琼脂糖凝胶电泳解析课件

琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis琼脂糖凝胶电泳agarosegelelectropho1一、琼脂糖凝胶电泳的作用是什么？在什么情况下我们需要做琼脂糖凝胶电泳？做琼脂糖凝胶电泳的目的是什么？琼脂糖凝胶电泳可以回答两个问题目标DNA片段有没有？目标DNA片段的浓度和纯度怎样？以下列举一些应用实例一、琼脂糖凝胶电泳的作用是什么？在什么情况下我们需要做琼21当我们需要检测所提取的DNA时条带的相对位置反映片段的大小；条带的亮度反映样品的浓度1当我们需要检测所提取的DNA时条带的相对位置反映片段的大32当我们设计了引物想扩增某段基因序列，做完了PCR后，想要知道有没有成功扩增，是否需要进一步优化PCR条件1DL2000分子量标准2EXON1526bp3EXON9487bp4EXON20525bp1 2 3 4500bp750bp2当我们设计了引物想扩增某段基因序列，做完了PCR后，想要4TATA克隆克隆PCRPCR鉴定（阳性片段约鉴定（阳性片段约500bp500bp）07-17 PCR鉴定鉴定02号标本号标本E9 TA候选克隆候选克隆LINE1克隆编号：13-24LINE2克隆编号：25-36阳性克隆编号：阳性克隆编号：02-13；02-14；02-30；02-34。07-17PCR鉴定02号标本E9TA候选克隆5这次电泳对我这次电泳对我有什么价值？有什么价值？这次电泳对我6-24-1-2-4-5-6-13-14-3-4-7-8M-2-7-8-9-10-2-5-13-13-14-16-20M3当你需要观察限制性内切酶的切割结果-24-1-2-4-5-674当你需要通过切胶回收纯化某个片段 12312 3 412 3PCR扩增S1和S21Marker2S2（1875bp）3S1（2172bp）2nd扩增S1，S21S12S23DL2000S1，S2产物纯化1，4DL20002S13S2 PCR PCR扩增某病毒扩增某病毒S S基因基因4当你需要通过切胶回收纯化某个片段128二、琼脂糖凝胶电泳的原理是什么1带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动。2电泳缓冲液中充满了离子，因而导电，DNA分子在PH78时带负电，因此在电场作用下向正极泳动。3琼脂糖凝胶中含有密集细小的孔洞，线状的DNA分子可以通过。4DNA分子越大，阻力越大，泳动越慢，经过一定时间泳动后将按大小排列成一组“条带”。二、琼脂糖凝胶电泳的原理是什么1带电颗粒在电场中将受到电场9三、怎样做琼脂糖凝胶电泳1仪器准备2制胶（需要注意的细节特别多，电泳成败的关键所在）3上样，电泳，染色4结果观察，记录三、怎样做琼脂糖凝胶电泳1仪器准备10微波炉微波炉实验仪器实验仪器微波炉用于制胶过程微波炉用于制胶过程中，加热使固体的琼中，加热使固体的琼脂糖均匀融解在缓冲脂糖均匀融解在缓冲液中，成为液态的琼液中，成为液态的琼脂糖凝胶，降温后液脂糖凝胶，降温后液态的凝胶凝固成固态态的凝胶凝固成固态微波炉实验仪器微波炉用于制胶过程中，加热使固体的琼脂糖均匀融11不同电泳仪及水平电泳槽不同电泳仪及水平电泳槽不同电泳仪及水平电泳槽12水平电泳槽和梳子水平电泳槽和梳子梳子的作用是制胶时插入胶中，以便胶凝固后产生加样孔梳子的作用是制胶时插入胶中，以便胶凝固后产生加样孔水平电泳槽和梳子梳子的作用是制胶时插入胶中，以便胶凝固后产生13伯乐公司（bio-rad）电泳仪伯乐公司（bio-rad）电泳仪14凝胶凝胶/电泳槽电泳槽凝胶/电泳槽15紫外透射仪紫外透射仪用于观察用于观察DNA电泳结果或同时进行切胶纯化电泳结果或同时进行切胶纯化紫外透射仪用于观察DNA电泳结果或同时进行切胶纯化16凝胶成像凝胶成像系统系统凝胶成像系统17琼脂糖凝胶电泳解析课件182制胶配制5（或10）TBE或TAE或TPE贮存液，分别代表Tris-硼酸、Tris-乙酸、Tris-磷酸缓冲液TBE的工作浓度一般为0.5，电泳前将贮存液稀释至工作浓度。配制凝胶用的TBE和电泳缓冲液应浓度一致。称取合适重量的琼脂糖，以便配制成一定浓度的凝胶。如称取2g琼脂糖加在100ml0.5TBE中将制成浓度为2的琼脂糖凝胶。凝胶浓度越大，刚性越大，一般分辨能力也越强。常用的凝胶浓度在12之间，凝胶浓度太小则凝胶容易太软而且易碎，很难操作，但有时候的确需要较小浓度的凝胶。2制胶配制5（或10）TBE或TAE或TPE贮19胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间左右的间隙。隙。将配制好的适当浓度的凝胶放入微波炉中融解，2分钟左右即可，需严密观察，小心操作，戴上微波炉专用手套，随时轻轻摇动以便琼脂糖完全融解，均匀分布。（谨防烫伤）胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好20加入EB（可选）：向冷却至向冷却至50-60的琼的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终溶液使其终浓度为浓度为0.5g/mL。（贮存液。（贮存液10mg/ml）倒胶：用移液器吸取少量融化的琼脂糖用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。液形成均匀的胶层。拔梳：待胶完全凝固后拨出梳子，注意待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。表面。琼脂糖凝胶电泳解析课件213上样，电泳，染色加加样样：取取10L DNA样样品品与与2L 6上上样样液液混混匀匀，用用微微量量移移液液枪枪小小心心加加入入样样品品槽槽中中。若若DNA含含量量偏偏低低，则则可可依依上上述述比比例例增增加加上上样样量量，但但总总体体积积不不可可超超过过样样品品槽槽容容量量。每每加加完完一一个个样样品品要要更更换换tip头头，以以防防止止互互相相污污染染，注注意意上上样样时时要要小小心心操操作作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。电泳：加完样后电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在在60-80V（15v/cm），电流在），电流在40mA以上。当溴酚蓝条以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。时，停止电泳。染色：未加染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入的胶板在电泳完毕后移入0.5g/mL的的EB溶液中，溶液中，室温下染色室温下染色20-25min。3上样，电泳，染色加样：取10LDNA样品与2L6224结果观察，记录1.观察和拍照：在波长为观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。的电泳胶板。4结果观察，记录观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外23四常见问题分析四常见问题分析24琼脂糖凝胶电泳解析课件251234123456789 D14-TA克隆酶切鉴定1 DL20002 阳性克隆/EcoRI3 假阳性克隆4 T载体对照 D23-TA克隆酶切鉴定13 阳性克隆68 阳性克隆/EcoRI4 假阳性克隆（载体环化）9 假阳性克隆/EcoRI 5 DL2000图图4 S4 S基因克隆到基因克隆到T T载体中载体中1226琼脂糖凝胶电泳解析课件271PCDNA3/EcoR1酶切22，3，7，8，9，10PCD12/EcoR1酶切34,5PCD12/EcoR1酶切(酶切不全）46DL20002000bp5.1kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10PCDNA3/EcoR1酶切2000bp5.1kb128琼脂糖凝胶电泳解析课件29