现代抗体技术和其应用培训课件

现代抗体技术和其应现代抗体技术和其应用用抗体（抗体（antibody,Ab)antibody,Ab)是是B B细胞识别抗细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。具有免疫功能。免疫球蛋白（免疫球蛋白（ImmunoglobulinImmunoglobulin，IgIg）是指具有抗体活性或化学结构是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白与抗体相似的球蛋白抗体和免疫球蛋白的关系抗体都是免疫球蛋白，并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性。2现代抗体技术和其应用3现代抗体技术和其应用免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的基本结构四肽构四肽构，链间二硫键连接，链间二硫键连接两条重链链结（两条重链链结（H H）和两条轻链（和两条轻链（L L）氨基端和羧基端氨基端和羧基端。4现代抗体技术和其应用 1.重链与轻链重链与轻链(1)(1)根据重链分类：根据重链分类：根据重链靠近羧基末端氨基酸根据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列顺序不同，将重链组成及排列顺序不同，将重链分为种：分为种：、根据重链组成不同，将根据重链组成不同，将IgIg分为分为五类：五类：IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、IgDIgD、IgEIgE(2)(2)根据轻链分型：根据轻链分型：、型型5现代抗体技术和其应用2.可变区与恒定区可变区与恒定区根据氨基酸排列顺序的不同分为根据氨基酸排列顺序的不同分为可变区（可变区（V V）和恒定区（和恒定区（C C）可变区（可变区（V V区）：区）：氨基酸组成、排氨基酸组成、排列顺序变化较大列顺序变化较大恒定区（恒定区（C C区）：氨基酸数量、种区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳类、排列顺序及含糖量都比较稳定定6现代抗体技术和其应用抗原抗体结合抗原抗体结合抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导的肉眼可见的反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。7现代抗体技术和其应用抗原抗体结合力抗原抗体结合力抗原抗体是一种非共价的结合，不形成共价键抗原抗体是一种非共价的结合，不形成共价键1.静电引力：是因抗原、抗体带有相反电荷的氨基与羧基基团间相互吸引的能力。2.范德华引力：是抗原、抗体两个大分子外层轨道上电子相互作用时，两者电子云中的偶极摆动而产生的引力。这种引力的能量小于静电引力；3.氢键结合力：是供氢体上的氢原子与受氢体上氢原子间的引力。其结合力较强于范德华引力；4.疏水作用力：当抗原表位和抗体超变区靠近时，相互间正负极性消失，周围亲水层也立即失去，从而排斥两者间的水分子，使抗原抗体进一步吸引和结合。疏水作用力是这些结合力中最强的，因而对维系抗原抗体结合作用最大。8现代抗体技术和其应用抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点特异性、比例性、可逆性。特异性（specificity）是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。比例性（proportionality）是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原稍过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。可逆性（reversibility）是指抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离恢复为抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离后的抗原抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性。9现代抗体技术和其应用抗体技术抗体技术第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonalantibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。10现代抗体技术和其应用11现代抗体技术和其应用多克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体：有多个B细胞克隆所产上的对特定抗原所产生的一组免疫球蛋白混合物，每种免疫球蛋白能识别抗原分子上一个表位。所获得的的血清实际上是含有多种抗体的混合物。12现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备1.制备抗原2.选择实验动物3.动物免疫4.试取血进行测试效价，看看是否成功免疫5.如果成功免疫，处死实验动物，采集全部血清6.纯化抗体7.鉴定抗体，包括纯度以及特异性13现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-1.制备抗原制备抗原1颗粒抗原制备细胞抗原细菌类抗原2可溶性抗原纯化纯化常用的方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、免疫吸附亲和层析法。3半抗原的免疫原制备法半抗原：多肽，甾族激素，药物，脂肪胺，核苷等小分子物质仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，而它们本身并不是免疫原，不能刺激机体产生抗体。半抗原免疫原制备:将小分子半抗原制备成免疫原通常可用物理吸附方法和化学方法。14现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-2.选择实验动物选择实验动物u供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。u动物的免疫应答受动物的遗传基因影响，同一种系的动物对不同抗原的免疫应答和不同种系的动物对同一抗原的免疫应答均不尽相同。抗原的来源与免疫动物的亲缘较远，产生的抗体效价高，同种系或亲缘较近，产生的抗体的效价就差。u如果需要大量抗体，则用大动物；如要获得直接标记诊断的抗体，则用本种动物；如要获得间接标记诊断的抗体，则用异源动物；如抗原量少，且难以获得，则用纯系小鼠；一般实验室用的抗体，多用兔或者鼠。对于用于诊断的抗体，最好用SPF级动物。15现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫抗原剂量：抗原剂量：抗原的免疫剂量应根据抗原的免疫原性强弱、抗原来源难易、动物的种类、免疫周期等来选择抗原剂量。免疫剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般情况下，小鼠的首次免疫剂量为50g400g/次，大鼠为100g1000g次，家兔为500g1000g/kg/次，加强剂量为首次剂量的1213。16现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫注射途径：注射途径：抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。吸收越快，分解代谢越快，对机体影响的时间越短。吸收越快，单位时间的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，毒副作用也越强。根据免疫应答过程中各阶段的特点，选择注射途径。常用的途径有：静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮下、皮内、掌内、跖内皮下。对抗原吸收的速度：静脉=脾脏=淋巴结腹腔肌肉皮下皮内掌内=跖内皮下。基础免疫应选择缓慢吸收的途径，延长抗原刺激时间。17现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫加强免疫时间：加强免疫时间：与抗原的理化性质、剂量、进入途径、机体状况和所处的免疫应答阶段有关。抗原理化性质稳定，吸收分布速度慢或机体处于免疫应答的早期，应延长间隔时间。两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般情况下，第一次加强免疫应在基础免疫后的23周，以后每710天加强一次。加佐剂间隔时间应为2周左右。注射的Ig纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。18现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫加强免疫次数：加强免疫次数：抗原的免疫原性强弱和动物对抗原的敏感性有关。抗原免疫原性弱，需多次加强才能获满意的抗血清。得制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂。量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。最简单的方法是直接检测血清中的抗体滴度，观察免疫效果。19现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫佐剂的概念和种类佐剂的概念和种类佐剂的概念：佐剂是非特异性的免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂的种类佐剂的种类1）微生物及其产物：如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗)短小棒状杆菌、白日咳杆菌、革兰氏阴性菌的内毒素。2）无机化合物：氢氧化铝、明矾等3）合成佐剂：如双链多聚肌胞苷酸（polyI:C)4）油剂：如弗氏佐剂、矿物油、植物油20现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫佐剂的生物学作用佐剂的生物学作用增加抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原物质变成有效的免疫原；提高抗体的滴度，提高初次免疫应答和再次免疫应答抗体的滴度；改变抗体的类型，由产生IgM转变成IgG；引起或增强迟发型超敏反应。佐剂的作用机制佐剂的作用机制改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长体内存留的时间，从而更有效的刺激免疫系统；刺激单核巨噬细胞增强其对抗原的处理和递呈能力；刺激淋巴细胞增生和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应。21现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫方法一：淋巴结注射法A.在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗50mg（每侧约0.30ml）。7-10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；B.于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的乳化抗原0.50ml（含抗原蛋白5mg/ml，青霉素1000U/ml，链霉素1000g/ml）；C.必要时，14天后，重复步骤B一次；D.再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的乳化抗原0.50ml（含抗原蛋白5mg/ml，青霉素1000U/ml，链霉素1000g/ml）；E.5-7天后，耳静脉采血。测定血清效价。22现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫方法二皮下多点注射法A.家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原0.1ml，5mg/ml）；B.7-10天后，脊柱两侧多点（颈，胸，腰椎各两点，共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.5ml；C.7-10天后，脊柱两侧重复注射一次；D.7-10天后试血，不合格者重复步骤D。23现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-3.动物免疫动物免疫方法三多途径联合注射法A.两侧掌（跖）内侧皮下注射含有完全佐剂抗原0.5ml，5mg/ml）；B.14天后，多点皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.5ml；C.7天后，耳静脉注射不含有佐剂的抗原2ml；D.测定血清抗体效价，不合格者重复步骤C，并适当递增抗原量。24现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-4.效价评价效价评价1.琼脂扩散法原理：用半固体琼脂凝胶作为介质，可溶性抗原，抗体在其中能自由扩散。将可溶性抗原和抗体分别加入琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如果抗原和抗体相对应，则在两者比例适当处形成白色沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。25现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-4.效价评价效价评价2.ELISA法（一般用于可溶性抗原）若ELISA效价达到5,000以上(即血清稀释5,000倍浓度在ELISA有50%最高呈色)，即可进行全部采血。26现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-4.效价评价效价评价3.凝集法原理：颗粒型抗原（完整的病原微生物或者红细胞等）与相应抗体相结合，在有电介质存在的条件下，经过一定的时间，出现肉眼可见的凝集小块。血清效价代表血清中康天一的含量，血清效价越高，所含抗体的量越多。例如，伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1:80以上才有诊断价值。一般当效价达到1：1600到1:3200即可采血。27现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-5.血清制备血清制备最后一次取血可以采用颈动脉放血（以家兔为例）在收集全血时加入肝素抗凝，对收集到的全血在室温下静置2hr后，4000rpm离心20min，取出上层血清后，每5mL分装一管，冷冻保存20待用。28现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-6.抗体纯化抗体纯化一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等1.1.亲和纯化亲和纯化亲和纯化亲和纯化原理：蛋白原理：蛋白A是从是从Staphylococcusaureus中获得，可与抗体重链中获得，可与抗体重链的的Fc片段相结合。现在已知蛋片段相结合。现在已知蛋白白A可与多种哺乳动物的可与多种哺乳动物的IgG相相结合也可与某些结合也可与某些IgM和和IgA相结相结合。如果将蛋白合。如果将蛋白A与固相载体相与固相载体相连，例如连，例如sepharoseCL-4B，这种填料可以成为分离和纯化不这种填料可以成为分离和纯化不同类型，不同亚类抗体或抗体片同类型，不同亚类抗体或抗体片断的重要工具。断的重要工具。29现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-6.抗体纯化抗体纯化2.2.盐析法盐析法原理：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。30现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-6.抗体纯化抗体纯化 盐析法实验步骤盐析法实验步骤取1Xml血清加1Xml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2Xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。4沉降3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm），20min，丢弃上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。置4沉降3h以上。重复上述第二步过程12次。末次离心后所得沉淀物为-球蛋白，以0.02%mol/lpH7.4pbs溶解至xml装入透析袋。对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。31现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-6.抗体纯化抗体纯化3.3.DEAEDEAE离子交换层析法离子交换层析法离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体原理：DEAE是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上，然后用增加盐浓度的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。32现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-6.抗体纯化方法比较抗体纯化方法比较33现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-7.抗体鉴定抗体鉴定1.纯度的鉴定区带电泳、高效液相色谱、高压毛细管电泳采用区带电泳的方法。若只出现一条蛋白区带说明抗体纯化已达到要求。2.特异性抗体的特异性鉴定一般采用相似的抗原与待鉴定抗体反应。如果出现交叉反应，说明有交叉抗体的存在。此时，可用相应抗原吸收，以提高抗体的特异性。抗体的特异性以交叉反应率表示，其计算方法如下：交叉反应率=待测抗原50%结合时的浓度/待鉴定类似物50%结合时的浓度100%34现代抗体技术和其应用多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备-7.抗体鉴定抗体鉴定3.亲和性抗体的亲和力（affinity）是指抗原与抗体结合的牢固程度。亲和力越大表示抗体的结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离。亲和力的大小是由分子的大小、抗体结合的位点、以及抗原决定簇之间的立体构型的适合程度决定的。亲和力决定实验方法的灵敏度。因此，亲和力是评价抗体质量的重要指标。抗体亲和力的大小以亲和常数表示，亲和常数就是表示抗血清中抗体分子的浓度。可用饱和曲线法进行计算。35现代抗体技术和其应用单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 将一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体36现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备制备一般包括以下几个步骤：1.制备抗原2.选择实验动物3.动物免疫4.试取血进行测试效价，看看是否成功免疫37现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备-5.细胞融合B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体小鼠骨髓瘤细胞不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同38现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-5.细胞融合细胞融合培养骨髓瘤细胞：培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用避免细胞返祖：定期用8-AG8-AG处理细胞处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-8080或液氮及干冰中或液氮及干冰中免疫脾细胞的制备：免疫脾细胞的制备：1110108 8的的淋巴细胞淋巴细胞 无菌手术无菌手术39现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备-5.细胞融合饲养细胞饲养细胞细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞，其中MQ还有清除死亡细胞的作用；饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化制备方法：用冷冻的果糖液注入小鼠的腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含有小鼠的腹腔细胞，其中有巨噬细胞和其他细胞。在制备饲养细胞时候，切记针头刺破动物的消化器官，否则所获得的的细胞会有严重污染。饲养细胞调至100000/ml，提前一天或者当天置板孔中培养。40现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-5.细胞融合细胞融合融合剂融合剂l1962年Okada首先用仙台病毒（流感病毒）诱导细胞融合成功，自发的动物细胞发生融合频率很小，但当加入病毒后，细胞融合的频率显著增大，因病毒的磷脂包膜与动物细胞膜十分相似，某些病毒的糖蛋白还有促进细胞融合的功能，仙台病毒已成为公认的细胞融合剂。l聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）作为细胞融合剂，它可使邻近的细胞膜粘合，继而使细胞合并起来。l电穿孔融合术41现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备-5.细胞融合小白鼠脾脏细胞B与NS-1细胞N以PEG进行融合，操作在10min內完成，随即把细胞平均分配在96槽细胞培养盘中。42现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备-6.初步筛选H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T（Thymidine）：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA正常B细胞利用HAT培养液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，在次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGRPT）和胸腺嘧啶激酶(TK)的催化下经旁路合成DNA。骨髓瘤细胞是遗传基因缺陷型的细胞系，缺乏HGRPT或TK。43现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备-6.初步筛选SP2/O:HGPRT-，TK-;长长命命脾细胞脾细胞:HGPRT+，TK+;短命短命(7(7天天)杂交杂交瘤细胞瘤细胞:HGPRT+，TK+;长长命命杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：长期生长繁殖长期生长繁殖利用淋巴细胞的利用淋巴细胞的HGPRT，将，将H合成为嘌呤碱并最合成为嘌呤碱并最终与终与T一起合成一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力HATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的主要途合成的主要途径被径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺乏，缺乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻44现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备-7.专一性筛选筛选专一性抗体：并非所有B细胞都会产生我们所要的抗体，小白鼠原先就存在许多B细胞株对抗一般的疾病，因此要用ELISA方法挑选出专一性抗体45现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-8.单株化单株化阳性杂交瘤细胞的克隆化培养阳性杂交瘤细胞的克隆化培养阳性杂交瘤细胞的克隆化培养阳性杂交瘤细胞的克隆化培养l有限稀释法有限稀释法(limitingdilution)l显微操作法显微操作法(micromanipulation)lFACS法（法（fluorescenceactivatedcellsorter）l软琼脂平板法软琼脂平板法(softagarmethod)46现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-8.单株化单株化有限稀释法有限稀释法有限稀释法有限稀释法ELISAELISA所挑出來的所挑出來的细胞细胞株，株，也许也许仍含有仍含有两两群以上的群以上的细胞细胞，因此要，因此要进行单株进行单株化化 。先。先将该细将该细胞株稀释胞株稀释，重新平分到，重新平分到9696槽細胞槽細胞培养盘培养盘中，中，计算计算使得每槽中只含一個使得每槽中只含一個细胞细胞，待待其生長成群落其生長成群落后后，再次以，再次以ELISAELISA筛选出专一性抗体。筛选出专一性抗体。47现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-8.单株化单株化FACSFACS法法法法应用应用FACS将特异性杂将特异性杂交瘤细胞选出单个放交瘤细胞选出单个放入入96孔培养板中培养孔培养板中培养效率最高效率最高价格昂贵价格昂贵48现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-8.单株化单株化显微操作法显微操作法(micromanipulation)(micromanipulation)即在显微镜下，用毛细吸管挑选一个细胞进行培养。即在显微镜下，用毛细吸管挑选一个细胞进行培养。琼脂空斑法琼脂空斑法琼脂空斑法琼脂空斑法 将软琼脂中特异空斑，再在空斑中心取细胞将软琼脂中特异空斑，再在空斑中心取细胞49现代抗体技术和其应用杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存细胞冻存液液(30%(30%40%40%牛血清，牛血清，50%50%60%RPMI-164060%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”：分步冷冻，分步冷冻，30-7030-70液氮液氮“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速水浴中，使其迅速融化、复苏融化、复苏防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡50现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-9.抗体生产以及纯化抗体生产以及纯化1)1)可把可把挑选挑选出來的融合出來的融合细胞细胞打入小鼠腹部，打入小鼠腹部，诱生肿瘤诱生肿瘤，然后然后以以针头针头收集所收集所产生产生的的腹水，通常可取得腹水，通常可取得15 mL15 mL左右；腹水中的左右；腹水中的抗抗体浓度体浓度非常高，每非常高，每mLmL可可达数达数mgmg。2)2)把融合細胞在大型把融合細胞在大型培培养养槽中槽中培养培养，收集，收集培养培养液液上清即得上清即得抗体抗体，但每，但每mLmL只得只得约数约数mgmg，浓浓度较腹水稀度较腹水稀约约一千倍。最一千倍。最近有一近有一种种細胞細胞培养培养瓶，可瓶，可产生产生如腹水般如腹水般浓浓度的上清，度的上清，但但价格极为昂贵价格极为昂贵(IBS(IBS Integra Bioscience:Integra Bioscience:IntegraCelline)IntegraCelline)。51现代抗体技术和其应用单克隆抗体制备单克隆抗体制备-10.抗体性质鉴定抗体性质鉴定52现代抗体技术和其应用多克隆抗体与单克隆抗体的比较多克隆抗体与单克隆抗体的比较多克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体来源来源动物免疫血清、恢复期病人动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群血清或免疫接种人群多为鼠源性多为鼠源性特点特点来源广泛、制备容易来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成少或无血清交叉反应、制备成本低本低组成组成针对不同抗原表位的抗体的针对不同抗原表位的抗体的混合物混合物针对单一表位，结构和组成高针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型度均一，抗原特异性及同种型一致一致应用应用疾病的被动免疫治疗疾病的被动免疫治疗广泛用于疾病诊断、特异性抗广泛用于疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药的被动免疫治疗和生物导向药物制备物制备缺点缺点特异性不高、易发生交叉反特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备应，不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反人体应用后可导致人鼠抗体反应应53现代抗体技术和其应用抗体分子的改造和基因工程抗体分子的改造和基因工程u自1975年Catton和Milstein等研究制造出单克隆抗体（MAb）技术以来，获得了迅速的发展和极为广泛的应用。但也确实存在不少难以克服的问题，如绝大多数的Mab是鼠源性的，对人有较强的免疫原性。如果用于人的治疗，不出2周就会产生人对鼠血清的免疫应答，患者体内存在的人抗鼠抗体（humananti-mouseantibody,HAMA），不仅降低了疗效，严重的可引起患者出现血清病。u20世纪80年代中期人们开始尝试以基因工程方法改造鼠源性McAb,亦即所谓McAb的“人源化”。1989年底英国剑桥Winter小组与Scripps研究所Lerner小组的创造性工作。他们利用PCR技术克隆机体全部的抗体基因,并重组于原核表达载体中,用标记抗原就可筛选到相应抗体,当时称为组合抗体库技术。u20世纪90年代初期,这一技术有了进一步发展,即将抗体基因与单链噬菌体(M13,Fd等)的外壳蛋白融合并表达于噬菌体表面,以固相的抗原吸附相对应的噬菌体抗体,经多次“吸附-洗脱-扩增”即可获所需抗体。54现代抗体技术和其应用基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体又称重组抗体基因工程抗体又称重组抗体基因工程抗体又称重组抗体基因工程抗体又称重组抗体,是指利用重组是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配要进行加工改造和重新装配,经转染适当的受经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。体细胞所表达的抗体分子。目前报道的基因工程抗体很多目前报道的基因工程抗体很多,分类方法不一分类方法不一,大大体可以分为三类：体可以分为三类：n第一类，完整的抗体分子第一类，完整的抗体分子n第二类，抗体分子片段第二类，抗体分子片段n第三类，新型抗体分子第三类，新型抗体分子55现代抗体技术和其应用通过基因重组改良抗体性能通过基因重组改良抗体性能小分子抗体（穿透力强）小分子抗体（穿透力强）人源化抗体（降低抗原性）人源化抗体（降低抗原性）双价或双特异性抗体（增强抗体的亲和力及效双价或双特异性抗体（增强抗体的亲和力及效靶细胞的相互作用）。靶细胞的相互作用）。抗体融合蛋白（增加蛋白的半衰期；与药物，抗体融合蛋白（增加蛋白的半衰期；与药物，毒性分子或酶基因融和表达，可用于肿瘤等疾毒性分子或酶基因融和表达，可用于肿瘤等疾病的治疗）。病的治疗）。细胞内抗体（用于胞内治疗或信号转导研究）。细胞内抗体（用于胞内治疗或信号转导研究）。56现代抗体技术和其应用基因工程抗体基因工程抗体-1.完整的抗体分子完整的抗体分子 嵌合抗体嵌合抗体嵌合抗体嵌合抗体 人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体 完全人源抗体完全人源抗体完全人源抗体完全人源抗体57现代抗体技术和其应用部分已批准上市的治疗性单抗部分已批准上市的治疗性单抗58现代抗体技术和其应用嵌合抗体嵌合抗体(chimericantibody)由在基因水平上连接的小鼠抗体由在基因水平上连接的小鼠抗体V区及人抗体区及人抗体C区组成。这种抗体含区组成。这种抗体含75%80%人抗体人抗体,20%鼠抗体鼠抗体,保留保留了原来鼠源单抗的特异性了原来鼠源单抗的特异性,但对人体仍但对人体仍具一定的免疫原性。具一定的免疫原性。59现代抗体技术和其应用嵌合抗体嵌合抗体(chimericantibody)60现代抗体技术和其应用嵌合抗体嵌合抗体(chimericantibody)61现代抗体技术和其应用人源化抗体人源化抗体(humanizedantibody)通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区（通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区（CDRCDR），使构成抗），使构成抗原结合部位的轻重链各原结合部位的轻重链各33个个CDRCDR区是鼠源的区是鼠源的,其余均为其余均为人源的。该抗体对人的免疫原性大大降低人源的。该抗体对人的免疫原性大大降低,但与抗原的亲但与抗原的亲和力也有所下降。虽然目前通过选择与鼠单抗同源性大的和力也有所下降。虽然目前通过选择与鼠单抗同源性大的抗体及改变骨架抗体及改变骨架(fragmentregion,Fr)(fragmentregion,Fr)上某些关键的氨上某些关键的氨基酸残基或遮蔽鼠单抗基酸残基或遮蔽鼠单抗CDRCDR表面的残基表面的残基(veneering)(veneering)等方等方法法,人源化抗体与抗原的亲和力只能达到原先鼠源单抗的人源化抗体与抗原的亲和力只能达到原先鼠源单抗的33%33%35%35%。62现代抗体技术和其应用人源化抗体人源化抗体(humanizedantibody)63现代抗体技术和其应用完全人源抗体完全人源抗体 首先把小鼠编码首先把小鼠编码IgIg重轻链的基因剔除。制备表达人的重轻链的基因剔除。制备表达人的IgIg重轻链的转基因小鼠。重轻链的转基因小鼠。上二种小鼠回交，获得只表上二种小鼠回交，获得只表达人达人IgIg重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体可产生完全人源抗体64现代抗体技术和其应用完全人源抗体完全人源抗体用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体关键点：建立好的人骨髓瘤细胞。关键点：建立好的人骨髓瘤细胞。稳定性高和融稳定性高和融合率高合率高 65现代抗体技术和其应用展示技术展示技术66现代抗体技术和其应用噬菌体展示技术噬菌体展示技术67现代抗体技术和其应用噬菌体抗体展示技术噬菌体抗体展示技术68现代抗体技术和其应用噬菌体展示抗体技术噬菌体展示抗体技术当单株细胞当单株细胞被被挑选挑选出來之出來之后后，可以可以分离分离出組成抗出組成抗体轻链体轻链(L)及及重链重链(H)的的mRNA，把他，把他們的們的变异区变异区(VL及及VH)逆逆转录转录成成cDNA後，以後，以连接连接片段片段(Fv)接起來，並植入接起來，並植入噬菌体噬菌体M13的的外壳外壳蛋白基因中，就可以去蛋白基因中，就可以去感染感染大肠菌大肠菌，並且繁殖大量，並且繁殖大量M13噬菌体噬菌体，就，就会会在其在其外壳表外壳表现现出所植入的出所植入的抗体抗体VL+VH片片段，這是段，這是抗体抗体最重要的抗原結最重要的抗原結合區；因為這種片段保留了抗合區；因為這種片段保留了抗原結合區，但沒有其他的原結合區，但沒有其他的Fc部份，因此可以部份，因此可以应用应用用在很多用在很多方面。方面。69现代抗体技术和其应用70现代抗体技术和其应用71现代抗体技术和其应用72现代抗体技术和其应用73现代抗体技术和其应用74现代抗体技术和其应用基因工程抗体基因工程抗体-2.小分子抗体小分子抗体75现代抗体技术和其应用小分子抗体小分子抗体第一代小分子抗体第一代小分子抗体第一代小分子抗体第一代小分子抗体抗原结合片段抗原结合片段抗原结合片段抗原结合片段(fragmentwith(fragmentwithantigenbindingantigenbinding，Fab)Fab)和重组和重组和重组和重组FabFabFab片段由完整轻链和重链的片段由完整轻链和重链的VH+CH1构成，其大小为完构成，其大小为完整抗体的整抗体的1/3,约约55KD；重组重组Fab是将轻、重链可变区分别与人抗体的是将轻、重链可变区分别与人抗体的链和重链链和重链CH1重组；重组；76现代抗体技术和其应用FabFab基因工程构建方法及其性能基因工程构建方法及其性能通常是保留鼠源性的CDR区,其余换成人源化,通过大肠杆菌以分泌表达的方式表达L链和Fd链,二者能在细菌的外周质腔中折叠成具有一定构象的Fab；该Fab具有抗体的活性。因为其不含有Fc段、分子量小、结合力高、抗原性低,故在肿瘤治疗上有其优越性。目前已有多个片段药物获得FDA批准上市.77现代抗体技术和其应用Fab的临床应用的临床应用1）阿昔单抗(abciximab，ReoPro)1994年12月FDA批准的第一个重组Fab片段，该产品以血小板糖蛋白b/a为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药，取得了巨大的成功；2）兰尼单抗(lucentis)：治疗黄斑变性，2006年获得FDA的批准。3）赛妥珠单抗(cimzia)：克罗恩病和风湿性关节炎，2008年获得FDA的批准。在临床研究中，在临床研究中，FabFab占据了临床研发抗体片段的大多占据了临床研发抗体片段的大多数数(30/54(30/54种种)78现代抗体技术和其应用小分子抗体小分子抗体第二代小分子抗体第二代小分子抗体-单链抗体单链抗体(singlechainFv,ScFv)(singlechainFv,ScFv)ScFv指在重链V区cDNA5端与轻链V区cDNA5端之间用一寡聚核甘酸连接,在大肠杆菌中表达成一单链多肽,并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体,大小仅为完整Ig的1/6(约28KD);含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；79现代抗体技术和其应用ScFV的功能的功能1）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部位,如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面的腔囊等；2）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点：多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或药物等,用于影像和临床治疗；80现代抗体技术和其应用小分子抗体小分子抗体第三代小分子抗体第三代小分子抗体纳米抗体和分子识别单位纳米抗体和分子识别单位(molecularrecognitionunitmolecularrecognitionunit，MRU)MRU)纳米抗体纳米抗体主要指仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，其体积约为完整抗体的1/10，故称为纳米抗体；1993年Hamers等偶然发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体(heavy-chainantibodies，HCAbs)。此后，在一些软骨鱼，如护士鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体(newantigenreceptor，NAR)。这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs，VHH)单结构域形成，尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力；克隆这种抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。81现代抗体技术和其应用纳米抗体单域的性质纳米抗体单域的性质1）有高度水溶性和构象稳定性：尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。并且由于在框架FR2区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得VHH抗体在水溶液中具有良好的稳定性。在苛刻的条件中，如胃液和内脏中仍能保持抗原结合活性，为口服治疗胃肠道功能紊乱性疾病提供新的思路；2）纳米抗体能识别独特的抗原表位，由于具有伸展的抗原互补结合区(CDR)以及更高的组织穿透性和更小的分子，VHH抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。可进入酶的活性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利用其模拟药物来设计小分子酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂等；3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经性疾病和脑肿瘤的新药83现代抗体技术和其应用VHH胚系基因序列特性胚系基因序列特性1）对骆驼VHH胚系基因序列分析发现，VHH与人源VH基因家族序列具有较高的同源性；2）比较人类和骆驼IgG重链可变区发现，在框架FR2区的氨基酸组成中，有4个氨基酸显著不同。这4个氨基酸在VH和VHH中分别是V42F或V42Y，G49E，L50R和W52G，利用这一特点,可以对人源抗体VH结构域FR2中的一些氨基酸进行VHH特征性改造,所得到的骆驼化单域VH抗体不仅保持原有的抗体的特异性和亲和力,而且溶解性好、稳定性好。84现代抗体技术和其应用分子识别单位分子识别单位分子识别单位分子识别单位(molecularrecognitionunit(molecularrecognitionunit，MRU)MRU)MRU是由单个互补决定区组成的小分子抗体片段，约为完整抗体分子的1/801/70。MRU也具有与抗原结合的能力，且由于其穿透力强、半衰期短、显像时本底低，在临床诊断中具有潜在的应用前景。85现代抗体技术和其应用基因工程抗体现状基因工程抗体现状通过对小分子抗体基因的改造和修饰，改善其亲和力、免疫原性及效应，构建出多种基因工程抗体片段.目前已有54种基因工程抗体片段进入临床研究，其中30种源自Fab(56%)、19种源自ScFv(35%)、5种源自第三代小分子抗体(9%)86现代抗体技术和其应用双链抗体双链抗体由于单价抗体片段(如ScFv、Fab)与靶抗原作用后保留时间短且解离速度快,所以在实际应用中有必要设计多价抗体分子,这种多价分子可显示出与抗原更加强的亲和力和慢的解离速度；Fab和ScFv片段能够通过化学的或基因工程linker构成二聚体、三聚体或四聚体。例如Fab就被用化学连成二价或三价的多聚体,实验表明其与抗原的保持性有所提高；87现代抗体技术和其应用双链抗体双链抗体缩短缩短Linker二价双链抗体二价双链抗体ScFV05个氨基酸个氨基酸88现代抗体技术和其应用双特异性抗体双特异性抗体(bispecificantibody，BsAb)一个一个结合靶细胞上的特异性抗原结合靶细胞上的特异性抗原另一个结合淋巴细胞或吞另一个结合淋巴细胞或吞噬细胞等效应物噬细胞等效应物双双特特异异性性抗抗体体的的2个个抗抗原原结结合合部部位位两条抗原结合臂可分别来自两条抗原结合臂可分别来自FV段、段、Fab段、段、ScFV或或dsFv导致效应细胞靶向杀灭导致效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞肿瘤细胞有有二二价价、四四价价、六六价价89现代抗体技术和其应用90现代抗体技术和其应用双特异抗体的设计和运用双特异抗体的设计和运用化学交联：分别分离纯化两种亲本单抗，采用还原剂使化学交联：分别分离纯化两种亲本单抗，采用还原剂使其解链，获得单价抗体，再采用异双功能交联剂，把两种具其解链，获得单价抗体，再采用异双功能交联剂，把两种具有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来；有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来；细胞工程：采用细胞融合的方法，将分泌单抗的杂细胞工程：采用细胞融合的方法，将分泌单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞结合，或者使两种分泌不同单抗交瘤与经免疫的脾细胞结合，或者使两种分泌不同单抗的杂交瘤细胞融合；的杂交瘤细胞融合；基因工程：多采用抗体分子片段，基因工程：多采用抗体分子片段，Fab、ScFV等经过等经过基因操作修饰后，通过体外组装成基因操作修饰后，通过体外组装成BsAb或者直接表达分泌型或者直接表达分泌型的的BsAb 此法缺此法缺点是容易导点是容易导致抗体失去致抗体失去活性，产物活性，产物均一性不佳均一性不佳。多倍杂多倍杂交瘤细胞的交瘤细胞的稳定性差，稳定性差，BsAbBsAb的产量的产量少且活性低，少且活性低，费时费力，费时费力，临床应用时临床应用时存在人抗鼠存在人抗鼠抗体免疫反抗体免疫反应应 (HAMA)(HAMA)，因此不适，因此不适用于临床。用于临床。91现代抗体技术和其应用1）靶向性好：用高价BsAb靶向目标抗原可使药物选择性地结合到高抗原密度的肿瘤组织区，正常组织抗原密度低于BsAb的结合域值，因而BsAb极少渗透入正常组织，从而提高了BsAb的靶向性。实例：Lu等设计了3价抗ErbB2/CD16的BsAb，它包括2个结合ErbB2的ScFv形式结合位点和一个定位于NK细胞的单价Fab片段位点92现代抗体技术和其应用2）是一种有效的抗肿瘤策略：Michaelson等将抗LTR的ScFv片段融合于抗TRAIL-R2单抗的重链端，设计了以TNF家族膜受体TRAIL-R2和LTR为靶点的IgG样BsAb。该抗体血浆半衰期长，体外实验中能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，在小鼠肿瘤移植模型中较之亲本抗体能更显著地减小肿瘤体积；93现代抗体技术和其应用3）具有更强的杀伤淋巴瘤细胞的功效，且对同体正常）具有更强的杀伤淋巴瘤细胞的功效，且对同体正常B细胞的细胞的作用较弱：作用较弱：Rossi等报道了一对来自抗等报道了一对来自抗CD20IgG1)和依帕珠单和依帕珠单抗抗(epratuzumab)的人源化的人源化6价抗价抗CD20/22的的BsAb20-22和和22-20。它们无需第二抗体交联即可诱导肿瘤细胞凋亡和增。它们无需第二抗体交联即可诱导肿瘤细胞凋亡和增殖抑制殖抑制94现代抗体技术和其应用基因工程抗体基因工程抗体-3.新型抗体分子新型抗体分子1）放射性标记的抗体片段：，通过抗体特异性的识别作用使放射性物质有效地导向肿瘤组织局部，用于放射免疫治疗;2）抗体-化疗药物结合物：通过化学方法使抗体和化疗药物的某些基团偶联，在特异的作用位点产生细胞毒作用进行免疫化疗;3）抗体-酶连接物：利用抗体导向作用，将催化前体药物的酶携带至肿瘤局部，待血液循环及正常组织中非特异分布的抗体酶药物廓清后再注射前体药物，在肿瘤局部造成高浓度化疗药物的微环境，从而高效率杀伤肿瘤细胞。95现代抗体技术和其应用基因工程抗体基因工程抗体-3.新型抗体分子新型抗体分子4）细胞内抗体将小分子抗体基因加上定位信号序列，使其在细胞内特定部位表达，可中和或调节位于特定亚细胞部位的活性分子或者触发免疫反应，即为细胞内抗体(intrabody).细胞内抗体主要应用于疾病的基因治疗。工程化的细胞内抗体为探索膜蛋白新的功能提供了重要的分子靶向工具。Hayashi等成功合成了针对分泌酶复合体重要成分nicastrin(NCT)的ScFv胞内抗体，生化分析结果显示，该抗体能扰乱内源性NCT的正常折叠和糖基化成熟，进而影响分泌酶复合体的稳定性及内源蛋白水解活性。96现代抗体技术和其应用97现代抗体技术和其应用