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（一）目的基因主要是（一）目的基因主要是_。编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因（三）获取目的基因的常用方法有哪些（三）获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增一、目的基因的获取（二）目的基因的来源：（二）目的基因的来源：1 1、从自然界中已有物种中分离出来、从自然界中已有物种中分离出来2 2、人工的方法合成、人工的方法合成第5 页直接分离法LOGO正文切割切割工具：限制酶优点：操作简单缺点：盲目性大（一般适用于原核生物）第6 页人工合成法LOGO正文优点：目的性强缺点：操作复杂，目的基因只含编码序列。（一般适用于真核生物）直接合成法直接合成法反转录法反转录法1.1.基因文库：基因文库：2.2.基因文库的分类：基因文库的分类：种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库（一）从基因文库中获取目的基因提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA限制酶切限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库3 3.基因文库的构建方法基因文库的构建方法（1 1）基因组文库）基因组文库某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链DNADNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库逆转录酶逆转录酶DNA聚合酶聚合酶（2 2）部分基因文库）部分基因文库 1.1.概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物是一项在生物_复制复制_的的核酸合成技术。核酸合成技术。多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3.3.原理：原理：碱基互补配对原则碱基互补配对原则（二）利用PCR技术扩增目的基因2.2.目的：目的：在短时间内大量扩增目的基因在短时间内大量扩增目的基因2.2.原料：四种脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)4.4.一对引物：一对引物：3.3.热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）1.1.模板模板DNA(DNA(含有目的基因含有目的基因 )4.条件：条件：与目的基因的起始段互补核苷酸序列与目的基因的起始段互补核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列5.前提：前提：第3 页vPCR反应原理示意图LOGO正文利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增6.PCR过程过程1.高温变性高温变性（9095）2.低温退火（复性）低温退火（复性）（5560）3.中温延伸中温延伸（7075）p 双链双链DNADNA是在高温条件下解是在高温条件下解链为单链链为单链DNADNA的，因此整个过的，因此整个过程不需要解旋酶。程不需要解旋酶。多次重复多次重复PCR与DNA复制比较：PCR PCR 技术技术DNA DNA 复制复制相相同同点点原理原理DNA DNA 复制复制(碱基互补配对碱基互补配对)原料原料四种游离的脱氧核苷酸四种游离的脱氧核苷酸条件条件模板、酶等模板、酶等不不同同点点解旋方式解旋方式 DNA DNA 在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化场所场所体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内酶酶热稳定的热稳定的 DNA DNA聚合酶聚合酶(Taq Taq 酶酶)细胞内含有的细胞内含有的DNADNA聚合酶聚合酶结果结果在短时间内形成在短时间内形成大量的大量的 DNA DNA 片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子1.目的：目的：使目的基因使目的基因在受体细胞中稳定存在在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目并且可以遗传给下一代，同时使目的基因的基因能够表达和发挥作用能够表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程。的过程。受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达三、将目的基因导入受体细胞1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：植物体受损伤时，伤口细胞会分泌酚类化合物，吸引农杆菌，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。过程：过程：优点：优点：经济有效经济有效（2）基因枪法基因枪法 （3）花粉管通道法花粉管通道法缺点：成本较高缺点：成本较高 受体细胞受体细胞 (单子叶植物单子叶植物)我国科学家独创，转基因抗虫棉我国科学家独创，转基因抗虫棉2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：方法：显微注射技术显微注射技术程序：程序：常用的动物受体细胞：常用的动物受体细胞：受精卵和卵细胞受精卵和卵细胞3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞(吸收环境中吸收环境中DNA生理状态生理状态)表达载体表达载体(缓冲液缓冲液)与感受态细胞混合与感受态细胞混合(温度温度)感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2 2+处理法处理法三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定（一）检测（分子水平）（一）检测（分子水平）1 1、检测转基因生物的、检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因提取转基因生物的基因组提取转基因生物的基因组DNA用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用片段用放射性同位素放射性同位素等等作标记，以此做作标记，以此做探针探针使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出若显示出杂交带杂交带，表明染色体已插入染色体，表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质（1 1）方法）方法:分子杂交分子杂交方法方法:抗原抗原-抗体杂交抗体杂交（2）过程）过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若杂交，若出现出现杂交带杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA（二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫、抗病接种实验，活性比较等抗虫、抗病接种实验，活性比较等人体细胞人体细胞人体细胞人体细胞质粒质粒质粒质粒大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌目的基因目的基因目的基因目的基因(人胰岛素基因人胰岛素基因人胰岛素基因人胰岛素基因)用同一种限制酶用同一种限制酶用同一种限制酶用同一种限制酶进行酶切进行酶切进行酶切进行酶切DNADNA连接酶连接目的基因和质粒连接酶连接目的基因和质粒连接酶连接目的基因和质粒连接酶连接目的基因和质粒重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒(重组重组重组重组DNA)DNA)重组质粒导入大肠杆菌细胞重组质粒导入大肠杆菌细胞重组质粒导入大肠杆菌细胞重组质粒导入大肠杆菌细胞繁殖繁殖繁殖繁殖人胰岛素人胰岛素人胰岛素人胰岛素复制目的基因复制目的基因复制目的基因复制目的基因1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因u利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u植物、动物、微生物植物、动物、微生物4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：分子水平是否插入、转录、翻译检测：分子水平是否插入、转录、翻译u鉴定：个体水平鉴定：个体水平小节:基因工程的基本操作程序1.1.基因工程的基本工具？基因工程的基本工具？2.2.限制酶的特点？限制酶的特点？3.3.DNADNA连接酶和载体的种类？连接酶和载体的种类？4.4.基因工程的基本操作程序？基因工程的基本操作程序？5.5.获取目的基因的方法？获取目的基因的方法？6.6.基因工程的核心步骤是？基因工程的核心步骤是？7.7.基因表达载体的组成？基因表达载体的组成？8.8.将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法？将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法？9.9.目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键？目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键？10.10.目的基因的检测与鉴定的方法？目的基因的检测与鉴定的方法？复习一、植物基因工程硕果累累转基因工程技术主要用于转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力提高农作物的抗逆能力,以及以及改良农作物的品质改良农作物的品质和和利用植物生产药物利用植物生产药物等方面。等方面。(一)抗虫转基因植物杀虫基因：杀虫基因：BtBt毒蛋白基因毒蛋白基因蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因植物凝集素基因BtBt毒蛋白基因毒蛋白基因蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因植物凝集素基因产生的抑制剂可与害虫消化道的蛋白酶结合淀粉酶抑制剂抑制昆虫消化道中的淀粉酶活性合成的糖蛋白可与昆虫肠道粘膜上的某种物质结合编码的蛋白质在害虫肠道降解成有毒的多肽转基因抗虫棉转基因抗虫棉(二)抗病转基因植物病原微生物：病原微生物：主要有病毒、真菌和细菌等。主要有病毒、真菌和细菌等。抗抗病病转基因植物采用的基因：转基因植物采用的基因：抗抗真菌真菌转基因植物采用的基因：转基因植物采用的基因：病毒外壳蛋白基因（病毒外壳蛋白基因（CPCP基因）基因）病毒复制酶基因病毒复制酶基因几丁质酶基因几丁质酶基因抗毒素合成基因抗毒素合成基因(三)抗逆转基因植物可以调节细胞渗透压的基因可以调节细胞渗透压的基因抗冻蛋白基因抗冻蛋白基因抗除草剂基因抗除草剂基因(四)利用转基因改良植物的品质将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物；改变这些氨基酸合成途径中某种关键植物；改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性。酶的活性。例如：将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导例如：将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，赖氨酸含量提高入玉米，赖氨酸含量提高30%30%。将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄；转基因延熟番茄；将植物花青素代谢有将植物花青素代谢有关的基因导入花卉植关的基因导入花卉植物矮牵牛中，出现颜物矮牵牛中，出现颜色变异。色变异。二、动物基因工程前景广阔1.用于提高动物生长速度2.用于改善畜产品的品质外源生长素基因外源生长素基因将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组普通鼠和生长速度加快的普通鼠和生长速度加快的普通鼠和生长速度加快的普通鼠和生长速度加快的转基因鼠（右）转基因鼠（右）转基因鼠（右）转基因鼠（右）3.用转基因的动物生产药物乳腺生物反应器乳腺生物反应器乳房生物反应器乳房生物反应器将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。的启动子等调控组件重组在一起。获取目的基因获取目的基因（例如血清蛋白基因）（例如血清蛋白基因）构建基因表达载体构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎形成胚胎将胚胎送入母体动物将胚胎送入母体动物发育成转基因动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）个体中，转入的基因才能表达）4.用转基因的动物作器官移植的供体1、供体动物：、供体动物：2、存在的难题：、存在的难题：3、解决方法：、解决方法：将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达；制抗原决定基因的表达；或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。官。猪猪免疫排斥免疫排斥三.基因工程药品异军突起 利用基因工程方法制造利用基因工程方法制造“工程菌工程菌”，可，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。我国已生产的产品：我国已生产的产品：白细胞介素白细胞介素-2、干扰素、干扰素、乙肝疫苗等。乙肝疫苗等。近近20种，年产值达种，年产值达30亿。亿。工程菌：工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系到高效率表达的菌类细胞株系。基因工程药品干扰素化学本质：是病毒侵入动物或人体细胞后产生化学本质：是病毒侵入动物或人体细胞后产生的一种糖蛋白。的一种糖蛋白。作用：抗病毒的特效药。作用：抗病毒的特效药。干扰素产品干扰素产品干扰素产品干扰素产品四、基因治疗曙光初照1）原理：）原理：把正常基因把正常基因导入导入病人体内，使该病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。治疗疾病的目的。2）实例：）实例：复合型免疫缺陷症复合型免疫缺陷症3）基因治疗的方法）基因治疗的方法体外基因治疗：体外基因治疗：体内基因治疗：体内基因治疗：先从病人体内获得某种细胞先从病人体内获得某种细胞(T(T细胞细胞)，进行培养，进行培养，体外进行基因转移，筛选成功细胞扩增培养，体外进行基因转移，筛选成功细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。最后重新输入患者体内。直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。4）用于基因治疗的基因种类）用于基因治疗的基因种类1.1.正常基因取代病变基因；弥补病变基因；正常基因取代病变基因；弥补病变基因；2.2.反义基因产生反义基因产生mRNAmRNA与病变与病变mRNAmRNA互补；互补；3.3.编码可以杀死癌细胞的蛋白酶基因；编码可以杀死癌细胞的蛋白酶基因；知识回顾基因工程的实质是什么？基因工程的实质是什么？将将一种生物的基因一种生物的基因转移到转移到另一种生物体内另一种生物体内，后者可以产生它本来不能产生的蛋白质，进后者可以产生它本来不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状而表现出新的性状。思考：思考：基因工程有没有局限？基因工程有没有局限？基因工程产生的蛋白质有没有不足？基因工程产生的蛋白质有没有不足？1基因工程的局限性：基因工程的局限性：a a、基因工程在原则上只能生产自然界已存、基因工程在原则上只能生产自然界已存 在的蛋白质在的蛋白质b b、天然蛋白质不一定完全符合人类生产和、天然蛋白质不一定完全符合人类生产和 生活的需要生活的需要2蛋白质工程的目的：蛋白质工程的目的：生产符合人们生活需要的并生产符合人们生活需要的并非自然界已存在非自然界已存在的蛋白质的蛋白质一、蛋白质工程崛起的缘由例如：改造改造干扰素（半胱氨酸）干扰素（半胱氨酸）体外很难保存体外很难保存干扰素（丝氨酸）干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（352352位的苏氨酸）位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（104104位的天冬酰胺）位的天冬酰胺）改造改造改造改造天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 （异亮氨酸）（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍玉米中赖氨酸含量可提高数倍1蛋白质工程的概念：蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律以及与生物功能的关以蛋白质分子的结构规律以及与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。以满足人类的生产和生活的需求。2前提：前提：了解蛋白质的结构和功能了解蛋白质的结构和功能原理：原理：改造基因（基因修饰或基因合成）改造基因（基因修饰或基因合成）目的：目的：定向改造或制造蛋白质定向改造或制造蛋白质二、蛋白质工程的基本原理与基因工程的关系：蛋白质工程是在基因工程的基础上，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的延伸出来的第二代基因工程第二代基因工程。蛋白质工程流程图：预期预期功能功能DNA合成合成分子分子设计设计生物生物功能功能转录转录翻译翻译折叠折叠1.从预期的蛋白质功能出发从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构3.推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列63写在最后写在最后成功的基础在于好的学习习惯成功的基础在于好的学习习惯The foundation of success lies in good habits谢谢聆听 学习就是为了达到一定目的而努力去干,是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard,Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal
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