生物负载测定课件

生物生物负载测定定1 1精选精选pptppt微生物的定微生物的定义和分和分类 原核原核类：细菌、放菌、放线菌、支原体、菌、支原体、蓝细胞胞 立克次氏体、衣原体立克次氏体、衣原体微生物微生物 真核真核类：真菌：真菌(酵母菌、霉菌）、原生酵母菌、霉菌）、原生动物、物、显微藻微藻类 非非细胞胞类：病毒、：病毒、类病毒、病毒、朊病毒病毒 定定义：一切肉眼看不一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的或看不清楚的微小生物的总称。称。2 2精选精选pptppt细菌菌细胞形胞形态显微微镜检照片照片放大放大10001000倍杆菌倍杆菌放大放大10001000倍球菌倍球菌3 3精选精选pptppt微生物微生物细胞胞结构示意构示意图细菌菌细胞胞结构构图真菌真菌细胞胞结构构图4 4精选精选pptppt微生物的五大共性微生物的五大共性1 1、体、体积小，面小，面积大大 巨大的巨大的营养吸收面、代养吸收面、代谢废物的排泄面和物的排泄面和环境信息的接受面境信息的接受面2 2、吸收多，、吸收多，转化快化快 高速生高速生长的物的物质基基础，活的化工厂，活的化工厂。3 3、生、生产旺，繁殖快旺，繁殖快 大大肠埃希菌埃希菌20min20min分裂分裂1 1次，次，4848小小时后的重量后的重量则达到地球的达到地球的40004000倍。倍。注：因注：因营养条件的限制，养条件的限制，实际不可能不可能发生。生。4 4、适、适应强，易，易变异异 极端极端环境的惊人适境的惊人适应能力能力5 5、分布广，种、分布广，种类多多 空气、水体、土壤、空气、水体、土壤、动植物都有分布，微生物有植物都有分布，微生物有1010多万种。多万种。5 5精选精选pptppt微生物的存在微生物的存在对医医疗器械的影响器械的影响活的微生物活的微生物对灭菌影响菌影响 非非过度度灭菌的工菌的工艺因医因医疗器械上生物器械上生物负载增加，增加，灭菌菌难度加大，可能度加大，可能导致致灭菌失菌失败。活的微生物活的微生物对使用者危害使用者危害 灭菌不菌不彻底的无菌医底的无菌医疗医医疗器械，根据使用方式的不器械，根据使用方式的不同，可能出同，可能出现炎症、菌血症等病理反炎症、菌血症等病理反应。微生物尸体微生物尸体对使用者的危害使用者的危害 典型例子：典型例子：G G-菌菌细胞壁脂多糖成分胞壁脂多糖成分(内毒素内毒素)通通过输液液进入人体血液，致使人体入人体血液，致使人体发热。6 6精选精选pptppt基本概念基本概念生物生物负载的定的定义 一件一件产品和品和/或或无菌屏障无菌屏障上或其中存活的微生物上或其中存活的微生物总数。数。对灭菌来菌来说：生物：生物负载应为无菌屏障内的所有微生物。无菌屏障内的所有微生物。因因为，灭菌需要菌需要杀灭屏障内的所有微生物。屏障内的所有微生物。对使用来使用来说：生物：生物负载应为产品与人体的接触面，因品与人体的接触面，因为屏障通常不与人的自然腔道、血管、肌肉等接触。屏障通常不与人的自然腔道、血管、肌肉等接触。对生生产过程控制来程控制来说：生物：生物负载应是屏障内所有的微是屏障内所有的微生物，反映生物，反映过程的控制水平。程的控制水平。7 7精选精选pptppt基本概念基本概念校正因子校正因子correction factorcorrection factor 用于用于补偿无法从无法从产品和品和/或微生物培养中完全采集的数或微生物培养中完全采集的数值。培养条件培养条件 culture conditionsculture conditions 促促进微生物复微生物复苏、生、生长和和/或繁殖所采用的培养基和培养方式。或繁殖所采用的培养基和培养方式。回收率回收率 recovery efficiency recovery efficiency 用一特定技用一特定技术从从产品上采集和品上采集和/或培养微生物能力的或培养微生物能力的测定定值。样品份品份额（SIPSIP）sample item portion sample item portion 从某一从某一产品品单元上取出的用于元上取出的用于试验的部分的部分。8 8精选精选pptppt产品品选择的基本原的基本原则选择和和处理用于生物理用于生物负载测定的定的产品的程序，品的程序，应能确保所能确保所选产品品对包括包装材料和包括包装材料和过程的常程的常规生生产具有代表性。具有代表性。若若为生物生物负载测定的目的定的目的对产品品进行分行分类，应记录每一分每一分类内包含内包含这一一产品的理由。理由品的理由。理由应包含所包含所选产品在是整个品在是整个分分类里具有代表性的里具有代表性的标准。准。由于生物由于生物负载测定易受定易受时间推推 移的影响而改移的影响而改变，应考考虑生物生物 负载测定的取定的取样时限。限。部分液体部分液体产品可能品可能存在支持微生物生存在支持微生物生长的的现象象9 9精选精选pptpptSIPSIP取取样的基本要求的基本要求如果已如果已验证生物生物负载在本在本产品上或内是均匀分布的，品上或内是均匀分布的，则SIPSIP可以是可以是该产品的任何部分品的任何部分。否否则，样品品应包含能代表所包含能代表所制制产品的每种相品的每种相应材材质而随而随机机选取的取的产品部位。品部位。若已知生物若已知生物负载分布，可以分布，可以从从认为对灭菌工菌工艺最有最有严峻峻挑挑战的的产品部分品部分选择SIPSIP。SIP选择产产品品表面表面积积植入物（不可吸收）植入物（不可吸收）质质量量粉末粉末手手术术服服植入物（可吸收）植入物（可吸收）长长度度管路（直径一致）管路（直径一致）体体积积流体流体1010精选精选pptppt生物生物负载的的测定定1111精选精选pptppt生物生物负载的微生物的微生物鉴定定鉴定的意定的意义 通通过微生物的微生物的鉴定，了解微生物的基本来源，定，了解微生物的基本来源，为日常微生日常微生物的控制提供依据；物的控制提供依据；灭菌工菌工艺的的适合性提供依据（是否的的适合性提供依据（是否存在耐受特定存在耐受特定灭菌因子的芽菌因子的芽孢菌的存在）。菌的存在）。通常通常鉴定的方法定的方法常常规鉴定定：染色特性；染色特性；细胞形胞形态；菌落；菌落；选择性培养的使性培养的使 用；生化特性；用；生化特性；分子水平分子水平鉴定定：DNADNA测序后与序后与数据数据库提供提供遗传序列序列比比对。1212精选精选pptppt生物生物负载测定方法的确定方法的确认若若测定方法中包括采集定方法中包括采集产品上微生物，品上微生物，则对该技技术适当性适当性的的评价；价；确定回收率确定回收率,以便得到修正系数；以便得到修正系数；液体液体类的的产品非常便捷品非常便捷,通常不需要回收率通常不需要回收率.对包括培养条件和微生物包括培养条件和微生物计数技数技术在内的微生物在内的微生物计数适当数适当性的性的评价；价；不是所有的微生物可以通不是所有的微生物可以通过单一培养基能有效培养出来的。一培养基能有效培养出来的。微生物微生物鉴定技定技术适合性的适合性的评价。价。1313精选精选pptppt 常常规测定和数据判定和数据判读确定确定样品大小和取品大小和取样频率。率。测定方法要定方法要规定定,并形成作并形成作业指指导书根据生物根据生物负载的使用目的确定的使用目的确定鉴定的程度定的程度,通常通常鉴定是否存在芽定是否存在芽孢生物生物负载数据用于确定数据用于确定灭菌工菌工艺的的处理程度，理程度，则根据具体要求根据具体要求进行行应满足足灭菌工菌工艺设定、定、验证和常和常规控制特定控制特定标准中准中规定的关于生物定的关于生物负载数据使用的切数据使用的切实可行的要求。可行的要求。规定定医医疗器械上或器械上或屏障内屏障内的生物的生物负载的可接受限量。的可接受限量。中国有中国有GB15980-GB15980-19951995的的标准，但未有明确的国准，但未有明确的国际标准。如果生物准。如果生物负载的信息用于的信息用于设定定灭菌条件，菌条件，则限量比限量比较好好设定。定。根据根据一段一段时间得到的生物得到的生物负载测定数据来确定定数据来确定趋势，进行行趋势管理管理。1414精选精选pptppt生物负载测定方法的维持产品和/或生产过程的改变 通常重新进行回收率的测试或生物负载的测试。生物负载测定方法的改变 应对生物负载测定常规方法的任何变化进行评价。评价测定结果的变化的影响；设 新的回收率。先前进行的确认和回收率是否仍有效。生物负载测定方法的重新确认1515精选精选pptppt重复回收重复回收确定回收率确定回收率重复回收重复回收进行行回收率回收率确确认 使用自然的使用自然的产品，初次采集的微生物数品，初次采集的微生物数值占占连续多次采集多次采集总数数值的比的比值。方法的理方法的理论基基础 生物生物负载的确的确认方法方法应重复重复进行，直到回收的微生物累行，直到回收的微生物累计数量没有明数量没有明显增加。每重复一次后，从增加。每重复一次后，从产品上或品上或产品部分品部分上洗脱液全部回收并上洗脱液全部回收并计数。比数。比较连续回收得到的累回收得到的累计结果。果。注意注意：本方法未必精确。本方法未必精确。产品上回收的微生物数量及品上回收的微生物数量及实际存在的微生存在的微生物数量之物数量之间的确切关系永的确切关系永远无法无法验证。1616精选精选pptppt重复回收重复回收确定回收率确定回收率产品要求 本身具有一定的微生物负载水平，如果产品本身负载水平低，则不适合采用该方法，应采用产品人工接种法。重复采集的次数 准确的重复次数通常取决于 产品特性，构成生物负载的微生物和初始污染水平等。预试验可用于确定重复的次数。在某些产品上，进行重复处理后有必要确定产品上是否还存在存活微生物。这可以通过以下方法实现：用熔化的回收培养基涂在产品表面上，让培养基变硬，然后使产品在规定的培养条件下进行培养形成的菌落计数。将产品浸于液体回收培养基中，在规定的培养条件下，检查是否生长。浸于液体培养基并培养后，若产品中的一小部分出现存活的微生物，可通过MPN方法来计数结果。但是若全部结果都表明有微生物生长，则不能采用MPN法，应重新考虑确认方法。1717精选精选pptppt重复回收的修正系数处处理理产产品数品数123451605070554521012523310200401001琼脂覆盖21210总的菌落计数7364795349第一次处理：6050705545总数：7364795849第一次处理的回收率：82%78%89%95%92%第一次处理后的平均回收率：=87.2%范围=78%95%计算中已包括了琼脂覆盖得到的菌落数。某些医疗器械可能会无法应用琼脂覆盖。运用首次运用首次处处理后平均回收率，理后平均回收率，回收效率的修正系数可回收效率的修正系数可为为：有些有些应用中可使用平均回收率范用中可使用平均回收率范围的最低的最低值，以反，以反应出最坏情况。出最坏情况。这一决定将会影响数据的使用。一决定将会影响数据的使用。1818精选精选pptppt产品接种法品接种法确定回收率确定回收率产品接种法品接种法确定回收率确定回收率 产品上人工接种微生物后，初次采集的微生物数量占 接种到产品上的微生物的比值。可为每一产品计算百分率，并用其确立回收率。产品的要求 产品首先应进行适合的灭菌，并确保可能对微生物有抑制的灭菌介质的有效去除。如用EO灭菌时，则应验证残留水平是否存在对微生物的抑制作用。1919精选精选pptppt产品接种法品接种法确定回收率确定回收率接种的微生物 最常用 需氧菌芽孢接种，因为使用细菌繁殖体时，常因干燥失去活性，所以通常不使用繁殖体。芽孢悬液分布在产品上，应包括最难洗脱 的部位。但应注意为了刻意追求WORST CASE，将芽孢全部接种在最难的位置，导致回收率过低的异常。2020精选精选pptppt接种法的修正系数接种法的修正系数制备悬液稀释液，每0.1mL中含有100个芽孢。向器械所选部分接种0.1mL该稀释悬液，并在单项流状态下干燥。注意接种体积，体积过大不易干燥；体积过小，则分布不均匀。使经接种的产品经受得住所选采集技术，采集的平均芽孢数是35，其范围为2545之间。回收率的修正系数如下：2121精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备袋蠕动 将试验样品和一已知体积的洗脱液装在一个无菌胃型袋中。开动往复式搅棒，使洗脱液贯穿试验样品内外。应规定处理时间。该方法尤其适用于软质、纤维和/或吸附性材料，但可能不适用于能刺破袋的任何材质（如带针或含有坚硬部分的器械）。若使用了较大大量的洗脱液，可能会生成含有低浓度微生物的悬浮液。可使用膜过滤法滤掉洗脱液。2222精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备超声波洗脱 将试验样品浸入装有已知体积洗脱液的适当容器中。将容器连同内装物一起在超声波清洗器中进行处理，或将超声波探头浸入到容器内洗脱液中进行处理。超声波也能使微生物失去活性，尤其是大能量传输时，使用超声波探头会比超声波清洗器更有可能使其失去活性。根据要求应验证超声法。应规定超声处理的常规频率和处理时间。而且，还应规定试验样品在超声波清洗器中的安放位置。应注意限制同时进行处理的试验样品数量，以便阻断超声处理源。该方法尤其适用于不透液体的固体试验样品以及形状复杂的产品。该方法对某些医疗器械可能产生破坏作用，尤其是对带有电子部件的器械，如植入式脉冲发生器。超声处理能量和超声处理持续时间不应太强或太长，以免破坏微生物并导致死亡，或是使洗脱液过热。2323精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备振摇（机械或手工方式）将试验样品浸入装有已知体积洗脱液的适当容器中，并用机械振动器（如往复式、轨道或机械腕摇床）进行振摇。也可用手工振摇，但其效力会因操作人员而异。应规定振摇时间和频率。可以加入一定大小的玻璃微珠增加表面磨损以及由此提高回收效率。加入的玻璃微珠的大小以及振摇时间和频率不能导致过热和/或对微生物造成可能的破坏。增加玻璃微珠将增加微生物可附着的表面积。2424精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备涡旋混合 将试验样品浸入装有已知体积洗脱液的密闭容器内，该容器压在放置在旋涡混合器的旋转垫以形成涡旋。涡旋的形成取决于手动施加的压力。涡旋中的变化会使微生物洗脱产生差异。应规定所用容器、混合时间以及设定的混合器的速度。该方法操作简单快捷，但仅适用于小的试验样品。冲洗 让洗脱液通过试验样品的内腔。可以靠重力或泵来使液体流动。另外也可将洗脱液充入产品中，夹住并抖动。应规定器械与洗脱液的接触时间、冲洗速度及液体体积。器械结构及腔体尺寸会限制从内表面完全移除微生物所必须的冲力。2525精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备搅切（碎裂）将试验样品浸入装有已知体积洗脱液的适当容器内。在规定的一段时间内搅切或振摇试验样品的时间。根据试验样品和搅切器来规定搅切时间，但不应超过会导致洗脱液过热和对微生物造成破坏。该技术提供了将试验样品分成足够小的部分的方法，以便通过接种平板培养技术对微生物进行计数。擦拭 含有吸附性材料的棉拭子通常被固定于杆或把手上。样品材料可以是可溶性的或不可溶性的。通常使用的方法是用洗脱液湿润棉拭子，并用棉拭子擦拭界定好的试验样品的表面。在有些情况下，可以先润湿表面，然后用干棉拭子擦拭，这样可提高回收效率。然后将棉拭子转放至洗脱液中，并搅动从棉拭子上洗脱微生物。另外，若使用的是可溶性棉拭，拭子会溶解到稀释液中。擦拭法是对不规则形状产品或难接近的区域取样的一个有效的方法。该方法也可用于大面积区域的取样。该方法会因擦拭方式的不同而更易出错。而且，通过擦拭不可能将表面上的全部微生物都收集起来。有些微生物会被棉拭子本身吸附，以致于被检测不到。棉拭子中不应含有灭菌剂或抑菌剂。2626精选精选pptppt洗脱液体溶液水中的浓度应用缓冲蛋白胨水0.067 mol/L磷酸盐；0.43%氯化钠；0.1%蛋白胨；通用六偏磷酸钠林格氏溶液 1/4 强度溶解海藻酸钙拭子蛋白胨水 0.1%1.0%通用磷酸盐缓冲溶液0.02 mol/L磷酸盐；0.9%氯化钠；通用林格氏溶液1/4 强度通用氯化钠0.25%0.9%通用硫代硫酸盐林格氏溶液1/4 强度中和余氯水稀释含水样品；计数前制备可溶材料的等渗压溶液；%此表并未包括全部。表面活性剂，如聚山梨醇酯（Tween）80可以添加到洗脱液和稀释液中。根据具体的应用，通常浓度在0.01%0.1%之间。应使用适当浓度的表面活性剂，并加以特殊处理以防止泡沫形成。2727精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备接触板 接触板或玻璃片可用凝固的培养基放在样品表面上，使存活的微生物能附着到该培养基的表面，然后再培养接触板或玻璃片，至形成可计数的菌落。该方法优点在于使用方便。结果与凝固培养基的接触表面直接相关。表面上自然集聚的细胞群、菌落在琼脂表面散布、琼脂干燥、可能存在厌氧菌等都是潜在的不利因素。由于该方法的回收率通常较低，所以只有在其它方法不适用的情况下才使用。接触板和玻璃片通常只适用于平的或规则的表面。琼脂覆盖 当生物负载低以及产品构造适合时，在产品的表面涂上熔化的琼脂培养基（最高温度在45），培养至产生可见菌落。表面上自然集聚的细胞群、菌落在琼脂表面散布、琼脂干燥、可能存在厌氧菌等都是潜在的不利因素。2828精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备最大可能数（MPN法）MPN法是一种沿用已久并有充分文献根据，用于估算在产品内随机分布的存活微生物数量的方法。它主要用于食品和水产品等行业（与液体、粉末和半固体的产品或者原材料一起使用）。这种方法尤其适用于生物负载平均数低的产品。这种方法包括（按体积或者重量）对产品进行重复取样，其中每次取样的样品中均含有相同数量的可存活微生物（因而要求分布的随机性），然后通过将样品转到液体培养基并培养，单独记下有可存活微生物存在的每个样品。当具有足量的洗脱液，可将其一系列的稀释液接种于营养培养基中，使部分接种的培养基在随后的培养中不产生可见生长。用表现出生长的稀释度，估算出样品中或产品取样的绝大部分中存在的存活微生物的数量；关于此估算值，95%的可信区间是相对宽的。该估算和其置信界限来自MPN表格（DeMan18），此表是在一定的假设条件下编制的，即根据泊松分布原理，重复取样样品中存在的可存活微生物的数量是围绕一个平均数量分布的。MPN方法应用的关键要求是微生物总数在整个（研究中的）产品上随机分布。因此，对于液体用的医疗器械、黏性液体、粉末，或在单一产品使用如洗脱液等液体估算生物负载的情况下，MPN方法可以有生物负载测定值。但是，这种方法并不普遍适用于在固体医疗器械上的生物负载测定。典型的情况是，在这些器械上构成低平均值生物负载的若干微生物的分布通常是随机的，一个总数的微生物总是有高比例的不可检测的有机物和少量的带“峰值”的微生物（实质构成平均值生物负载）。在MPN的应用中，“峰值”将会被简单地记录为一个正值，因而，只以公式化的方式构成此平均值，而不是用数字表示。这可能导致对生物负载估计过低，而得出一个不符合要求的结果。MPN法易于操作，并且该方法是基于统计学，所以它更适用于一般性评估而不是精确测定。2929精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备膜过滤法洗脱液过滤后，将滤器放到适宜的培养基上进行培养，形成可见菌落，是对存活微生物计数的一种有效方法。通常，孔径不大于0.45的过滤器适于采集微生物。对含有类似纤维状产品残留物等微粒的洗脱液进行膜过滤可能比较困难，因微粒会阻塞过滤器。膜过滤法更适用于微生物浓度较低的悬液。3030精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备平板倾注 使用平板倾注技术，将一定量的悬浮液在在约45的温度与融化的琼脂相混合，然后倾注到平板放至凝固。对平板进行培养至菌落形成并进行计数。平板涂抹 平板涂抹技术是用涂抹器将一定量悬液涂在固体营养基表面。螺旋涂板 螺旋涂板技术运用自动装置将一定量微生物悬液涂在固体培养基表面上。悬液涂抹是以递减的速度从培养板中心以螺旋线轨迹向周边运动。经过培养后，对全板或部分板，运用专用的计数栅和计数技术来统计原始悬液中的存活微生物数量。3131精选精选pptppt微生物采集技微生物采集技术和和设备检测微生物的其它方法 估计生物负载时还可使用菌落计算以外的其他方法。这包括测定新陈代谢物的活性（例如：新陈代谢物测定或落射表面荧光）。这些方法称为“间接法”，为了建立起与以往确定的存活微生物数量的关系，它们必须对照菌落计数进行校准。这些技术的一个主要限制就是需要相对较高的微生物数悬浮在样品洗脱液中。一般来说，所检测到的微生物数量的下限超过100 CFU。3232精选精选pptppt微生物鉴定（一）微生物微生物鉴定的方式和意定的方式和意义方式方式 形态鉴定、培养及生理特征、生化特征、核酸特征鉴定 数值鉴定和自动鉴定意意义 从鉴别污染微生物可了解洁净室清洁，消毒步骤的效性，特别是对消毒剂有效性评估有所帮助。微生物鉴别的结果也对调查污染的来源有参考价值。3333精选精选pptppt常用的微生物操作技术接种：将含有或可能含有微生物的样品或培养物，种入培养基的技术方法。斜面培养基接种法、半固体培养基接种法、液体培养基接种法、平板培养基接种法。分离：使用一定的分离技术，将混杂存在的微生物尽可能在培养基中分开并且生长，从而获得单一的一种菌株的方法。划线分离法、涂布分离法、倾注分离法培养：通常接种后的培养基都要在适宜的环境中条件下进行培养。主要是温度、湿度、培养时间，特别是氧气和二氧化碳的需求。需氧培养法、厌氧培养法、微需氧培养法、二氧化碳培养法3434精选精选pptppt常用的微生物操作技术染色：原因：微生物细胞含水量一般为80%90%，菌细胞对光的吸收和反射与水溶液相近，在光学显微镜下，菌体透明，与背景几乎无差别，故常借助染色使菌体吸着染料产生与背景较明显的差别。常用细菌染色法单染色法：仅使用一种染料，只能观察形态和排列复染色法：革兰染色法，可将全部细菌分成2类，革兰阳性菌、革兰阴性菌。芽孢染色法：很有用的一种染色法，因为芽孢对灭菌的压力比较大，存在灭菌失败的风险特别是根据生物负载设定么军参数的方法。鞭毛染色法3535精选精选pptppt微生物鉴定（二）核酸特征核酸特征鉴定之一定之一16SrRNA16SrRNA序列分析序列分析 基本步基本步骤：DNA提取PCR扩增 凝胶成像检测琼脂糖凝胶电泳回收 序列分析数据库比对3636精选精选pptppt微生物鉴定（三）16SrRNA 16SrRNA序列分析的注意事序列分析的注意事项引物的引物的选择PCRPCR条件的条件的设定定3737精选精选pptppt此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！