合载体：纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃。7/17/202441载体应具备的条件：固定化过程中不引起酶变性；固定化过程中不引起酶变性；固定化过程中不引起酶变性；固定化过程中不引起酶变性；对酸碱有一定的耐受性对酸碱有一定的耐受性对酸碱有一定的耐受性对酸碱有一定的耐受性 有一定的机械强度；有一定的机械强度；有一定的机械强度；有一定的机械强度；有一定的亲水性和稳定性；有一定的亲水性和稳定性；有一定的亲水性和稳定性；有一定的亲水性和稳定性；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；共价结合时有可可活化基团；共价结合时有可可活化基团；共价结合时有可可活化基团；共价结合时有可可活化基团；有耐受酶和微生物细胞的能力；有耐受酶和微生物细胞的能力；有耐受酶和微生物细胞的能力；有耐受酶和微生物细胞的能力；廉价易得。廉价易得。廉价易得。廉价易得。4、酶和细胞的固定化载体7/17/202442谢谢！