免疫磁珠技术主题讲座ppt课件

目录目录1 1 免疫磁珠技术简介免疫磁珠技术简介1.1 免疫磁珠的结构与性质1.2 免疫磁珠技术2 2 免疫磁珠技术的应用免疫磁珠技术的应用2.1 IMB技术在食品有害微生物检测中的应用2.2 免疫磁珠与其它检测手段的联用2.3 免疫磁珠技术在其他领域的应用2.4 免疫磁珠技术的优缺点及发展方向目目录录1免疫磁珠技免疫磁珠技术简术简介介11.免疫磁珠技术简介免疫磁珠技术简介1.1免疫磁珠的结构与性质免疫磁珠的结构与性质1.1.1免疫磁珠的结构免疫磁珠的结构免疫磁珠（免疫磁珠（IMB），），也称免疫磁性微球，也称免疫磁性微球，是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，基本上由载体微球和免疫配基结合而成。其核心为顺基本上由载体微球和免疫配基结合而成。其核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子料，磁性粒子，核心外层包裹一层高分子料，最外层是最外层是免疫配基。免疫配基。1.免疫磁珠技免疫磁珠技术简术简介介1.1免疫磁珠的免疫磁珠的结结构与性构与性质质2载体微球载体微球载体微球载体微球功能基功能基高分子层高分子层磁性物质磁性物质金属小颗粒（金属小颗粒（Fe2O3、Fe3O4）如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸、酶类、多糖（淀粉、烯脂、聚丙烯酸、酶类、多糖（淀粉、纤维素、葡聚糖、果胶等）、球蛋白纤维素、葡聚糖、果胶等）、球蛋白和牛血清白蛋白等，和牛血清白蛋白等，如氨基如氨基(-NH2)、羧基、羧基(-COOH)、羟基羟基(-OH)，使其表现具有疏水，使其表现具有疏水-亲亲水、非极性水、非极性-极性、带正电荷极性、带正电荷-带负带负电荷等不同的物理性质。电荷等不同的物理性质。载载体微球体微球载载体微球功能基高分子体微球功能基高分子层层磁性物磁性物质质金属小金属小颗颗粒（粒（Fe2O33免疫配基免疫配基免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其表现出的物理性球制备材料和方法不同，其表现出的物理性质也不同，质也不同，从而可结合不同的免疫配基，从而可结合不同的免疫配基，如如抗原、抗体、凝集素、抗原、抗体、凝集素、DNA和和RNA等。配等。配基必须具有生物专一性的特点，基必须具有生物专一性的特点，而且载体微而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有的生球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性，物学特性，保证磁珠的特殊识别功能。保证磁珠的特殊识别功能。免疫配基免疫配基通免疫配基免疫配基通过过生物高分子的功能基生物高分子的功能基团结团结合到磁性合到磁性载载体微球上体微球上41.1.2 1.1.2 免疫磁珠的性质免疫磁珠的性质由于免疫磁珠的大小和形状具有均一性，由于免疫磁珠的大小和形状具有均一性，从而可使从而可使靶物质迅速和有效地结合到磁珠上，也可使生成的新靶物质迅速和有效地结合到磁珠上，也可使生成的新复合物在磁场中具有相同的磁响应性，且行为一致复合物在磁场中具有相同的磁响应性，且行为一致磁珠的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非特磁珠的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非特异性结合异性结合顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，动，从磁场移出时磁性消除，从磁场移出时磁性消除，磁珠分散，磁珠分散，由此可方由此可方便地进行分离和磁性导向便地进行分离和磁性导向保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀；保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀；免疫配基可特异性地结合反应体系中相应的抗原、抗免疫配基可特异性地结合反应体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质。体、核酸等生物活性物质。1.1.2免疫磁珠的性免疫磁珠的性质质由于免疫磁珠的大小和形状具有均一由于免疫磁珠的大小和形状具有均一51.2 1.2 免疫磁珠技术免疫磁珠技术免疫磁珠免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)技术：技术：是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。基本原理：基本原理：磁性微球经过一定处理后,可将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗体与特异性抗原结合形成抗原微球复合物,该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。1.2免疫磁珠技免疫磁珠技术术免疫磁珠免疫磁珠(immunomagneti6以细胞分离为例图解免疫磁珠技术的原理以细胞分离为例图解免疫磁珠技术的原理以细胞分离为例图解免疫磁珠技术的原理以细胞分离为例图解免疫磁珠技术的原理以以细细胞分离胞分离为为例例图图解免疫磁珠技解免疫磁珠技术术的原理的原理72.1食品有害微生物检测中的应用食品有害微生物检测中的应用免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有显著的免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有显著的优点，它能从样品中优点，它能从样品中迅速、有选择性地分离出迅速、有选择性地分离出目的微生物，有效地减少了背景的干扰，提高目的微生物，有效地减少了背景的干扰，提高了精准性。了精准性。还能还能捕获受损伤的靶细菌捕获受损伤的靶细菌，而目前所用的几种而目前所用的几种常规方法则不具备这样的能力。目前，免疫磁常规方法则不具备这样的能力。目前，免疫磁珠技术已经广泛应用于食品样品中致病微生物珠技术已经广泛应用于食品样品中致病微生物的检测。的检测。2.2.免疫磁珠技术的应用免疫磁珠技术的应用2.1食品有害微生物食品有害微生物检测检测中的中的应应用免疫磁珠技用免疫磁珠技术术与常与常规检验规检验方法方法82.1.1 2.1.1 大肠杆菌大肠杆菌O157O157的检测的检测 传统分离传统分离E.coli O157 H7所采用的直接分离所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。工作量大等缺点。采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样品中分离富集品中分离富集E.coli O157 H7，满足流行病学，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。的研究要求和提高控制力度。现在这种免疫磁珠现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也已将免疫磁珠法已将免疫磁珠法对大肠杆菌对大肠杆菌O157的检测纳入的检测纳入国家标准国家标准（GB/T4789.36-2008）和和出入境检出入境检验检疫行业标准验检疫行业标准(SN/T1059.5-2006)。2.1.1大大肠肠杆菌杆菌O157的的检测检测传统传统分离分离E.coli9检样检样25g(mL)+225mL改良改良EC肉汤（肉汤（mEC+n），均质），均质225mL免疫磁珠捕获免疫磁珠捕获涂布涂布CT-SMAC平板和改良平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板弧菌显色琼脂平板挑取可疑菌落挑取可疑菌落5个个10个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TSIMUG-LST阳性阳性GB/T 4789.36-2008 GB/T 4789.36-2008 免疫磁珠捕获法检测程序免疫磁珠捕获法检测程序阴性阴性血清学试验血清学试验非非O157细菌细菌生化试验生化试验报告报告361oC18h24h361oC361oC18h24h18h24h10增菌增菌免疫磁珠捕获与分离免疫磁珠捕获与分离1.将将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用个样品使用1支支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。管，然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每支后，用开盖器打开每支Eppendorff管的盖子，每管管的盖子，每管加人加人20LE.coli0157免疫磁珠悬液。免疫磁珠悬液。2.取取mEC+n肉汤增菌培养物肉汤增菌培养物1mL，加人到，加人到Eppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每个样品更换每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染开进行，避免交叉污染。具体操作步骤具体操作步骤增菌增菌具体具体113.结合结合:在在1830环境中，将上述环境中，将上述Eppendorff管管连同磁板架放在连同磁板架放在DynalMXl样品混合器上转动或用手样品混合器上转动或用手轻微转轻微转10min，使，使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。与免疫磁珠充分接触。4.捕获捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3min内内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。5.吸取上清液吸取上清液:取取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到到Eppendorff管中，并重复管中，并重复4步骤。每个样品换用步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。支无菌加长吸管。3.结结合合:在在1830环环境中，将上述境中，将上述Eppendo126.洗涤洗涤:洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤46。7.重复上述步骤重复上述步骤45。8.免疫磁珠悬浮免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在将免疫磁珠重新悬浮在100LPBS-Tween20洗液中。洗液中。9.涂布平板涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取样器各取50L免疫磁珠悬液分别转移至免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板一弧菌显色琼脂平板一侧，然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，侧，然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于完全吸收后，翻转平板，于36士士10培养培养18h-24h。6.洗洗涤涤:洗洗涤涤免疫磁珠混合物。重复上述步免疫磁珠混合物。重复上述步骤骤4613菌落识别菌落识别在在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的发酵山梨醇的菌落为红色菌落为红色;在改在改CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板上为圆弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。形、较小的菌落，中心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。初步生化试验初步生化试验:在在CT-SMAC和改良和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平弧菌显色琼脂平板上挑取板上挑取5个个10个典型或可疑菌落，分别接种个典型或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时琼脂，同时接种接种MUG-LST肉汤，于肉汤，于36士士1培养培养18h24h。必要时进。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。置。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳性结果，有荧光产生者为阴性结果者为阳性结果，有荧光产生者为阴性结果;对分解乳糖且无荧光对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36士士1培养培养18h24h，并进行鉴定。，并进行鉴定。菌落菌落识别识别14大肠杆菌大肠杆菌O157O157的检测的检测FratamicoFratamico等将兔抗等将兔抗E.coli O157 H7多克隆抗体连多克隆抗体连接到羊抗兔接到羊抗兔IgGIgG包被的磁珠上，从食物增菌培养包被的磁珠上，从食物增菌培养液中分离液中分离O157H7O157H7菌株，再将带菌的磁珠接种到菌株，再将带菌的磁珠接种到培养基上，加入荧光素标记的培养基上，加入荧光素标记的O157H7O157H7抗血清，抗血清，在荧光显微镜下观察，此法敏感性为在荧光显微镜下观察，此法敏感性为10cfu/mL10cfu/mL增增菌培养液。菌培养液。DecoryDecory等建立了免疫磁珠等建立了免疫磁珠-免疫脂质体免疫脂质体（IMB/ILIMB/IL）荧光试验方法，可在）荧光试验方法，可在8h8h内快速检测出内快速检测出多种液态样品（水样、苹果汁、苹果酒）中低至多种液态样品（水样、苹果汁、苹果酒）中低至1cfu/mL1cfu/mL的的E.coli O157 H7，而传统微生物学方而传统微生物学方法不能从阴性样本中区分出法不能从阴性样本中区分出E.coli O157 H7感染感染样本。样本。大大肠肠杆菌杆菌O157的的检测检测Fratamico等将兔抗等将兔抗E.coli152.1.2 2.1.2 单核细胞增生李斯特菌的检测单核细胞增生李斯特菌的检测 传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约约5 514d14d，步骤繁琐且灵敏度低，而，步骤繁琐且灵敏度低，而IMBIMB技术技术的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。2008年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行业标准中业标准中(SN/T0184.3-2008)。2.1.2单单核核细细胞增生李斯特菌的胞增生李斯特菌的检测检测传统传统的的单单增李斯特菌增李斯特菌16检样检样25g(mL)对对225mLFB1増菌液（増菌液（3030士士1，24h24h士士1h1h）1mL转种转种10mLFB2増菌液（増菌液（35 35，24h24h士士1h1h）通过免疫磁珠捕获李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤通过免疫磁珠捕获李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤用用0.1mL的灭菌缓冲液重新制成悬液的灭菌缓冲液重新制成悬液吸取吸取50uL免疫磁珠悬液划线于免疫磁珠悬液划线于CHROMagar显色培养基，显色培养基，OXA/PALCAM琼脂平板（琼脂平板（35+1,24h28h)各挑选各挑选5个典型菌落个典型菌落接种于接种于TSA-YE琼脂平板，纯培养琼脂平板，纯培养鉴定和确认试验鉴定和确认试验单增李斯特菌的检测方法单增李斯特菌的检测方法检样检样25g(mL)对对225mLFB1増菌液増菌液171样品制备样品制备2增菌增菌3免疫磁珠分离免疫磁珠分离(IMS）1)免疫捕获免疫捕获混增菌培养液混增菌培养液.沉淀所有的粗糙食物残渣沉淀所有的粗糙食物残渣.从增菌培从增菌培养液中移取养液中移取1mL上层液体上层液体(要尽可能避免移取到食物要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒颗粒和脂肪颗粒)加人加人Eppendorf管中管中.加加20L准备好准备好的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液。1样样品制品制备备182）分离）分离将将Eppendorf管固定在磁架的管孔中。管固定在磁架的管孔中。1800轻缓摆动轻缓摆动磁架磁架5次次-6次次,使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上的上的Eppendorf管管盖管管盖,从磁极对面一侧慢慢吸出液体，从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠。每一个样品换一次枪头注意不要接触管壁上的磁珠。每一个样品换一次枪头;加加1mI灭菌的灭菌的PBS，并重新盖好盖子，并重新盖好盖子.将磁极从支架上将磁极从支架上移走，移走，1800轻缓摆动磁架轻缓摆动磁架5次一次一6次次,使管内各成分混合使管内各成分混合,后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开离心管从磁性分离器上移开.并加并加100L灭菌的灭菌的PBS到管到管中，重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器中，重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器.，可以用，可以用手摇代替手摇代替.4.分离培养分离培养1）分离培养）分离培养2）分离）分离将将Eppendorf管固定在磁架管固定在磁架19吸取吸取50L免疫磁珠悬液免疫磁珠悬液.加到显色培养基及任加到显色培养基及任一选择性培养基一选择性培养基OXA、PALCAM琼脂平板上琼脂平板上.用无菌用无菌接种环划线接种环划线.35士士1培养培养22h-48h。2）筛选）筛选李斯特氏菌在李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为蓝显色培养基上菌落为蓝色色.且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在OXA琼琼脂平板上生长脂平板上生长22h后菌落呈现黑色后菌落呈现黑色.直径为直径为1mm.在其在其周围形成一个黑色环。培养周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍呈黑色，菌落仍呈黑色.直径直径2mm-3mm.除在菌落周围有一环外除在菌落周围有一环外.在菌落中心部在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂琼脂平板上与在平板上与在()XA琼脂平板上菌落相似。在琼脂平板上菌落相似。在CHROMagar显色培养基及显色培养基及OXA或或PALCAM琼脂平琼脂平板上挑取板上挑取5个或更多可疑菌落个或更多可疑菌落.接种于接种于TSA-YE琼脂平琼脂平板上板上.纯培养后进鉴定。纯培养后进鉴定。5.鉴定和确认鉴定和确认吸取吸取50L免疫磁珠免疫磁珠悬悬液液.加到加到显显色培养基及任一色培养基及任一20单核细胞增生李斯特氏菌的检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测 Skjerve Skjerve等通过包被单克隆抗体的磁珠从等通过包被单克隆抗体的磁珠从不同食物样品中分离李斯特菌，采用将磁不同食物样品中分离李斯特菌，采用将磁珠接种到琼脂平板培养的方法进行菌株鉴珠接种到琼脂平板培养的方法进行菌株鉴定，此法的敏感性为定，此法的敏感性为10102 210104 4cfu/mLcfu/mL样品。样品。HudsonHudson等研究表明，将免疫磁珠技术与等研究表明，将免疫磁珠技术与PCRPCR结合，结合，24h24h内即可检出火腿中的单增李斯特内即可检出火腿中的单增李斯特菌。菌。单单核核细细胞增生李斯特氏菌的胞增生李斯特氏菌的检测检测Skjerve等通等通过过包被包被单单克克212.1.3 2.1.3 沙门氏菌的检测沙门氏菌的检测例例1：Notzon等用等用IMB-荧光荧光PCR检测肉类中的检测肉类中的沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠分离、分离、DNA提取及提取及PCR扩增，扩增，1213h即可完即可完成检测过程，成检测过程，IMB-荧光荧光PCR在检测自然感染肉在检测自然感染肉类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异性。性。例例2：Blackburn等将用生物素标记的抗沙门等将用生物素标记的抗沙门菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙门菌。此法的敏感性可达门菌。此法的敏感性可达105cfu/g 食物，总的食物，总的检测时间从检测时间从5d减少至减少至12d。2.1.3沙沙门门氏菌的氏菌的检测检测例例1：Notzon等用等用IMB-荧荧光光22IMBIMB技术的优点技术的优点IMB技术适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快技术适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快速检测，能速检测，能快速有效富集快速有效富集食品基质中的食品基质中的目标病原目标病原菌菌，且有良好的，且有良好的灵敏度和特异性灵敏度和特异性，检测限可达到，检测限可达到110cfu/25g;在检测时间方面可将常规检测方在检测时间方面可将常规检测方法中的法中的72小时检测周期缩短至小时检测周期缩短至40小时，而且能小时，而且能有效减轻过程交叉污染有效减轻过程交叉污染;筛选结果既可以与常规筛选结果既可以与常规的细菌生化和血清学联用，也可以和显色培养基、的细菌生化和血清学联用，也可以和显色培养基、荧光荧光PCR以及微生物全自动鉴定仪器等方法联用，以及微生物全自动鉴定仪器等方法联用，为食源性致病菌的检测和鉴定提供了有效的快速为食源性致病菌的检测和鉴定提供了有效的快速筛选技术筛选技术。IMB技技术术的的优优点点IMB技技术术适用于各适用于各类类食品基食品基质质中的沙中的沙门门氏菌的快氏菌的快232.1.4 2.1.4 金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测例例1 1：陈伶俐等将人陈伶俐等将人IgG结合到磁珠上，用该磁结合到磁珠上，用该磁珠对样品中的金黄葡萄球菌进行了快速分离检验。珠对样品中的金黄葡萄球菌进行了快速分离检验。取适量免疫磁珠，加入金黄葡萄球菌菌液中，磁取适量免疫磁珠，加入金黄葡萄球菌菌液中，磁场下分离磁珠，将分离前后的菌液及磁珠涂平板，场下分离磁珠，将分离前后的菌液及磁珠涂平板，并用大肠杆菌、白葡萄球菌等作对照。结果用此并用大肠杆菌、白葡萄球菌等作对照。结果用此磁珠分离后，只有金黄葡萄球菌的浓度有明显的磁珠分离后，只有金黄葡萄球菌的浓度有明显的降低。对磁珠所涂平板的菌落进行鉴定，证明为降低。对磁珠所涂平板的菌落进行鉴定，证明为金黄葡萄球菌。应用此法分离检验此菌，富集速金黄葡萄球菌。应用此法分离检验此菌，富集速度快，灵敏度高，效果好。度快，灵敏度高，效果好。例例2 2：刘琳琳利用自制的金属螯合免疫磁珠来检刘琳琳利用自制的金属螯合免疫磁珠来检测食品中金黄色葡萄球菌，该法能够在测食品中金黄色葡萄球菌，该法能够在30min内内富集检测金黄色葡萄球菌且检测低限可达富集检测金黄色葡萄球菌且检测低限可达100CFU，同时磁珠可保持活性达，同时磁珠可保持活性达3周以上。周以上。2.1.4金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌的检测检测例例1：陈陈伶俐等将人伶俐等将人IgG结结合合242.1.5 2.1.5 副溶血性弧菌的检测副溶血性弧菌的检测Hara-Kudo等利用等利用IMS和显色培养基分离贝类和显色培养基分离贝类中产中产TDH的副溶血性弧菌的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利等利用副溶血性弧菌用副溶血性弧菌ATCC17802制备针对极鞭毛制备针对极鞭毛的单克隆抗体的单克隆抗体,这将有益于快速检测从环境来源这将有益于快速检测从环境来源的副溶血性弧菌。张凡非等利用的副溶血性弧菌。张凡非等利用IMS分离环境分离环境及食品中产生及食品中产生TDH副溶血性弧菌，分别从副溶血性弧菌，分别从1份份海水、海水、1份海泥和份海泥和3份蛤肉中检出了神奈川现象阳份蛤肉中检出了神奈川现象阳性性,并产生耐热溶血毒素的副溶血性弧菌并产生耐热溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型血清型为为03:K6。2.1.5副溶血性弧菌的副溶血性弧菌的检测检测Hara-Kudo等利用等利用IMS25IMBIMB技术优点技术优点该方法与一般的细菌培养分离法相比该方法与一般的细菌培养分离法相比,极大地极大地提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率。利用的检出率。利用IMS可有效地吸附、浓缩大量可有效地吸附、浓缩大量样品中的少量病原微生物样品中的少量病原微生物,IMS为难于从环境及为难于从环境及食品中分离病原性副溶血性弧菌的问题提供一食品中分离病原性副溶血性弧菌的问题提供一种有效手段。种有效手段。IMB技技术优术优点点该该方法与一般的方法与一般的细细菌培养分离法相比菌培养分离法相比,极大地提高极大地提高262.1.6 2.1.6 其他致病菌的检测其他致病菌的检测志贺氏菌志贺氏菌例：例：IslamIslam等应用等应用O O抗原特异性单克隆抗体包被抗原特异性单克隆抗体包被免疫磁珠，快速检测粪便中的疾痢志贺菌和福免疫磁珠，快速检测粪便中的疾痢志贺菌和福氏志贺菌。分离出的志贺菌株用氏志贺菌。分离出的志贺菌株用PCRPCR扩增方法进扩增方法进行鉴定。此种免疫磁珠分离与行鉴定。此种免疫磁珠分离与PCRPCR联合法检测志联合法检测志贺菌，较传统的培养法敏感、快速贺菌，较传统的培养法敏感、快速(7 h)(7 h)。小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌例：例：KapperudKapperud等用抗小肠结肠炎耶尔森氏菌血等用抗小肠结肠炎耶尔森氏菌血清抗体包被磁性微球，从食物和水样中分离，清抗体包被磁性微球，从食物和水样中分离，并能将小肠结肠炎耶尔森氏菌与假结核耶尔森并能将小肠结肠炎耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌和非致病性耶尔森氏菌区别开来。氏菌和非致病性耶尔森氏菌区别开来。2.1.6其他致病菌的其他致病菌的检测检测志志贺贺氏菌小氏菌小肠结肠肠结肠炎耶炎耶尔尔森氏菌森氏菌272.22.2免疫磁珠与其它检测手段的联用免疫磁珠与其它检测手段的联用2.2.1 2.2.1 免疫磁珠与免疫磁珠与PCRPCR的联用的联用 鉴于鉴于PCR PCR 技术灵敏度较低这一缺点，将免疫磁珠技术灵敏度较低这一缺点，将免疫磁珠技术和技术和PCR PCR 技术相结合，建立了新的检测系统技术相结合，建立了新的检测系统 磁免疫磁免疫PCRPCR。例如：它以李斯特氏菌单抗包被磁珠，。例如：它以李斯特氏菌单抗包被磁珠，对样品进行前处理，将菌进行富集裂解，再以对样品进行前处理，将菌进行富集裂解，再以iap iap 基基因的保守区域设计因的保守区域设计引物进行引物进行PCRPCR结果显示该方法具有结果显示该方法具有良好的特异性，而且十分灵敏。良好的特异性，而且十分灵敏。2.2免疫磁珠与其它免疫磁珠与其它检测检测手段的手段的联联用用2.2.1免疫磁珠与免疫磁珠与P282.2.2 2.2.2 免疫磁珠与免疫磁珠与ELISAELISA的联用的联用利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgG抗体致抗体致敏，制备特异性捕获甘草特征蛋白的免疫磁性微球。敏，制备特异性捕获甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体，结合辣根过氧化物酶以生物素标记抗体为示踪抗体，结合辣根过氧化物酶标亲和素建立标亲和素建立ELISA检测系统，用于甘草药材和含甘检测系统，用于甘草药材和含甘草中成药中甘草蛋白的分析。结果草中成药中甘草蛋白的分析。结果 用该方法对甘草药用该方法对甘草药材和中成药中甘草蛋白抗原检测，检测灵敏度材和中成药中甘草蛋白抗原检测，检测灵敏度10ngmL。免疫磁性捕获。免疫磁性捕获ELISA检测技术方便、快速、检测技术方便、快速、准确，为生药的品种鉴定及中成药的质量控制提供一准确，为生药的品种鉴定及中成药的质量控制提供一种新方法种新方法。2.2.2免疫磁珠与免疫磁珠与ELISA的的联联用用292.2.3 2.2.3 免疫磁珠与发光检测手段的联用免疫磁珠与发光检测手段的联用 发光手段分析包括荧光免疫分析、电化学发光分析发光手段分析包括荧光免疫分析、电化学发光分析等。等。免疫磁珠荧光微球免疫磁珠荧光微球2.2.3免疫磁珠与免疫磁珠与发发光光检测检测手段的手段的联联用用免疫磁珠免疫磁珠荧荧光微球光微球302.3 IMB2.3 IMB技术在其他领域中的应用技术在其他领域中的应用2.3.12.3.1免疫检测免疫检测 IMB IMB技术不仅应用于食品中有害微生物的检测，它技术不仅应用于食品中有害微生物的检测，它在医学领域也有广阔的应用前景，它可以检测肿瘤细在医学领域也有广阔的应用前景，它可以检测肿瘤细胞，如骨髓中肿瘤细胞的检测和淋巴结中肿瘤细胞的胞，如骨髓中肿瘤细胞的检测和淋巴结中肿瘤细胞的检测。另外这种技术还可以对肿瘤进行磁导向治疗和检测。另外这种技术还可以对肿瘤进行磁导向治疗和免疫磁性净化治疗。免疫磁性净化治疗。2.3IMB技技术术在其他在其他领领域中的域中的应应用用2.3.1免疫免疫检测检测312.3.2 2.3.2 细胞分离细胞分离细胞分离是免疫磁珠目前应用最主要的一个方面，传细胞分离是免疫磁珠目前应用最主要的一个方面，传统细胞分离技术有的比较费时，有的十分昂贵，由于统细胞分离技术有的比较费时，有的十分昂贵，由于免疫磁珠技术分离细胞时只需要抗体和磁铁，既简便免疫磁珠技术分离细胞时只需要抗体和磁铁，既简便灵敏又经济快捷。灵敏又经济快捷。分离细胞有两种方式，用免疫磁珠直接从细胞混合液分离细胞有两种方式，用免疫磁珠直接从细胞混合液中分离靶细胞的方法称为中分离靶细胞的方法称为阳性分离阳性分离，用免疫磁珠去除用免疫磁珠去除无关细胞使靶细胞得以纯化的方法称为无关细胞使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离阴性分离。马东初用马东初用GPb/a血小板单克隆抗体结合磁珠分离血小板单克隆抗体结合磁珠分离人骨中的巨核细胞，其纯度达到人骨中的巨核细胞，其纯度达到87.5%到到97.1%，且，且50%的巨核细胞具有生物活性，且磁珠分离的巨核细的巨核细胞具有生物活性，且磁珠分离的巨核细胞超微结构保持完整，可用于巨核细胞的细胞生物学胞超微结构保持完整，可用于巨核细胞的细胞生物学和分子生物学等方面的研究。和分子生物学等方面的研究。2.3.2细细胞分离胞分离细细胞分离是免疫磁珠目前胞分离是免疫磁珠目前应应用最主要的一个方用最主要的一个方322.3.3 2.3.3 生物大分子纯化生物大分子纯化 免疫磁珠可以看作是亲和层析技术中的微型配基，免疫磁珠可以看作是亲和层析技术中的微型配基，体，在基质上固相化抗体或抗原后，形成特异性吸体，在基质上固相化抗体或抗原后，形成特异性吸附后，再进行磁性亲和抽屉不需离心过滤，用于分附后，再进行磁性亲和抽屉不需离心过滤，用于分离和纯化相应的生物大分子。为提纯受体分子、离和纯化相应的生物大分子。为提纯受体分子、DNA、RNA、DNA结合蛋白及结合蛋白及mRNA等提供希望。等提供希望。2.3.3生物大分子生物大分子纯纯化化免疫磁珠可以看作是免疫磁珠可以看作是亲亲和和层层析技析技332.3.4 2.3.4 分子生物学的应用分子生物学的应用免疫磁珠可借助亲和素免疫磁珠可借助亲和素生物素系统与非蛋白结生物素系统与非蛋白结合（如各种合（如各种DNA、RNA大分子）。先将大分子）。先将PCR双链产物与双链产物与生物素化的磁珠混合使两者结合，然后进行碱性变性处生物素化的磁珠混合使两者结合，然后进行碱性变性处理，使理，使PCR双股双股DNA成为单股成为单股DNA，可直接快速用于检，可直接快速用于检测测PCR样品中样品中DNA或或RNA分子并可进行测序。分子并可进行测序。2.3.4分子生物学的分子生物学的应应用用免疫磁珠可借助免疫磁珠可借助亲亲和素和素342.4 IMB2.4 IMB技术优缺点及发展方向技术优缺点及发展方向优点优点:分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单，分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单，不需要昂贵的仪器设备不需要昂贵的仪器设备,不影响被分离细胞或其它生物材不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等料的生物学性状和功能等,从而在微生物检测方面具有很从而在微生物检测方面具有很大的优势。大的优势。但在但在IMBIMB应用过程中应用过程中,目前目前仍然存在着一些问题仍然存在着一些问题:1、进口的免疫磁珠价格昂贵、进口的免疫磁珠价格昂贵,而国产的磁珠在敏感性等而国产的磁珠在敏感性等方面还需要进一步的实验改进。方面还需要进一步的实验改进。2、免疫磁珠分离方法的特异性与所用的抗体密切相关、免疫磁珠分离方法的特异性与所用的抗体密切相关,有可能不能避免与其他杂菌交叉反应有可能不能避免与其他杂菌交叉反应,因此也需要辅助其因此也需要辅助其他方法同时进行检测他方法同时进行检测,如选择性分离平板、发酵实验及如选择性分离平板、发酵实验及PCR等。另外等。另外,免疫磁珠分离方法与显色培养基相结合的免疫磁珠分离方法与显色培养基相结合的检测也会是一个趋势。检测也会是一个趋势。2.4IMB技技术优术优缺点及缺点及发发展方向展方向优优点点:分离速度快、分离速度快、35Thatsall,thankyou.36