流式细胞术基本原理专题培训ppt课件

教学参考教学参考书实用流式用流式细胞胞术彩色彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4临床流式床流式细胞分析胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。2005.8流式流式细胞胞术原理与原理与应用教程用教程。吴后男编。北京大学医学出版社。2008.2实用流式用流式细胞胞术-血液病篇血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学出版社。2010.9流式流式细胞胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10教学参考书实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2001主要内容主要内容一、流式一、流式细胞胞仪结构和原理构和原理流式流式细胞胞术简介介流式流式细胞胞仪的的结构构组成成流式流式细胞胞仪的光信号的光信号检测流式流式细胞胞术数据的存数据的存贮、显示与分析示与分析流式分流式分选二、流式二、流式细胞胞术操作与技巧操作与技巧三、流式三、流式细胞胞术在生物医学中的在生物医学中的应用用主要内容一、流式细胞仪结构和原理21.1 流式流式细胞胞术简介介流式流式细胞胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式流式细胞胞仪（Flow Cytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。1.1 流式细胞术简介流式细胞术（Flow Cytometr3流式流式细胞胞术的特点的特点检测对象：象：单细胞胞悬液或生物液或生物颗粒；粒；检测参数：多参数；参数：多参数；检测特点：特点：单细胞水平分析；胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个速度：高速，最高达上万个细胞胞/秒；秒；检测结果：精度高、准确性好；果：精度高、准确性好；可可对目目标细胞胞进行分行分选；流式细胞术的特点检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；4流式：流式：单个细胞单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；分析，收集每个细胞的数据，更精准；WB：群体群体分析，得到多个细胞的平均值。分析，得到多个细胞的平均值。流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；5流式流式细胞胞仪的的发展及商品化展及商品化1934 Moldavanl:First try(固定式固定式细胞分析胞分析-流流动式式)；1953 Crosland-Taylor:鞘流系鞘流系统(解决解决难题)；1956 Coulter原理原理(血血细胞胞计数器数器)；1965 Kamentsky:分光光度分光光度计定量定量细胞成分和散射光胞成分和散射光应用；用；1967 Kamentsky等等设计了了细胞分胞分选的装置；的装置；1969 Vandilla等等:第一台第一台荧光光检测细胞胞计(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光)；1972 斯坦福大学斯坦福大学:研制出研制出荧光激活光激活细胞分胞分选仪(FACS)；1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流第一台商用流 式式细胞胞仪-FACS。1975 Kohler和和Milstein:单克隆抗体技克隆抗体技术(促促进流式流式发展展)。流式细胞仪的发展及商品化1934 Moldavanl:F61979年年 国家科委重点国家科委重点项目：目：研制国内第一台激光流式研制国内第一台激光流式细胞胞仪；1982年年 国内第一台三参数激光流式国内第一台三参数激光流式细胞胞仪诞生；生；1984年年 国家科委国家科委组织科研成果的科研成果的鉴定定验收；收；1985年年 获国家国家卫生部科技成果乙等生部科技成果乙等奖；1985年年-1990年年 灵敏度灵敏度、信噪比信噪比、更多参数；更多参数；流式分流式分选仪研制开研制开发；计算机四参数算机四参数软件；件；样品制品制备、医学生物学、医学生物学应用。用。1979年 国家科委重点项目：7流式流式细胞胞仪的分的分类分析型分析型流式流式细胞胞仪细胞胞样本分析后最本分析后最终进入入废液桶，不能回收利用。液桶，不能回收利用。分分选型型流式流式细胞胞仪既能流式分析，既能流式分析，还能能对分析的目的分析的目的细胞胞进行分行分选；进样管道管道较长，还需要保持无菌状需要保持无菌状态，所以分，所以分选型流型流式式细胞胞仪一般只用于分一般只用于分选。流式细胞仪的分类分析型流式细胞仪8BD公司分析型流式公司分析型流式细胞胞仪FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACS Canto II 双激光六色，三激光八色FACS Verse双激光六色，三激光八色BD公司分析型流式细胞仪FACS Calibur 双激光四色9BD公司分公司分选型流式型流式细胞胞仪FACSVantage SEFACSAria IIIInfluxBD公司分选型流式细胞仪FACSVantage SEFACS10Beckman Coulter流式流式细胞胞仪Epics XL 单激光四色，市场覆盖率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC 500 单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Gallios 三激光十色，分析型MoFlo XDP 高端分选型Beckman Coulter流式细胞仪Epics XL 单111.2 流式流式细胞胞仪的的结构构组成成液流系液流系统流流动室室液流液流驱动系系统光学系光学系统激激发光源光源光束收集系光束收集系统电子系子系统光光电转换器器数据数据处理系理系统细胞分胞分选系系统喷嘴嘴电偏偏转板板样本收集器本收集器1.2 流式细胞仪的结构组成液流系统121.2.1 液流系液流系统鞘流技鞘流技术：根据：根据层流原理流原理发展起来的技展起来的技术，可以，可以实现两两种液体的同种液体的同轴流流动，样本本细胞流位于胞流位于轴心心稳定流定流动，外，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。流体流体动力学聚焦：力学聚焦：稳定的液定的液流从截面流从截面积较大的部分流入大的部分流入截面截面积较小的部分后，有一小的部分后，有一个聚焦收个聚焦收缩作用，作用，细胞流直胞流直径被径被约束在束在10-20um，避免，避免了多个了多个细胞重叠胞重叠进入入检测区。区。鞘液鞘液鞘液鞘液细胞流胞流激光照射点激光照射点流体流体动力学聚焦示意力学聚焦示意图1.2.1 液流系统鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可13（一）（一）流流动室室和和液流液流驱动系系统流流动室室(flow cell,flow chamber)是流式是流式细胞胞仪的核心部件。的核心部件。流流动室中，被室中，被测细胞逐个通胞逐个通过，并在此与激光正交。，并在此与激光正交。进样孔进样孔荧光信号荧光信号激光束激光束鞘液Sheath流流动室室结构构图：单细胞胞发生器生器（一）流动室和液流驱动系统流动室(flow cell,fl14液流液流驱动系系统液流驱动系统15（二）（二）进样速率控制速率控制10 psi10.2 psi10 psi10.8 psi通通过改改变样本本压力可以力可以调节样本的本的进样速率，而速率，而这并并不是提高不是提高样本流的流速，而是改本流的流速，而是改变了了细胞之胞之间的距离。的距离。高速高速时样本流本流变宽，单位位时间内流内流经激光照射区的激光照射区的细胞数就增加，胞数就增加，这样会会导致致变异系数增加。异系数增加。（二）进样速率控制10 psi10.2 psi10 psi1161.2.2 光学系光学系统（一）（一）激激发光源光源：激光器：激光器气体激光器：气体激光器：氩离子离子(488nm、355nm)、氦、氦氖(633nm)、氪离子离子 (647nm)、氪氩(568nm)；染料激光器：如染料激光器：如氩离子激光离子激光泵浦的浦的Rhodomin 6G水溶液染料激水溶液染料激 光器，光器，发出出550-650nm可可变波波长激激发光；光；半半导体激光器：价格低、体激光器：价格低、结构构简单、寿命、寿命长。BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半半导体激光器。体激光器。激光特点：激光特点：单波波长、高能量、小、高能量、小发射角、高射角、高稳定性光照。定性光照。现在在仪器常配有器常配有仪器器选配配2-4根激光器，波根激光器，波长多多为488nm、633nm和和355nm、405nmUV；1.2.2 光学系统（一）激发光源：激光器17（二）光（二）光束成行系束成行系统（二）光束成行系统18FCM的的单细胞照明技胞照明技术：这种种椭圆形光斑的形光斑的检测区保区保证样本中的本中的细胞是一个一个分胞是一个一个分别受到最大光照。受到最大光照。细胞流胞流动方向方向FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细19（三）光收集系（三）光收集系统滤光片光片的的组成成长通通滤片片(LP)：只允：只允许特定波特定波长以上的光束通以上的光束通过；短通短通滤片片(SP)：只允：只允许特定波特定波长以下的光束通以下的光束通过；带通通滤片片(BP)：只允：只允许一定波一定波长范范围内的光束通内的光束通过。Long pass Short pass Band pass460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50460 500 540460 500 540（三）光收集系统滤光片的组成Long pass 20流式细胞术基本原理专题培训ppt课件21FACSCalibur流式流式细胞胞仪信号信号检测系系统透射光路透射光路FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统透射光路22全反射光路全反射光路FACS Aria流式流式细胞胞仪器信号器信号检测系系统PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC全反射光路FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统PE-C231.2.3 电子系子系统光光电检测器器将光信号将光信号转换成成电子信号。子信号。前置放大前置放大电路路将信号等比例放大，将信号等比例放大，输出出电脉冲信号。脉冲信号。模数模数转换器器将模将模拟的的电脉冲信号脉冲信号转换成数字信号。成数字信号。数据数据处理系理系统计算机系算机系统数据采集、分析。数据采集、分析。1.2.3 电子系统光电检测器24（一）（一）光光电检测器器(photodetector)光光电二极管二极管(photodiode)光灵敏度低，光灵敏度低，测定定强信号（信号（FSC）；）；光光电倍增管倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，光灵敏度高，测定弱信号（定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光前向散射光光光电二极管二极管（一）光电检测器(photodetector)光电二极管(p25（二）（二）电信号两种放大方式信号两种放大方式由于光信号比由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便弱，需将其等比例放大，方便计算机分析算机分析处理，一般信号的放大可以使用理，一般信号的放大可以使用线性性或或对数数两种方式。两种方式。线性性(linear;lin)对数数(logarithmic;log)一般一般FSC和和SSC变异范异范围较小，故使用小，故使用线性放大；性放大；荧光信号光信号变异范异范围较大，多使用大，多使用对数放大。数放大。（二）电信号两种放大方式由于光信号比较弱，需将其等比例放大，26（三）（三）电脉冲信号的面脉冲信号的面积A、高度、高度H和和宽度度WCreation of a Voltage PulseTimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0Quantification of a Voltage PulseWidth=Area/Height（三）电脉冲信号的面积A、高度H和宽度WCreation o27 光信号光信号电信号数字信号信号数字信号 光信号电信号数字信号28通道通道(channel)一个光一个光电检测器就是一个通道，有多少个光器就是一个通道，有多少个光电二极管二极管/倍倍增管，就有多少个通道：增管，就有多少个通道：散射光通道散射光通道:FSC通道和通道和SSC通道；通道；荧光通道光通道通道命名方式：通道命名方式：以以FL(fluorescence)加数字命名，如加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。等。以以该通道接收的主要通道接收的主要荧光素命名，如光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。通道等。For example：FACSCalibur有有488nm和和633nm两根激光器，两根激光器，488nm能能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能能检测FL4(APC)，代表，代表Calibur有有6个通道，最多能同个通道，最多能同时检测4个个荧光，光，6种参数。种参数。通道(channel)291.3 流式流式细胞胞术光信号光信号检测 光信号的光信号的类型型散射光信号：散射光信号：与与标记荧光素无关，光素无关，是是细胞的固有参数。胞的固有参数。前向散射光前向散射光(forward scatter,FSC);侧向散射光向散射光(side scatter,SSC).荧光信号光信号自自发荧光光：微弱：微弱特异特异荧光：光：标记的的荧光素分子光素分子发出出 的的荧光，比自光，比自发荧光光强很多倍。很多倍。1.3 流式细胞术光信号检测 光信号的类型301.3.1 散射光信号散射光信号（一）前向散射光（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范度范围内，内，亦称小角度散射光，主要反映被亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的胞的体体积大小和活力大小和活力。1.3.1 散射光信号（一）前向散射光FSC31（二）（二）侧向散射光向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散度散射光，其信号射光，其信号强度反映度反映细胞内部胞内部颗粒度和精粒度和精细结构的构的变化化。（二）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂32（三）散射光的作用（三）散射光的作用实验中，常利用中，常利用FSC和和SSC这两种参数的两种参数的组合，区分不同的合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死胞群体，去除碎片、死细胞和粘胞和粘连细胞的干胞的干扰。粒粒细胞胞单核核细胞胞淋巴淋巴细胞胞红细胞、死胞、死细胞和碎片胞和碎片（三）散射光的作用实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组33死死细胞胞或碎片或碎片粘粘连细胞胞肿瘤瘤细胞株胞株FSC/SSC散点散点图死死细胞胞加加药处理后理后FSC/SSC散点散点图通通过FSC/SSC散点散点图，gate出目出目标细胞胞进行分析。行分析。死细胞粘连细胞肿瘤细胞株FSC/SSC散点图死细胞加药处理后34（三）（三）阈值 Threshold阈值：溶液中的：溶液中的杂质或者死或者死细胞，很容易胞，很容易产生微小的干生微小的干扰信号，所以必信号，所以必须设置置阈值，排除，排除杂质、细胞碎片或体胞碎片或体积较小的死小的死细胞。胞。FSC反映反映细胞体胞体积的大小，的大小，FCM应用用时常常选取取FSC设定定阈值。5%32%默默认阈值升高升高阈值后后（三）阈值 Threshold阈值：溶液中的杂质或者死细胞，351.3.2 荧光信号光信号（一）（一）荧光：光：物物质中的中的电子吸收光的能量由低能状子吸收光的能量由低能状态转变为高能状高能状态，再回到低能状，再回到低能状态时释放出的光。放出的光。发射波射波长(荧光波光波长)Emission wavelength激激发波波长Excitation wavelength1.3.2 荧光信号（一）荧光：物质中的电子吸收光的能量由36（二）常用（二）常用荧光素光素499nm 蓝色色荧光（光（Blue）；500-549nm，绿色荧光（，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（，黄色荧光（Yellow）；585-615nm，橙色荧光（，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（，红色荧光（Red）；700nm，远红外荧光（，远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的抗体的荧光素光素荧光素分子荧光素分子激发光波长激发光波长（nm）发射光波长发射光波长（nm）中文名中文名FITC490520异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白多甲藻叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665（二）常用荧光素499nm 蓝色荧光（Blue）；37核酸核酸荧光染料光染料PI（碘化丙啶（碘化丙啶 535,623）可可选择性的插入核酸双螺旋碱基性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用中。常用于于DNA分析，需要用分析，需要用RNase处理理细胞排除胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；光定量的影响；PI不能透不能透过活活细胞膜，常用于胞膜，常用于鉴定死定死细胞。胞。7-AAD（7-氨基放线菌素氨基放线菌素D 545,647）以插入的方式与以插入的方式与DNA链的的G-C碱碱基基对结合，不能透合，不能透过活活细胞膜，常用于胞膜，常用于鉴定死定死细胞。胞。DAPI（4,4,6-二二脒基二苯基基二苯基吲哚 358,456）可以非嵌入方式与可以非嵌入方式与DNA链上上的的A-T碱基碱基对特异性特异性结合。合。变异系数明异系数明显小于其他染料，一种理想的小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。定量染料。Hoechst（343,450）常常见为Hoechst33342和和Hoechst33258，非嵌入的，非嵌入的方式与方式与DNA链上的上的A-T碱基碱基对结合。能合。能对活活细胞染色，用于活胞染色，用于活细胞胞DNA定量分析，如精子分定量分析，如精子分选；还用于用于侧群群细胞的分胞的分选。PY（派若宁（派若宁 560,573）RNA染料，能染料，能进入活入活细胞。胞。AO（吖啶橙（吖啶橙 509,525）DNA、RNA染料，染色后染料，染色后DNA呈黄呈黄绿色色荧光，光，RNA呈橙黄色呈橙黄色荧光，可光，可进行行DNA/RNA双参数分析。双参数分析。核酸荧光染料38其他常用其他常用荧光染料光染料测量参数荧光染料激发波长(nm)荧光波长(nm)报告基因GFP475509YFP514527细胞示踪染料CFSE495519FAM488525细胞膜电位DiO-C6485505Rhodamine123511546细胞内pH值SNARF-1514587/640细胞内钙浓度Fluo3506528Indo-1(low）361485Indo-1(high）330405氧自由基DCFHDA505535其他常用荧光染料测量参数荧光染料激发波长(nm)荧光波长(n39（三）（三）荧光抗体的光抗体的选择A 根据流式根据流式细胞胞仪选择抗体抗体流式流式细胞胞仪能能检测的通道数的通道数(由激光器种由激光器种类、数量和使用、数量和使用的光学的光学滤片决定片决定)。如。如FACSCalibur：多色多色标记荧光素搭配原光素搭配原则：每个通道只能：每个通道只能选择一种一种荧光素；光素；各个通道之各个通道之间的的荧光素可以随意搭配。光素可以随意搭配。FACSCalibur常用四色搭配：常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP 530/30515-545FITC、AF488FL2BP 585/42564-606PEFL3670 LP670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP 661/16653-669APC、AF647（三）荧光抗体的选择A 根据流式细胞仪选择抗体488FL1B40（三）（三）荧光抗体的光抗体的选择本本实验室的室的FACSCantoII配置两根激光器激配置两根激光器激发六色六色荧光。光。第一激光器：第一激光器：488nm蓝色固色固态激光器激激光器激发四色。四色。第二激光器：第二激光器：633nm红色氦色氦氖激光器激激光器激发二色。二色。荧光光滤片：片：488nm激光：激光：530/30nm、585/42nm、695/40nm、780/60nm633nm激光：激光：660/20nm、780/60nm总共可以共可以检测6色色荧光光可可选择的的荧光如下：光如下：带通通滤片（片（530/30nm）：）：代表允代表允许530nm15nm波波长(515-545nm)的光通的光通过（三）荧光抗体的选择本实验室的FACSCantoII带通滤片41B 根据抗原表达根据抗原表达强弱合理弱合理选择抗体抗体不同的不同的荧光素光素强度有所不同；度有所不同；高表达的抗原可用不太高表达的抗原可用不太“亮亮”的的染料，更染料，更“亮亮”的的荧光素分配光素分配给表达低的抗原：表达低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC 选择荧光波光波谱间光光谱重叠重叠较小的小的荧光染料光染料进行行组合，合，同同时需要正确的需要正确的调节补偿。CD5B 根据抗原表达强弱合理选择抗体C 选择荧光波谱间光谱重叠较421.4 FCM数据存数据存储、显示与分析示与分析标准的准的FCM数据采用数据采用列表模式（列表模式（list mode），记录了每个了每个细胞的所有参数的信息。胞的所有参数的信息。每个每个细胞胞检测5个参数，那么个参数，那么获取取10000个个细胞，容量胞，容量为510000（字或双字）。（字或双字）。Event#FSCSSCFL1 FITCFL2 PEFL3APC1100500106504211050570070063904807206701049549015720151.4 FCM数据存储、显示与分析标准的FCM数据采用列表模43FCM数据数据显示方式示方式单参数直方参数直方图(Histogram)双参数数据双参数数据显示：示：散点散点图(Dot Plot)伪彩彩图(Pseudo-color Plot)等高等高线图(Contour Plot)密度密度图(Density Plot)假三假三维图(Pseudo 3D Plot)三三维图(3D Plot)常用分析软件常用分析软件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCS ExpressFCM数据显示方式单参数直方图(Histogram)常用分析44直方直方图Histogram细胞的某一胞的某一单参数数据的参数数据的统计分布分布图，横坐，横坐标表示表示荧光信光信号或散射光信号相号或散射光信号相对强度的度的值，单位是道数，位是道数，纵坐坐标一般一般是是细胞数。胞数。Event#FL1 FITC110270037204150101001000CountsFITC荧光光强度度直方图Histogram细胞的某一单参数数据的统计分布图，横45横坐横坐标既可以是既可以是线性的，也可以是性的，也可以是对数的。数的。DNA倍体分析倍体分析抗原表达分析抗原表达分析Overlay图横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。DNA倍体分析抗原表达46散点散点图散点散点图中每个点代表一个中每个点代表一个细胞，胞，X轴与与Y轴分分别代表一种参代表一种参数，数，优点是比直方点是比直方图直直观。FL1FL2散点图散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数47散点散点图和和伪彩彩图散点图和伪彩图48等高等高图和密度和密度图等高等高图：类似于地似于地图中的等高中的等高线，同一条，同一条线上的上的细胞数目胞数目相等，越在里面的曲相等，越在里面的曲线代表代表细胞数目越多。胞数目越多。密度密度图：点密度越大的地方：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方胞越多，点密度越小的地方细胞少。胞少。等高图和密度图等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞49假三假三维图和三和三维图SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 假三维图和三维图SSC-HeightFSC-HeightCo50设门与数据分析与数据分析门门(Gate，简写，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。据分析过程实际上就是选门和设门的过程。椭圆形形圆形形设门与数据分析门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要51矩形矩形任意形状任意形状R(Region，区域，区域)。门可以是单一区域。门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几，也可以是几个区域组合在一起：个区域组合在一起：G=R1 and R2;G=R1 or R2;G=R1 not R2。矩形任意形状R(Region，区域)。门可以是单一区域(G=52十字十字门线性性门十字门线性门531.5 流式分流式分选 电荷式荷式分分选超声振超声振动器器(15-100kHz)液流充液流充电系系统高高压偏偏转板板收集装置收集装置(流式管、培养板流式管、培养板)lasers断裂点断裂点(充充电)高高压偏偏转板板1.5 流式分选 电荷式分选lasers断裂点(充电)54四路分四路分选原理原理电荷式分荷式分选装置装置四路分选原理电荷式分选装置55液滴延液滴延迟在含有分在含有分选细胞的液滴上胞的液滴上准确加准确加电是有效分是有效分选的关的关键，但是，但是细胞胞经过检测区区(激光照射点激光照射点)到加到加电位置位置(断裂点断裂点)有一个有一个时间差，差，这称称为液滴延液滴延迟(drop delay)。延延迟时间直接影响着分直接影响着分选纯度，准确度，准确测定延定延迟时间是一个重要步是一个重要步骤。液液滴滴延延迟激光激光断裂点断裂点照射点照射点液滴延迟在含有分选细胞的液滴上准确加电是有效分选的关键，但是56分分选指指标分分选速度、分速度、分选纯度和分度和分选收收获率，相互影响。率，相互影响。分分选时间由三方面决定：由三方面决定：进样速度、目速度、目标细胞所占比例、胞所占比例、需要收集的需要收集的细胞数。胞数。需要细胞数目标细胞所占比例(%)15501041.7 min20 s2 s10516.8 min3.4 min20 s1062.8 h3.4 min3.4 min1071.2 天5.6 h34 min分分选时间表表(机器流速机器流速10000个个/s时)分选指标分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。需要细胞数57分分选纯度度指被分指被分选出来的出来的细胞所占的百分比，一般能达胞所占的百分比，一般能达99%以上。以上。分分选收收获率率是指被分是指被分选出的出的细胞与原来胞与原来总细胞的百分比。胞的百分比。分分选纯度和收度和收获率永率永远是相互矛盾的，是相互矛盾的，纯度提高，收度提高，收获率率降低，反之亦然。降低，反之亦然。富集模式富集模式(enrich mode)纯化模式化模式(purify mode)单细胞模式胞模式(single cell mode)分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。58流式分流式分选和磁珠分和磁珠分选FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)流式分流式分选MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting)磁珠分磁珠分选磁性磁性标记未未标记的的细胞先行流出胞先行流出洗脱阳洗脱阳性性细胞胞阳性分阳性分选策略策略流式分选和磁珠分选FACS(Fluorescence-Ac59比较项目流式分选(FACS)磁珠分选(MACS)设备要求分选型流式细胞仪专用的磁铁和柱子操作员要求要求高，需专门培训 操作简单，要求不高试剂荧光素偶联抗体磁珠结合抗体对细胞刺激刺激大刺激小多参数分选可以不可以低表达群细胞分选可以不可以胞内荧光分选可以不可以流式分流式分选与磁珠分与磁珠分选比比较流式分选结合磁珠分选的方法，常应用于分选低比例细胞流式分选结合磁珠分选的方法，常应用于分选低比例细胞群。如分选调节性群。如分选调节性T细胞细胞CD4CD25 CD127low，先用磁珠分，先用磁珠分选纯化选纯化CD4 T细胞，再用流式分选的方法分选细胞，再用流式分选的方法分选CD4CD25 CD127low调节性调节性T细胞。细胞。比较项目流式分选(FACS)磁珠分选(MACS)设备要求分选60二、流式二、流式细胞胞术操作与技巧操作与技巧流式细胞术操作流程流式细胞术操作流程：培养细胞血液骨髓新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液制备荧光染色上机检测表型测定细胞分选继续培养FISHPCR统计学分析二、流式细胞术操作与技巧流式细胞术操作流程：表型测定继续培养612.1 单细胞胞悬液制液制备2.2 免疫免疫荧光光标记2.3 对照的照的设置置2.4 光光谱重叠与重叠与补偿2.1 单细胞悬液制备622.1 单细胞胞悬液制液制备2.1.1 新新鲜实体体组织的的样本制本制备 对于不同于不同组织来源的来源的实体体组织和和实体瘤体瘤标本，本，应该根据各根据各自特点自特点选择不同的分散不同的分散细胞方法，以期达到胞方法，以期达到单细胞胞产量高量高、损伤小小的目的。常用方法有：的目的。常用方法有：酶消化法消化法机械法机械法化学化学试剂处理法理法2.1 单细胞悬液制备2.1.1 新鲜实体组织的样本制备63酶消化法消化法：根据分散根据分散组织类型来确定使用的型来确定使用的酶类：胰蛋白胰蛋白酶水解水解酯键、肽键；胶原胶原酶降解几种分子降解几种分子类型的胶原；型的胶原；溶菌溶菌酶水解糖蛋白、水解糖蛋白、肽的糖苷的糖苷键；弹性蛋白性蛋白酶消化糖蛋白、消化糖蛋白、弹性蛋白的性蛋白的纤维。1.将新将新鲜组织置于离心管中，加入置于离心管中，加入1-2ml酶消化消化20-30min（恒温（恒温37或室温），或室温），间断振断振荡或吹打；或吹打；2.终止消化，收集止消化，收集细胞胞悬液，液，300目尼目尼龙网网过滤，除，除去去细胞胞团块，低速离心除去，低速离心除去细胞碎片；胞碎片；3.将制将制备好的好的单细胞胞悬液液进行行荧光光标记或保存或保存备用。用。注意注意：酶的使用的使用浓度、温度、消化度、温度、消化时间、酶活性的活性的pH值。酶消化法：根据分散组织类型来确定使用的酶类：64机械法特点机械法特点：易造成：易造成细胞碎片和胞碎片和团块，实际操作操作时，应注意碎注意碎片和片和团块的去除，常与其他方法（如的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用消化法）配合使用。组织解离器机械法机械法：有有剪碎法剪碎法、网搓法网搓法、研研磨法磨法等。等。利用机械方法、物理方利用机械方法、物理方法法给予予组织交大的交大的压力，力，使使细胞从胞从组织间分散开分散开来。来。机械法特点：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团65化学化学处理法理法：作用原理：将作用原理：将组织细胞胞间起黏着作用的起黏着作用的钙、镁离子置离子置换出来，从而使出来，从而使细胞分散开来，常用胞分散开来，常用试剂有有EDTA、EGTA、TPB等。等。EDTA是一种螯合是一种螯合剂，可以和，可以和组织间的的钙、镁离子形成螯离子形成螯合物，合物，实际运用中常采用螯合物加运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白法（主要是胰蛋白酶）。）。特点特点：用化学法：用化学法细胞存活率低、胞存活率低、细胞胞产额低，低，细胞碎片胞碎片和聚集量不和聚集量不稳定。定。化学处理法：66机械法往往造成机械法往往造成严重的重的细胞胞损伤，而，而结果却是果却是较低的低的细胞胞产量，注意去除量，注意去除细胞碎片和胞碎片和团块以免影响以免影响FCM结果，如低果，如低速离心去碎片、尼速离心去碎片、尼龙网网过滤团块等。等。酶消化法、化学消化法、化学试剂处理法理法对实体体组织的分散效果的分散效果较理想，理想，但会造成所但会造成所测化学成分的不良影响。化学成分的不良影响。根据根据实验目的去目的去选择合适的合适的单细胞胞悬液制液制备方法，最方法，最终要要求求细胞呈胞呈单个分散状个分散状态；细胞碎片、胞碎片、团块尽量少；尽量少；细胞活胞活性不受到明性不受到明显损伤，保，保证下一步下一步荧光染色。光染色。流式细胞术基本原理专题培训ppt课件672.1.2 石蜡包埋石蜡包埋组织样本制本制备切片：将石蜡组织切成50um厚的组织片4-5片，放入1试管中；脱脂：加入二甲苯3-5ml脱脂，室温下1-2天，脱净后弃二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10 min，去乙醇后加入蒸馏水3-5ml，3-5min后弃水；消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶（pH 1.5-2.0），37恒温水浴30 min，每隔5-10min振荡一次；终止消化：加冷的PBS或生理盐水终止消化；过滤：用300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；收集细胞悬液：将过滤液离心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速离心沉淀去除碎片；根据实验目的标记荧光抗体，或保存细胞备用。2.1.2 石蜡包埋组织样本制备切片：将石蜡组织切成50um682.1.3 血液、骨髓血液、骨髓样本制本制备外周血外周血单个核个核细胞胞PBMC的分离的分离血液层Ficoll层血浆层PBMCFicoll层红细胞层离心前离心后Ficoll密度梯度离心法分离密度梯度离心法分离PBMC注意：注意：由于多核粒由于多核粒细胞比胞比较大，大，粒粒细胞沉降在胞沉降在红细胞胞层，所以所以该法不适合粒法不适合粒细胞胞研究；研究；该法操作法操作过程中可能程中可能丢失一些有意失一些有意义的的细胞或胞或细胞胞亚群，所以群，所以临床上床上一般不主一般不主张分离血液或分离血液或骨髓的骨髓的单个核个核细胞。胞。2.1.3 血液、骨髓样本制备外周血单个核细胞PBMC的分离69红细胞裂解液去除胞裂解液去除红细胞胞原理：原理：红细胞裂解液成分胞裂解液成分为低渗的低渗的NH4Cl溶液，利用双凹溶液，利用双凹型的型的红细胞膜抗性差，白胞膜抗性差，白细胞膜抗性比胞膜抗性比较好的特点，加入好的特点，加入低渗透低渗透压的的红细胞裂解液胞裂解液时，红细胞膜胞膜胀破，而白破，而白细胞膜胞膜不受影响，从而达到去除不受影响，从而达到去除红细胞的目的。胞的目的。溶血溶血/免洗免洗(lyse/no wash)技术技术临床上床上应用溶血用溶血/免洗技免洗技术，既，既简化了操作步化了操作步骤，又避免了，又避免了洗洗涤过程中可能造成的某些程中可能造成的某些亚群群细胞的胞的丢失。尤其在失。尤其在检测严重重污染性染性标本本时，避免了因离心等，避免了因离心等处理可能理可能导致气致气溶胶溶胶产生引起病毒感染的可能。生引起病毒感染的可能。红细胞裂解液去除红细胞溶血/免洗(lyse/no wash)702.1.4 培养培养细胞胞单细胞胞悬液制液制备2.1.5 体液脱落细胞样本制备体液脱落细胞样本制备悬浮生浮生长细胞胞吸管反复吹打吸管反复吹打贴壁生壁生长细胞胞消化消化处理理离心离心获得得单细胞胞悬液液洗脱液洗脱液尿液尿液胸腹水胸腹水离心收集离心收集细胞，胞，用生理用生理盐水或水或PBS洗洗涤3次次300目尼目尼龙膜膜过滤后离心后离心沉淀去上清沉淀去上清单细胞胞悬液液2.1.4 培养细胞单细胞悬液制备2.1.5 体液脱落细胞样71FCM可可检测下列下列细胞成分：胞成分：表面表面标记物物胞胞浆标记物物核内核内标记物物可溶性成分可溶性成分2.2 免疫免疫荧光染色光染色黏附因子黏附因子表面受体表面受体细胞因子胞因子分泌到胞外的分泌到胞外的细胞因子胞因子胞内抗原胞内抗原核酸含量核酸含量核内抗原核内抗原FCM可检测下列细胞成分：2.2 免疫荧光染色黏附因子表面受72荧光素偶光素偶联抗体抗体抗体上偶抗体上偶联荧光素光素(FITC、PE等等)，通，通过抗原抗体反抗原抗体反应让目目标细胞特异性的胞特异性的带上上荧光。光。染色染色过程即抗原抗体反程即抗原抗体反应过程。程。荧光染料光染料/荧光化合物光化合物PI、DAPI等插入核酸等插入核酸链中；中；CFSE和蛋白和蛋白质共价共价结合；合；Annexin V-FITC检测凋亡。凋亡。荧光蛋白光蛋白如如GFP，不需要染色，直接，不需要染色，直接检测。荧光素偶联抗体73免疫免疫荧光染色主要包括直接和光染色主要包括直接和间接免疫接免疫荧光染色两种方法。光染色两种方法。间接接标记的方法的方法难以以进行多色行多色标记，而且操作复，而且操作复杂、信噪、信噪比高，所以一般首先直比高，所以一般首先直标荧光抗体。光抗体。荧光抗体光抗体荧光二抗光二抗第一抗体第一抗体直接直接标记间接接标记免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记74一般一般检测时，获取取12万个万个细胞，胞，标记0.51106细胞即胞即可。可。下述情况下述情况细胞量需相胞量需相应增加：增加：检测胞内胞内/核内抗原，离心核内抗原，离心次数多；次数多；细胞周期乙醇固定胞周期乙醇固定损失失细胞多；胞多；检测细胞在胞在标本本中比例低中比例低 0.51106个个细胞胞孵育体孵育体积50-100ul上机体上机体积200-500ul终浓度度约1106个个/ml加染料加染料洗洗涤后后补加液体加液体细胞表面抗原胞表面抗原标记一般检测时，获取12万个细胞，标记0.51106细胞即75表面抗原分析是流式表面抗原分析是流式应用中最广泛的，用中最广泛的，标记步步骤也相也相对简单。标记：取：取0.51106细胞，加入适量抗体胞，加入适量抗体(根据抗体根据抗体说明明书)，充分混匀后，充分混匀后(总体体积50-100ul)，4 避光孵育避光孵育10-30min。洗洗涤：加入：加入1ml PBS洗液，洗液，300g离心洗离心洗涤5min。上机上机检测：弃去上清后加入：弃去上清后加入200-500ul PBS，重，重悬细胞后胞后立即上机立即上机检测；如不能及；如不能及时上机上机检测，则加入同加入同样体体积的的1%多聚甲多聚甲醛，混匀后置于，混匀后置于4 冰箱内保存，一般不冰箱内保存，一般不超超过24h。表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤也相对简单。76胞内抗原胞内抗原荧光光标记细胞内抗原：如胞内抗原：如MPO；核内抗原：如核内抗原：如FoxP3；细胞内胞内细胞因子胞因子(胞内因子胞内因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。等。固定：固定：4多聚甲多聚甲醛破膜破膜/透化透化0.05%皂素皂素(saponin)；0.01%Triton X-100 70%乙醇乙醇胞内抗原荧光标记细胞内抗原：如MPO；77膜表面抗原染色：分膜表面抗原染色：分别加入相加入相应的的荧光素光素标记抗体和适量抗体和适量细胞胞标本，充分混匀后避光孵育本，充分混匀后避光孵育10-30min。洗洗涤：加：加1ml PBS洗液，洗液，300g离心离心5min。固定：去上清后加入固定：去上清后加入500ul 4%多聚甲多聚甲醛，固定，固定20min。透化：离心洗去固定透化：离心洗去固定剂后，加皂素后，加皂素500 ul，透化，透化10min。胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相应荧光素光素标记抗体，混匀后室温避光孵育抗体，混匀后室温避光孵育30 min。洗洗涤：加：加1ml PBS洗液，洗液，300g离心离心5min。上机上机检测：弃去上清后加入：弃去上清后加入PBS 200-500 ul后上机后上机检测。膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量细胞标本，782.3 对照的照的设置置 空白空白对照照细胞内物胞内物质自身也自身也发出出荧光，能被光，能被FCM灵敏的灵敏的检测到，到，这种未染色的种未染色的细胞自身胞自身发出的一些出的一些荧光称光称为自自发荧光。光。设置空白置空白对照（未染色的照（未染色的细胞），用以区分胞），用以区分细胞的自胞的自发荧光和特异性光和特异性荧光，避免假阳性的光，避免假阳性的结果。果。2.3 对照的设置 空白对照79流式流式结果中果中荧光光强弱是一个相弱是一个相对值，光光电倍增管倍增管电压越大，越大，电子信号越子信号越强；电压越小，信号越弱。越小，信号越弱。通通过调节电压，使阴性，使阴性对照管的照管的荧光光强度度处于阴性的位置，于阴性的位置，实验组的的荧光光值都是相都是相对对照照组。流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号80同型同型对照照 Isotype Control非特异性染色非特异性染色抗体的抗体的Fc段可以与段可以与细胞表面的胞表面的Fc受体非特异性受体非特异性结合；合；抗体抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。同型同型对照是指使用与照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作型的抗体作为对照，用照，用于消除抗体非特异性于消除抗体非特异性结合到合到细胞上而胞上而产生的背景生的背景荧光。光。实验抗体：抗体：FITC-CD3单克隆抗体克隆抗体为鼠鼠IgG1亚型抗体型抗体;同型同型对照：未免疫小鼠血清照：未免疫小鼠血清纯化的化的IgG1，并，并标记FITC，相同，相同剂量。量。同型对照 Isotype Control非特异性染色81阳性阳性对照照Positive Control设置阳性置阳性对照是照是为了了检测荧光抗体是否有效，并不是每次光抗体是否有效，并不是每次分析分析时都必都必须设置：置：使用新的使用新的荧光素抗体光素抗体时；使用存使用存储时间较长的的荧光素抗体光素抗体时。设置阳性置阳性对照的方法：照的方法：用肯定表达有用肯定表达有该抗原的抗原的细胞来胞来检测；已已经证明有效的、偶明有效的、偶联其他其他荧光素的光素的该抗原的抗体。抗原的抗体。单标对照单标对照Single Staining Control用于用于补偿的的调节。阳性对照Positive Control设置阳性对照是为了检822.4 光光谱重叠与重叠与补偿当当细胞携胞携带两种以上两种以上荧光素激光素激发出不同波出不同波长荧光光时，理，理论上可上可选择滤光片使每种光片使每种荧光光仅被相被相应的通道的通道检测到。但由于目前使用的各种到。但由于目前使用的各种荧光光染料都是染料都是宽发射射谱性性质，虽然它然它们之之间各自各自发射的峰射的峰值各不相同，但各不相同，但发射射谱范范围有一定的重叠，因而少量的有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道光信号会被另一通道检测到，到，这种种现象就是象就是光光谱重叠重叠(spectral overlap)。FL1 530/30FL2 585/42发射波长FITC发射谱PE发射谱2.4 光谱重叠与补偿当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长83实验操作中，常利用操作中，常利用电子技子技术和和计算机算机软件件设置的方法将置的方法将串入相串入相邻荧光通道的信号扣除，光通道的信号扣除，这种技种技术称称为荧光光补偿(fluorescence compensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2通通过单标调节补偿补偿前前补偿后后实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧84未未补偿正确正确补偿FITC-PE补偿太大太大PE-FITC补偿太大太大补偿调节要合适要合适未补偿正确补偿FITC-PE补偿太大PE-FITC补偿太大补85