第12章DNA的复制重组与修复课件

第十二章第十二章 DNA的复制、修复和重组n n分子生物学的中心法则分子生物学的中心法则(central-dogma):(central-dogma):19581958年，由年，由Francis.CrickFrancis.Crick提出。提出。第一节第一节DNA的代谢一、一、DNA代谢包括代谢包括DNA复制、修复和重组复制、修复和重组二、大肠杆菌遗传图二、大肠杆菌遗传图二、大肠杆菌遗传图二、大肠杆菌遗传图第二节第二节DNA复制的一般规律一、关于模板的概念一、关于模板的概念n n模板（template）：1.早期推测模板分子的表面可以让许多小分子按一定排列顺序排列，然后连接这些小分子形成有特定结构和功能的大分子。2.Watson-Crick DNA双螺旋结构表明，DNA双链严格按碱基配对互补，故，如以一条链为模板，可合成另一条有既定顺序的互补链。二、二、DNA复制是半保留的复制是半保留的n n半保留复制(semi conservative replication):亲代的DNA双链，每条链都可作为模板，复制一条新链。二个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一致，其中一条链来自亲代DNA链，另一条是新合成的。n nThe Meselson-Stahl experiment:1957年，由Mathew Meselson和Franklin Stahl设计。三、三、DNA复制的起点与方向复制的起点与方向n n复制从原点（复制从原点（originorigin）开始双向进行的）开始双向进行的n n John Cairns experimentJohn Cairns experiment四、四、DNA的复制是半不连续的的复制是半不连续的n nDNADNA合成的方向为合成的方向为合成的方向为合成的方向为5533，复制是半不连续的。，复制是半不连续的。，复制是半不连续的。，复制是半不连续的。第三节第三节DNA聚合酶一、一、DNA是由是由DNA聚合酶催化合成的聚合酶催化合成的n n19551955年，年，Arthur KornbergArthur Kornberg 及其同及其同事从事从 E.coliE.coli发现发现I I 型型DNADNA 聚合酶聚合酶（DNA polymerase I DNA polymerase I）。）。n nDNA polymerase I 催化的反应：(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPin nDNADNA聚合反应的两个基本规律：聚合反应的两个基本规律：1.1.所有所有DNADNA聚合酶催化聚合酶催化DNADNA合成均需要模板（合成均需要模板（all all DNA polymerases require a templateDNA polymerases require a template）.2.2.聚合反应需要引物聚合反应需要引物（a primer is requireda primer is required）.n n催化反应的连续性催化反应的连续性（processivityprocessivity）：DNADNA聚合酶不离开模板连续加接一定数量聚合酶不离开模板连续加接一定数量核苷酸的过程称为催化反应的连续性核苷酸的过程称为催化反应的连续性 二二、E.coli的三种的三种DNA聚合酶聚合酶n nDNA polymerase I DNA polymerase I(polpol ，KornbergKornberg酶酶):):1.1.催化的反应：催化的反应：(1)53(1)53的聚合活性的聚合活性;(2)5(2)53 3 外切酶活性：切除引物，切除突变片段。外切酶活性：切除引物，切除突变片段。(3)35(3)35外切酶活性：切除错配的碱基。外切酶活性：切除错配的碱基。2.2.结构及作用：结构及作用：Klenow fragment 3.3.主要功能：主要功能：(1)(1)在在DNADNA复制、重组和修复起修缮工作用（复制、重组和修复起修缮工作用（5353外切酶活性）（外切酶活性）（This enzyme serves a host This enzyme serves a host of“clean-up”functions during replication,of“clean-up”functions during replication,recombination,and repairrecombination,and repair.）(2)2)对复制中的错误进行校读（对复制中的错误进行校读（3535外切酶活性，外切酶活性，5 53 3 聚合酶活性）；聚合酶活性）；n n切口位移作用（切口位移作用（nick nick translationtranslation）:PolPol I I 的的5 5 33 外外切酶活性可切除与模切酶活性可切除与模板链配对的板链配对的 RNARNA 或或 DNADNA 片段片段,并同时用并同时用一条新合成的一条新合成的DNADNA链链取代之。取代之。n nDNADNA聚合酶聚合酶（polpol）1.531.53聚合聚合;2.35 2.35外切。外切。具有高度专一的具有高度专一的DNADNA修复功能修复功能（appears to appears to have a highly specialized DNA repair function have a highly specialized DNA repair function）。n nDNADNA聚合酶聚合酶（polpol ）：）：为为E.coliE.coli的主要复制酶（的主要复制酶（replicasereplicase）。）。1.1.全酶含全酶含1010种亚基种亚基,为不对称二聚体。为不对称二聚体。2.,2.,和和 组成核心酶组成核心酶 （具有具有5353聚合聚合 酶酶活性，活性，具有具有3535外切酶活性和碱基选择功能）外切酶活性和碱基选择功能）。3.3.使核心酶形成二聚体。使核心酶形成二聚体。4.4.构成构成钳钳安装复合物。安装复合物。5.5.核心酶二聚体核心酶二聚体钳钳安装复合物安装复合物*型型DNADNA聚合聚合酶酶（连续连续性低）。性低）。4.4.形成围绕模板链的滑动钳，使酶沿模板链滑动形成围绕模板链的滑动钳，使酶沿模板链滑动防防止酶从模板解离止酶从模板解离连续连续性性。n nE.coliE.coli polpol 的的 两个亚基形成环形钳子围绕两个亚基形成环形钳子围绕DNADNA三、三、DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA合成的精确性合成的精确性1.1.正确和错误核苷酸的区分：正确和错误核苷酸的区分：n n依靠互补碱基正确配对建依靠互补碱基正确配对建立的氢键立的氢键:n n不正确的碱基不能与模板不正确的碱基不能与模板链上的碱基形成正确的氢链上的碱基形成正确的氢键。键。2.2.DNADNA聚合酶在复制延长中对聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能：碱基的选择功能：polpol 的的 亚基亚基。3.3.复制中出错时有即时的校读复制中出错时有即时的校读功能：功能：polpol 的的3535外切酶活性外切酶活性。四、四、DNA复制需要许多酶和蛋白质因子复制需要许多酶和蛋白质因子n nE.coliE.coli的的DNADNA复制需要至少复制需要至少2020个酶和蛋白组成的个酶和蛋白组成的DNADNA复制酶系统或复制体复制酶系统或复制体（the DNA the DNA replicasereplicase system or the system or the replisomereplisome）n n解旋酶解旋酶（helicaseshelicases）n nDNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerasestopoisomerases）n nDNADNA单链结合蛋白（单链结合蛋白（single strand DNA binding single strand DNA binding proteins,SSBproteins,SSB)n n引物酶引物酶（primasesprimases）n nDNADNA连接酶连接酶（DNA DNA ligasesligases）第四节第四节细胞DNA复制的阶段性一、起始（一、起始（initiation）n nE.coliE.coli的复制原点的复制原点orioriC C由由 245 245 bpbp组成：组成：n n有关的酶类与蛋白:n nDnaADnaA蛋白在起始蛋白在起始阶段起关键作用阶段起关键作用（The key componentThe key component in the initiation in the initiation process is the process is the DnaADnaA protein protein）二、延长（二、延长（elongation）n n前导链的合成：前导链的合成：1.1.引物引物（primerprimer）的生成的生成:由引物酶由引物酶（primaseprimase）催化催化 （1 1）细菌：细菌：5010050100ntnt；（2 2）哺乳动物细胞：哺乳动物细胞：1010ntnt。2.2.在在RNA primerRNA primer上由上由 polpol 催化，按催化，按5 35 3 方向，方向，在在primer 3-OHprimer 3-OH端接上相应的核苷酸。端接上相应的核苷酸。n n滞后链的合成：（滞后链的合成：（Synthesis of Okazaki fragments.Synthesis of Okazaki fragments.）n nPolPol IIIIII二聚体对前导链和后随链合成的协调二聚体对前导链和后随链合成的协调.n n后随链后随链RNARNA引物的切除引物的切除 （Removal of RNA Removal of RNA primers in the lagging strand.primers in the lagging strand.）n nDNADNA连接酶的反应机制（连接酶的反应机制（The mechanism of the The mechanism of the DNA DNA ligaseligase reaction reaction）三、终止（三、终止（termination）n n环型环型E.coliE.coli染色体的两个复制叉在终止区相遇。染色体的两个复制叉在终止区相遇。n n终止区含有终止区含有2020bpbp 的的TerTer顺序，在染色体上排列成阻顺序，在染色体上排列成阻止复制叉的陷阱（止复制叉的陷阱（traptrap）：）：TerTer与与TusTus（终点利用物终点利用物质）结合质）结合TusTus-TerTer复合物复合物从一个方向阻止第一从一个方向阻止第一个相遇的复制叉。个相遇的复制叉。n n连环体（连环体（catenanescatenanes)的分的分离：离：由由DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶催化。催化。四、真核细胞四、真核细胞DNA的复制特点的复制特点n n复制原点：为自体复制顺序复制原点：为自体复制顺序（autonomously autonomously replicating replicating sequence,ARSsequence,ARS)或复制子或复制子 1.1501.150bpbp，400400个个ARSARS（酵母细胞染色体）酵母细胞染色体）2.2.原点识别复合物（原点识别复合物（ORCORC）与与ARSARS结合，参与复制结合，参与复制起始。起始。3.3.含多重含多重ARSARS，双向复制。双向复制。n nDNADNA聚合酶：聚合酶：有有、和和 五种。五种。1.1.DNADNA聚合酶聚合酶：4 4亚基亚基 （1 1）有引物酶活性有引物酶活性 （2 2）有聚合酶活性（最大亚基）有聚合酶活性（最大亚基）（3 3）无无3 355外切酶活性外切酶活性 （4 4）可能参与滞后链引物的合成。可能参与滞后链引物的合成。2.2.DNADNA聚合酶聚合酶:参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。3.3.DNADNA聚合酶聚合酶 ：4.4.DNADNA聚合酶聚合酶：2 2亚基亚基 (1)(1)活性与增殖细胞核抗原活性与增殖细胞核抗原（proliferating cell proliferating cell nuclear antigen nuclear antigen，PCNAPCNA）的刺激有关：的刺激有关：PCNAPCNA具具有与有与E.coliE.coli polpol 亚基相似的功能，可形成一环亚基相似的功能，可形成一环形钳子，大大增强形钳子，大大增强DNADNA聚合酶聚合酶 的连续性。的连续性。（2 2）具有具有3535 外切酶活性。外切酶活性。（3 3）为延长子链的主要酶。为延长子链的主要酶。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。5.DNA5.DNA聚合酶聚合酶：参与：参与DNADNA修复，除去冈崎片段修复，除去冈崎片段的的RNARNA引物。引物。n nRFARFA（replication factor Areplication factor A）及及RFCRFC的作用：的作用：1.1.RFARFA：为真核生物的为真核生物的SSBSSB，与与E.coliE.coli的的SSBSSB功能相同。功能相同。2.RFC:2.RFC:促进复制复合物的组装。促进复制复合物的组装。第五节第五节DNA的修复一、突变可导致肿瘤发生一、突变可导致肿瘤发生n n突变（突变（mutationmutation)：DNA DNA核苷酸序列的永久性改变称为突变。核苷酸序列的永久性改变称为突变。1.1.点突变点突变（point mutation)point mutation)：点突变为点突变为DNADNA分子上一个碱基的变异分子上一个碱基的变异,最常见。最常见。2.2.插入或缺失突变插入或缺失突变(insertion or deletion mutations)insertion or deletion mutations)：增加或缺失一个或多个碱基。增加或缺失一个或多个碱基。3.3.沉默突变沉默突变（silent silent mutaionmutaion)：突变发生于非必需突变发生于非必需DNADNA（nonessentianlnonessentianl DNA DNA)或对一个基因的功能的影响是可忽略的。或对一个基因的功能的影响是可忽略的。n n在动物细胞中，突变的积累与癌的发生有强烈的在动物细胞中，突变的积累与癌的发生有强烈的相关性相关性.n n诱变剂的检测诱变剂的检测(Bruce Ames test for carcinogens,Bruce Ames test for carcinogens,based on their based on their mutagenicitymutagenicity):):间皮间皮鼻窦鼻窦氯乙烯氯乙烯氡氡萘胺萘胺已烯雌酚已烯雌酚二乙基二乙基喉喉丙烯腈丙烯腈苯胺衍生物苯胺衍生物石棉石棉镉盐镉盐n n常见诱变剂常见诱变剂:n nE.coliE.coli.的的 修复系统修复系统二、错配修复（二、错配修复（mismatch repair）n n错配修复可提高复制精确性错配修复可提高复制精确性（10102 210103 3）3 3 倍。倍。n n依赖于模板链依赖于模板链（template strandtemplate strand）提供的信息：提供的信息：DamDam甲基化酶使甲基化酶使DNADNA中中GATCGATC顺序的腺嘌呤顺序的腺嘌呤N N6 6甲甲基化基化区分模板链与新链。区分模板链与新链。n nDNADNA的甲基化可作的甲基化可作为区分模板链和新合为区分模板链和新合成链的标志（成链的标志（E.coliE.coli）n n 甲基化指导的错配甲基化指导的错配修复模型（修复模型（A model forA model formethyldirectedmethyldirected mismatch mismatch repairrepair）:n n甲基指导的错配修复的完成甲基指导的错配修复的完成:三、碱基切割修复三、碱基切割修复 （base-excision repair）n nDNADNA糖基化酶糖基化酶（DNA DNA glycosylaseglycosylase ）的作用：的作用：识别识别C C或或A A脱氨基引起的损伤并切除脱氨基引起的损伤并切除无嘌呤或无嘌呤或无嘧啶位点无嘧啶位点(无碱基位点无碱基位点,AP sitesAP sites）n n尿嘧啶糖基化酶：专一作用于尿嘧啶糖基化酶：专一作用于C C脱氨后形成脱氨后形成的的U U（对对RNARNA中的中的U U及及DNADNA的的T T无作用）无作用）n nAPAP内切核酸酶的作用：切割含内切核酸酶的作用：切割含APAP位点的位点的DNADNA链。链。四、核苷酸切割修复四、核苷酸切割修复（nucleotide-excision repair）n n引起引起DNADNA双螺旋严重变形的双螺旋严重变形的DNADNA损伤一般由核苷损伤一般由核苷酸切割系统来修复。酸切割系统来修复。n n在在 E.coliE.coli ，关键酶关键酶 为为ABCABC核酸切割酶核酸切割酶（ABC ABC excinucleaseexcinuclease ），），3 3亚基，为亚基，为uvruvrA A,uvruvrB B,和和uvruvrC C 基基因的表达产物。因的表达产物。五、直接修复（五、直接修复（direct repair）n n环丁烷式嘧啶二聚体的光复活修复环丁烷式嘧啶二聚体的光复活修复:300-500nm光解酶光解酶n nO O6 6-甲基鸟嘌呤的修复甲基鸟嘌呤的修复:1.1.O O6 6-甲基鸟嘌呤与甲基鸟嘌呤与T T配对配对:2.If not repaired,this leads to a G=C to A=T mutation after replication3.修复过程：甲基转移酶六、重组修复与差错倾向修复六、重组修复与差错倾向修复 n n电离辐射或氧化反应电离辐射或氧化反应复制叉处双链断裂，交联复制叉处双链断裂，交联或单链损伤或单链损伤进行重组修复与差错倾向修复进行重组修复与差错倾向修复 。本章要求本章要求n n分子生物学的中心法则n n复制的一般规律n nDNA聚合酶n n复制的节段性n nDNA的修复