高效液相色谱仪的原理及应用知识课件

高效液相色谱仪的原理高效液相色谱仪的原理及应用及应用2024/7/11高效液相色谱仪的原理及应用2023/8/131一、高效液相色谱法的定义和分类一、高效液相色谱法的定义和分类流流动动相相是是液液体体的的色色谱谱称称为为液液相相色色谱谱（LC）。）。在在液液相相色色谱谱中中，采采用用颗颗粒粒十十分分细细的的高高效效固固定定相相，并并采采用用高高压压泵泵输输送送流流动动相相，全全部部工工作作通通过过仪仪器器完完成成，这这种种色色谱谱称称为为高高效液相色谱效液相色谱（HPLC）。第一节第一节 高效液相色谱法原理高效液相色谱法原理2024/7/11一、高效液相色谱法的定义和分类流动相是液体的色谱称为液相色谱2一、高效液相色谱法的定义和分类一、高效液相色谱法的定义和分类液相色谱：平板色谱和柱色谱。液相色谱：平板色谱和柱色谱。液液相相色色谱谱：分分配配色色谱谱、液液固固色色谱谱、离离子子交交换换色谱、尺寸排阻色谱。色谱、尺寸排阻色谱。气气相相色色谱谱：挥挥发发性性物物质质，不不能能用用于于热热不不稳稳定定物质分析。物质分析。液液相相色色谱谱：可可分分析析各各种种物物质质，热热不不稳稳定定物物质质，但但流流动动相相有有毒毒，运运行行操操作作比比GC难难。能能用用GC就用就用GC。2024/7/11一、高效液相色谱法的定义和分类液相色谱：平板色谱和柱色谱。23二、液相色谱中常用术语和参数二、液相色谱中常用术语和参数只针对只针对HPLC特有的，其余术语与第三章同。特有的，其余术语与第三章同。粒粒间间体体积积（V0）：色色谱谱柱柱填填充充剂剂颗颗粒粒间间隙隙中中流动相所占有的体积。流动相所占有的体积。孔孔体体积积（Vp）：色色谱谱柱柱中中多多孔孔填填充充剂剂的的所所有孔洞中流动相所占有的体积。有孔洞中流动相所占有的体积。2024/7/11二、液相色谱中常用术语和参数只针对HPLC特有的，其余术语与4二、液相色谱中常用术语和参数二、液相色谱中常用术语和参数柱柱外外体体积积（Vext）：从从进进样样系系统统到到检检测测器器之之间间色色谱谱柱柱以以外外的的液液路路部部分分中中流流动动相相所所占占有有的的体积。体积。液液体体总总体体积积（Vtot）：粒粒间间体体积积、孔孔体体积积和和柱外体积之和。柱外体积之和。淋淋洗洗体体积积（V）：从从进进样样开开始始计计算算的的通通过过色色谱柱的实际淋洗体积。谱柱的实际淋洗体积。2024/7/11二、液相色谱中常用术语和参数柱外体积（Vext）：从进样系统5三、反相高效液相色谱三、反相高效液相色谱 由由非非极极性性固固定定相相和和极极性性流流动动相相所所组组成成的的液液相相色色谱谱体体系系。其其代代表表性性的的固固定定相相是是十十八八烷烷基基键键合合硅硅胶胶(ODS柱柱），代代表表性性的的流流动动相相是是甲甲醇醇和和乙乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。溶溶质质在在吸吸附附于于填填料料表表面面烃烃类类上上的的“改改良良固固定定相相”和流动相之间进行分配和流动相之间进行分配溶溶质质被被吸吸附附于于填填料料表表面面烃烃类类分分子子上上，类类似似吸吸附附色谱。色谱。2024/7/11三、反相高效液相色谱 由非极性固定相和极性流动相所组成6四、正相高效液相色谱四、正相高效液相色谱是是由由极极性性固固定定相相和和非非极极性性（或或弱弱极极性性）流流动动相相所所组组成成的的HPLC体体系系。其其代代表表性性的的固固定定相相是是改改性性硅硅胶胶、氰氰基基柱柱等等，代代表表性性的的流流动动相相是是正正己烷。吸附色谱也属正相己烷。吸附色谱也属正相HPLC。溶溶剂剂洗洗脱脱强强度度近近似似地地随随溶溶剂剂的的介介电电常常数数增增加加而而增增大大，洗洗脱脱能能力力越越弱弱，溶溶质质在在柱柱上上保保留留时时间越长。间越长。2024/7/11四、正相高效液相色谱是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相7第二节第二节 高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成Agilent 11002024/7/11第二节 高效液相色谱仪的组成Agilent 110020281.输液系输液系统统2.进样系进样系统统3.分离系分离系统统4.检测系检测系统统5.数据处数据处理理 系统系统一一 高效液相色谱仪系统高效液相色谱仪系统高压泵高压泵流动相溶剂流动相溶剂废液废液色谱柱色谱柱进样口进样口检测器检测器2024/7/111.输液系统一 高效液相色谱仪系统高压泵流动相溶剂废液色谱91 1、输液系统、输液系统 贮液装置贮液装置 脱气装置脱气装置高压输液泵高压输液泵梯度淋洗系统梯度淋洗系统输液系统的功能输液系统的功能:1.提供足够的驱动力使流动相通过填充柱提供足够的驱动力使流动相通过填充柱 2.使流动相流量精确和稳定使流动相流量精确和稳定 3.使流动相组成精确使流动相组成精确2024/7/111、输液系统 贮液装置 输液系统的功能:2023/8/110 分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常用用1L的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接到泵入口处的管线上要加一个过滤器。到泵入口处的管线上要加一个过滤器。(1)贮液装置贮液装置 2024/7/11 分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常用1L的锥形瓶加一11(2)脱气装置脱气装置 用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。气装置再输送到色谱柱。脱气机、超声脱气、真空脱气等。脱气机、超声脱气、真空脱气等。2024/7/11(2)脱气装置 2023/8/1312(3)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙乙酸乙酯酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)2024/7/11流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重32 1 1、环境中有机氯农药残留量分析、环境中有机氯农药残留量分析 固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：折光示差检测器检测器：折光示差检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。第三节第三节 HPLC的应用的应用2024/7/11 1、环境中有机氯农药残留量分析 可对水果、332、稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。固定相固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器2024/7/112、稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。固定相：34例：液相色谱法测定食品中苯并例：液相色谱法测定食品中苯并(a)芘芘原理：原理：样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。仪器：仪器：(1)液相色谱仪：液相色谱仪：色谱柱：色谱柱：ODS柱，柱长柱，柱长250mm，4mm；柱温：柱温：30；流动相：流动相：75甲醇；甲醇；流速：流速：2mLmin。(2)检测器：荧光检测器，激发波长检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长荧光波长405nm。2024/7/11例：液相色谱法测定食品中苯并(a)芘2023/8/1335操作步骤：操作步骤：(1)定性测定定性测定 用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加标准样产生重叠的情况进行定性。标准样产生重叠的情况进行定性。(2)标准曲线的绘制标准曲线的绘制 用微量注射器准确吸取每用微量注射器准确吸取每1mL含含1g的的苯并芘标准溶液苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，按照上述实验条件进行操作，以获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以以获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。(3)样品的测定：样品的测定：在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。2024/7/11操作步骤：2023/8/1336 Waters 515高效液相色谱泵，高效液相色谱泵，Waters 717自动进样器，自动进样器，Waters 2487双波长紫外检测器，双波长紫外检测器，联想数据处理机，联想数据处理机，Waters 3.9 X 150 mm C18不锈钢柱不锈钢柱流动相：甲醉、水体积比流动相：甲醉、水体积比30：70 和和15：85两种，两种，超声波除气泡超声波除气泡3、鱼组织中喹乙醇残留量的检测2024/7/11 Waters 515高效液相色谱泵，流动相：甲醉、水体积比37无喹乙醇的鲤肌肉无喹乙醇的鲤肌肉喹乙醇标准品喹乙醇标准品含喹乙醇的鲤肌肉含喹乙醇的鲤肌肉2024/7/11无喹乙醇的鲤肌肉喹乙醇标准品含喹乙醇的鲤肌肉2023/8/1384、中药质量检测芍药苷芍药苷白芍药材白芍药材2024/7/114、中药质量检测芍药苷白芍药材2023/8/1339血竭素血竭素 血竭药材血竭药材2024/7/11血竭素 血竭药材2023/8/1340作业P7322024/7/11作业P73 22023/8/1341xiexie2024/7/11xiexie2023/8/1342