聚合酶链反应技术课件

聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术Polymerase Chain Reaction李伟李伟温州医科大学温州医科大学 检验医学院生命科学学院检验医学院生命科学学院7/7/20241聚合酶链反应技术李伟8/13/20231 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。由于通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。7/7/20242 聚合酶链反应（polymerase chain re主要内容主要内容第一节 聚合酶链反应技术的原理第二节 聚合酶链反应技术的常见问题及体系优化第三节 聚合酶链反应技术的方法发展及相关技术第四节 荧光定量聚合酶链反应技术第五节 聚合酶链反应方法的标准化7/7/20243主要内容第一节 聚合酶链反应技术的原理8/13/20233第一节第一节 聚合酶链反应技术的原理7/7/20244第一节 聚合酶链反应技术的原理8/13/20234一、聚合酶链反应技术的简史一、聚合酶链反应技术的简史Watson、Crick：DNA双螺旋结构Meselson、Stahl:半保留复制模型Khorana：最早提出体外扩增核酸的设想Kary.B.Mullis：发明聚合酶链反应Saiki：发现耐热DNA聚合酶7/7/20245一、聚合酶链反应技术的简史Watson、Crick：DNA双二二.聚合酶链反应技术的原理聚合酶链反应技术的原理PCR技术实际上是模拟体内DNA半保留复制过程,在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应,由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。7/7/20246二.聚合酶链反应技术的原理8/13/20236模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经25-30次循环，目的DNA增加106-7图6-1 PCR原理示意图7/7/20247模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变1234522557294时间（min）温度（）PCRPCR的基本原理的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍7/7/202481234522557294时间（min）温度（）PCR的基PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA947/7/20249PCR的基本原理PCR反应条件1234522557294时间PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9455引物1引物2DNA引物7/7/202410PCR的基本原理PCR反应条件9455引物1引物2DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶7/7/202411PCR的基本原理PCR反应条件55引物1引物2DNA引物7PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束94第2轮开始7/7/202412PCR的基本原理PCR反应条件72第1轮结束94第2轮开PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945572TaqTaqTaqTaq7/7/202413PCR的基本原理PCR反应条件945572TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束7/7/202414PCR的基本原理PCR反应条件72第2轮结束8/13/20PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增7/7/202415PCR的基本原理PCR反应条件模板DNA第1轮扩增第2轮扩增 在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步,模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需2-4min，2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。7/7/202416 在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步,模nyny图6-2-1 图6-2-2图6-2 PCR扩增效率图y=A(1+R)n y=A2n 7/7/202417nyny图6-2-1 图6-2-2图6-2 PCR扩增反应组成：（五要素）模板（template）引物(primer)预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异三、三、PCRPCR反应体系反应体系DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA7/7/202418反应组成：（五要素）三、PCR反应体系基因组DNA质粒DN-DNA 聚合酶(DNA polymerase)-dNTP:包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCR buffer:一般组成：50mM KCl,10-50mM Tris-Cl(室温PH8.3)，1.5mM MgCl2 7/7/202419 DNA 聚合酶(DNA polymerase)8/1（六）（六）PCRPCR一般方案一般方案150 ul PCR反应体系的组成1）组成：样品DNA 0.11ug；正链引物（25umol/L）1.0ul；负链引物（25umol/L）1.0ul；脱氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；10PCR缓冲液 5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；Taq DNA聚合酶12.5u；蒸馏的去离子水补至50ul。加入30ul石蜡油，短暂离心混匀。2）对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。7/7/202420（六）PCR一般方案8/13/2023202PCR仪工作参数的设置94 3060sec，553060sec，723060sec，循环30次，最后72延伸5min。3PCR产物的保存与检测PCR产物于4保存，PCR产物检测。7/7/2024212PCR仪工作参数的设置8/13/202321四四.PCR.PCR扩增产物的检测方法扩增产物的检测方法凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法 PCR产物测序 PCR-OLA（PCR-oligonucleotide ligation assay)荧光PCR7/7/202422四.PCR扩增产物的检测方法凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法、(一一)聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。7/7/202423(一)聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：8/13/20232(二二)PCR-)PCR-限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性分分析析法法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途：传染病病原体基因分型 人类基因的变异性研究。是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法7/7/202424(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerasPCR-RFLP法：限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶7/7/202425PCR-RFLP法：限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌(三三)核酸探针杂交法核酸探针杂交法1点杂交（dot blot）2反向点杂交（reverse dot blot）3微孔板杂交（microplate hybridization）4PCR-EIA：（RNA probe hybridization enzyme immunoassay,RPEIA）5Southern印迹杂交（Southern blot）7/7/202426(三)核酸探针杂交法8/13/202326点杂交（点杂交（dot blotdot blot）原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。探针：放射性同位素标记探针检测的敏感、特异，具有不稳定性和放射性危害。非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。7/7/202427点杂交（dot blot）原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙反向点杂交反向点杂交(reverse dot blot)(reverse dot blot)原理：使用带有标记物的引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性的PCR产物与之杂交。探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。用途：反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。结果分析：正常纯合子突变纯合子杂合子7/7/202428反向点杂交(reverse dot blot)原理：使用带有SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交(Southern blot)(Southern blot)7/7/202429Southern印迹杂交(Southern blot)8/1(四四)PCR-ELISA)PCR-ELISA 引物采用双标记，即一个引物5端标记便于PCR产物固定的功能基团（如生物素），另一个引物5端标记便于PCR产物检测的基团（如地高辛、荧光素等）。本法避免了电泳和杂交的步骤，适用于常规ELISA记数仪检测7/7/202430(四)PCR-ELISA 引物采用双标记，即一个引物5(五五)单单链链构构型型多多态态性性分分析析法法（PCR-Single PCR-Single Strand Strand Conformation PolymorphismConformation Polymorphism，简称，简称PCR-SSCPPCR-SSCP）本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。7/7/202431(五)单链构型多态性分析法（PCR-Single StraPCR-SSCPPCR-SSCP过程过程 -primer-32P-dNTP掺入PCR扩增产物变性单链DNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳1 2 3 4 5自显影 1.为正常结果分析2、4、5纯合患者 3.为杂合子 .解链构像DAN原 理过 程7/7/202432PCR-SSCP过程 -(六六)PCR-OLA)PCR-OLA法法(七七)PCR)PCR产物测序产物测序常用的方法:双脱氧核苷酸链末端终止法化学裂解法。用途：科研7/7/202433(六)PCR-OLA法8/13/202333第二节第二节 聚合酶链反应技术的常见问题及体系优化7/7/202434第二节 聚合酶链反应技术的常见问题及体系优化8/13/202一一.常见问题及其分析常见问题及其分析1 1假阳性假阳性PCR产物是最主要的污染源。含有靶DNA序列的质粒的污染。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。在采集标本时，其他污染源带来的污染。Taq聚合酶中带有细菌DNA，当PCR扩增片段为保守的rRNA序列时，易造成假阳性。7/7/202435一.常见问题及其分析1假阳性8/13/2023352 2假阴性假阴性假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。(1)标本处理的原因。处理标本时，靶DNA丢失。处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。7/7/2024362假阴性8/13/202336(2)PCR试剂问题。Taq DNA聚合酶失活。Mg2+浓度过低或是没有加。(3)PCR扩增过程中的问题PCR扩增仪故障。PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。(4)PCR产物鉴定中的问题电泳时没有加溴化乙锭。电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。凝胶浓度过低，使扩增带跑散。7/7/202437(2)PCR试剂问题。8/13/2023373 3引物二聚体引物二聚体形成引物二聚体的原因有：两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3端有互补区。引物模板比例太高，可增加模板用量。退火温度过低。热循环次数过多。7/7/2024383引物二聚体8/13/2023384 4非特异性非特异性PCRPCR产物产物1)造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施2）提高PCR反应特异性的办法5PCR污染及预防措施6RT-PCR 中避免RNA酶（RNase）的污染（1）去除外源RNase污染（2）抑制内源性RNase的活性7/7/2024394非特异性PCR产物8/13/202339二二.PCR.PCR反应体系的优化反应体系的优化1模板核酸2引物PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的，因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。引物设计要求：(1)引物长度;(2)分布的均衡性;(3)引物二聚体及二级结构;(4)引物3端、5端的特异性(5)引物的内部稳定性;(6)引物的特异性(7)扩增区域的二级结构7/7/202440二.PCR反应体系的优化1模板核酸 引物设计要求：8/长度1530bp，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 55%左右 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。7/7/202441 长度1530bp，过短特异性降低，过长则成本增加，产量 引物的 5 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其 5 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。引物的 3 末端碱基：原则上要求引物的3末端与模板DNA一定要配对，另外 3末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。引物3末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A.7/7/202442 引物的 5 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DN3缓冲液4Mg2+Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。7/7/2024433缓冲液8/13/2023435三磷酸脱氧核苷酸 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。6耐热DNA聚合酶 酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低7温度循环参数:（1）变性温度与时间（2）复性温度与时间（3）延伸温度与时间（4）循环数和扩增效率7/7/2024445三磷酸脱氧核苷酸8/13/202344（5）其它因素1）梯度PCR（TDPCRTouch-downPCR）根据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越1020的温度范围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火温度从选定范围的最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低15），最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度上循环25次。2）热启动PCR（hotstartPCR）由于TaqDNA聚合酶在低温时仍有一定的聚合酶活性，第一轮PCR反应前的升温过程中会出现非特异产物，而降低了PCR反应的特异性。可以通过所谓的“热启动”方式克服这一问题。7/7/202445（5）其它因素8/13/202345第三节第三节聚合酶链反应技术的方法发展及相关技术7/7/202446第三节聚合酶链反应技术的方法发展及相关技术8/13/2023一一.PCR.PCR技术的发展技术的发展巢式PCR（nested PCR）逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplex PCR)重组PCR(recombinant PCR)锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）不对称PCR（asymmetric PCR）反向PCR（inverse PCR）扩增长片段PCR（long PCR，long-distance PCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(in situ PCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR 7/7/202447一.PCR技术的发展巢式PCR（nested PCR）图6-3 巢式PCR原理示意图外引物1外引物2内引物1内引物2第一次 PCR第二次 PCR（一）巢式（一）巢式PCR PCR（nested PCR nested PCR）7/7/202448图6-3 巢式PCR原理示意图外引物1外引物2内引物1内引（二）逆转录（二）逆转录PCRPCR（reverse transcription-PCRreverse transcription-PCR，RT-PCRRT-PCR）逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增7/7/202449（二）逆转录PCR（reverse transcriptioone-stepRT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。RT-PCR时避免扩增基因组DNA常用的逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度为42）和MoMLV逆转录酶（最适温度为37），常用的逆转录引物有三种：随机引物；Oligo（dT），只适合于3端带有poly(A)尾的mRNA；特异性引物，只适合于逆转录目的RNA序列。以逆转录产物cDNA为模板，再做PCR。7/7/202450one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆（三）多重（三）多重PCRPCR（multiplex PCRmultiplex PCR）PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率太低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。7/7/202451（三）多重PCR（multiplex PCR）8/13/2用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物7/7/202452用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物8/13/2023引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，变性和复性延伸异源部分双链DNA形成5555533333333333555555PCR引物a引物d 再次 PCR5533图图图图6-4 6-4 6-4 6-4 重组重组重组重组PCRPCRPCRPCR原理示意图原理示意图原理示意图原理示意图（四）重组（四）重组PCRPCR（recombinant PCRrecombinant PCR）7/7/202453引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，变性和复性（五）锚定（五）锚定PCRPCR（anchored PCRanchored PCR，APCRAPCR）7/7/202454（五）锚定PCR（anchored PCR，APCR）8/1（六）不对称（六）不对称PCR（asymmetric PCR）其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50100:1。在PCR最初 10-15个 循 环 中，扩 增 产 物 主 要 是 双 链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求。7/7/202455（六）不对称PCR（asymmetric PCR）8/13/已知序列PCR用途用途：未知序列的研究未知序列的研究限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶X酶切连接未知序列（七）反向（七）反向PCRPCR（inverse PCRinverse PCR）7/7/202456已知序列PCR用途：限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶连AgAb生物素化的DNAAg-Ab复合物DNA-连接分子复合物连接分子检测PCRAg-Ab-连接分子-DNA-复合物图图图图6-56-56-56-5免疫免疫免疫免疫PCRPCRPCRPCR原理示意图原理示意图原理示意图原理示意图（八）免疫（八）免疫PCRPCR（immunol PCRimmunol PCR）7/7/202457AgAb生物素化的DNAAg-Ab复合物DNA-连接分子复（九）原位（九）原位PCRPCR（in situ PCRin situ PCR）原位PCR技术是PCR技术和原位杂交技术结合的产物，其基本过程是，先用合适的固定剂（通常为甲醛固定剂如中性甲醛）对组织或细胞进行固定，然后用蛋白酶对细胞进行通透处理，以确保PCR试剂进入细胞并同靶序列接触，最后于Eppendorf管中或载玻片对DNA和RNA进行细胞内原位扩增。然后进行产物分析并用显微镜观察结果。7/7/202458（九）原位PCR（in situ PCR）8/13/2023直接法原位直接法原位PCRPCR 特点：特点：PCRPCR扩增时用标记扩增时用标记dNTPdNTP或引物或引物,使扩增产物直接使扩增产物直接 标记标记标记物：标记物：常用同位素、生物素、地高辛常用同位素、生物素、地高辛操作程序：操作程序：组织细胞制备：组织细胞制备：固定、预处理固定、预处理原位扩增：引物原位扩增：引物,TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶,标标记记dNTPdNTP扩增产物检测：放扩增产物检测：放射自显影，射自显影，ICCICC7/7/202459直接法原位PCR 组织细胞制备：固定、预处理原位扩增：引物,优点：优点：操作简便、流程短、省时操作简便、流程短、省时 缺点：缺点：特异性差，假阳性率高特异性差，假阳性率高（固定、包埋、制片等使（固定、包埋、制片等使 标本内标本内DNADNA受损，受损，DNA DNA修复时，标记修复时，标记dNTPdNTP进入非靶进入非靶 序列；引物与模板的错配）序列；引物与模板的错配）扩增效率低扩增效率低 不适用于切片标本不适用于切片标本（切片比细胞标本（切片比细胞标本DNADNA受损重）受损重）7/7/202460 优点：操作简便、流程短、省时8/13/202360间接法原位间接法原位PCRPCR 特点：特点：PCRPCR体系中体系中dNTPdNTP和引物均不标记和引物均不标记 PCR PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交扩增结束后用标记探针行原位杂交标记物：标记物：以生物素、地高辛较为常用以生物素、地高辛较为常用操作程序：操作程序：组织细胞制备：组织细胞制备：固定、预处理固定、预处理渗入和原位扩增：渗入和原位扩增：dNTP，引物，引物,TaqDNA聚合酶聚合酶扩增产物检测：扩增产物检测：ICC原位杂交：原位杂交：用特异性标记用特异性标记探针探针7/7/202461间接法原位PCR 组织细胞制备：固定、预处理渗入和原位扩增：目前最常用目前最常用 优点：优点：扩增效率高扩增效率高 特异性强特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增 产物中的非靶序列结合）产物中的非靶序列结合）可用于细胞制备和石蜡切片标本可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：缺点：操作复杂操作复杂7/7/202462目前最常用8/13/202362（十）定量（十）定量PCRPCR（Quantitive Polymerase Chain ReactionQuantitive Polymerase Chain Reaction，QPCRQPCR）1PCR定量DNA一个或两个拷贝的特定靶序列的细胞株即是标准的一个理想来源，也可使用含特定靶序列的质粒DNA作为对照，将待检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，检测PCR产物，即可推知靶序列的含量。2PCR定量mRNA(1)mRNA相对定量(2)竞争性PCR定量mRNA(3)cRNA标准曲线法定量mRNA7/7/202463（十）定量PCR8/13/202363二二.PCR.PCR相关技术相关技术（一）核酸序列依赖性扩增（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）核酸序列依赖性扩增，又称自主序列复制（self-sustained sequence replication，SSR），主要用于RNA的扩增、检测及测序。7/7/202464二.PCR相关技术（一）核酸序列依赖性扩增（nucleic引物A靶RNA引物BRNAcDNART355535353cDNAcDNA模板 553353引物BRNAseHRTT7RNA聚合酶 100-1000 RNA扩增子53533535引物A355RNAseHRNARNAcDNAcDNA图图图图6-6 NASBA6-6 NASBA6-6 NASBA6-6 NASBA原理示意图原理示意图原理示意图原理示意图引物A 5端带有T7RNA聚合酶结合位点，3端碱基与靶RNA 3端序列互补，引物B的碱基序列与cDNA 3端序列互补7/7/202465引物A靶RNA引物BRNAcDNART355535（二）连接酶链反应（二）连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR）连接酶链反应，又称连接酶扩增反应（ligaseamplificationreaction,LAR），是一种新的DNA体外扩增技术。7/7/2024668/13/202366355353535353引物A引物B引物A引物B连接产物553335图图图图6-7 LCR6-7 LCR6-7 LCR6-7 LCR示意图示意图示意图示意图7/7/202467355353535353引物A引物B引在分子生物学工作中，常用到PCR产物克隆技术，以便对PCR产物进行进一步研究，如测序、转录分析、RNase保护测定等。PCR产物克隆常用的方法有：平端克隆法、粘端克隆法、无连接酶亚克隆法。三三.PCR.PCR产物的克隆产物的克隆7/7/202468在分子生物学工作中，常用到PCR产物克隆技术，以便对PCR产（一）平端克隆法（二）粘端克隆法1.引物5端引入限制性核酸内切酶位点2.T4DNA聚合酶回切产生粘端 如图6-8所示3.T载体（Tvector）法（三）无 连 接 酶 亚 克 隆 法（ligase-free subcloning，LFS）该方法无需使用连接酶，直接用PCR将PCR产物构建到载体上去，故称无连接酶亚克隆法。如图5-9所示7/7/202469（一）平端克隆法 8/13/20236920bp 引物25 CGATTTCCCGGTGC520bp 引物1CGATTTCGCACCGGGCTAAAGCGTGGCC5335CGATTTCGCATAAAGCGTGGCC5335PCR及PCR产物纯化在仅有dATP和dTTP存在时，T4DNA聚合酶切除产物3端的C和GXmaI粘性末端粘性末端AccI粘性末端粘性末端图图图图6-8 T4DNA6-8 T4DNA6-8 T4DNA6-8 T4DNA聚合酶回切产生粘端示意图聚合酶回切产生粘端示意图聚合酶回切产生粘端示意图聚合酶回切产生粘端示意图7/7/20247020bp 引物25CGATTTCCCGGT35355353355335535335355353355335355335533553引物a引物bPCR异源部分双链DNA的形成A管B管PCR(循环1)引物a 引物c引物d引物bPCR(循环2-15)混合AB两管，变性和复性环化转化大肠杆菌图图图图6-9 6-9 6-9 6-9 无连接酶亚克隆法示意图无连接酶亚克隆法示意图无连接酶亚克隆法示意图无连接酶亚克隆法示意图7/7/202471353553533553355第四节第四节荧光定量聚合酶链反应技术7/7/202472第四节荧光定量聚合酶链反应技术8/13/202372荧 光 定 量 PCR（Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction FQ-PCR）基于荧光能量传递技术（Fluorescence resonance energy transfer FRET）,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色团转移到受体发色团,转移效率与两个发色团之间距离的6次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。在PCR反应体系中，FQ-PCR的荧光标记物可分为两种：荧光染料标记和荧光探针标记。7/7/202473荧光定量PCR（Fluorescence Quantitiv荧光染料法SYBR green:特异性结合双链，释放荧光信号荧光探针法1.Taqman技术2.molecular Beacon技术3.复合探针法7/7/202474荧光染料法8/13/202374 SYBR荧光染料 SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。7/7/202475 SYBR荧光染料8/13/202375SYBR-Green I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission双链荧光染料图图图图6-10 SYBR-Green I6-10 SYBR-Green I6-10 SYBR-Green I6-10 SYBR-Green I荧光染料原理示意图荧光染料原理示意图荧光染料原理示意图荧光染料原理示意图7/7/202476SYBR-Green I5353SGExcitatiSYBR-Green I5353SGSGSGSGSGExcitationEmission7/7/202477SYBR-Green I5353SGSGSGSGSG图图图图6-11 TaqMan6-11 TaqMan6-11 TaqMan6-11 TaqMan技术原理示意图技术原理示意图技术原理示意图技术原理示意图3端的荧光Q分子吸收5端荧光R分子的荧光信号 探针5端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来 荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例 5353QRQ53R53激发激发5353激发激发RQ引物Taq 酶二二.荧光探针法荧光探针法7/7/202478图6-11 TaqMan 技术原理示意图3端的荧光Q分子吸图图图图6-12 6-12 6-12 6-12 双探针技术原理示意图双探针技术原理示意图双探针技术原理示意图双探针技术原理示意图荧光淬灭的程度与起始模板数的量成正比 RQQ 淬灭探针 R 发光探针Taqman技术的延伸7/7/202479图6-12 双探针技术原理示意图荧光淬灭的程度与起始模板2 2MolecularbeaconMolecularbeacon技术技术(分子灯塔法分子灯塔法)RQ激发激发RQQR激发激发发射发射分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭 单链寡核苷酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交探针5和3端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光 工作原理发夹形的寡聚核苷酸探针 内部淬灭的荧光团7/7/2024802Molecularbeacon技术(分子灯塔法)RQX激3 3复合探针法（复合探针法（complex probescomplex probes）该法的基本原理是首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5端杂交。Q淬 灭 Q 淬灭探针 R 发光探针RR7/7/2024813复合探针法（complex probes）Q淬 灭 三三.FQ-PCR.FQ-PCR的应用前景及展望的应用前景及展望FQ-PCR的出现，简化了mRNA的可重复定量和检测过程，并可精确定量。FQ-PCR反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高，结果准确，且不必使用对人体有害的染色剂，与传统PCR相比有明显的优势。因此，FQ-PCR的出现，不仅克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题，使得PCR技术更广泛地应用于临床，在监测患者病情、预后、指导用药等方面有着广阔的应用前景，而且在核酸的检测应用中，在临床诊断或大规模的人群分子流行病学调查中，在肿瘤、遗传病研究，尤其是基因表达方面的研究，都有广阔的应用前景。7/7/202482三.FQ-PCR的应用前景及展望FQ-PCR的出现，简化了第五节第五节 聚合酶链反应方法的标准化7/7/202483第五节 聚合酶链反应方法的标准化8/13/202383PCR技术的最大优点是具有极高的敏感性。然而正因如此和由于PCR反应过程中所受的人为因素的影响，与以往其他任何一种检验诊断技术相比，其结果都较易受到各种自身和外部因素的影响。所以，制定一套适应当前基因诊断实验的基本要求并使PCR技术标准化的操作程序已迫在眉睫。7/7/202484PCR技术的最大优点是具有极高的敏感性。然而正因如此和由于P一.PCR实验诊断的基本原则二.PCR操作程序标准化 （一）上岗人员培训制度 （二）标准化PCR诊断实验室 （三）PCR标准化操作程序 1试剂配制、分装及保存 2标本的采集与处理 3基因扩增及其实验条件的选择 4扩增产物检测 5PCR结果的判读 （四）污染的预防及污染源的标准化处理7/7/202485一.PCR实验诊断的基本原则8/13/202385随着以基因的体外扩增（PCR）技术为核心的疾病基因诊断的发展，临床PCR基因诊断的标准化已受到越来越多的重视。但由于现代分子生物学技术的发展，可用于临床基因检测的技术非常之多，因而在短时间内对以PCR技为主的临床基因诊断（或检测），难以很快形成一个较为完善的和完整的标准化体系或系统。因此聚合酶链反应的标准化过程任重道远，需要我们分子检验工作者共同不懈的努力。7/7/202486随着以基因的体外扩增（PCR）技术为核心的疾病基因诊断的发展