纤维素酶概述课件

资料仅供参考,不当之处，请联系改正。内容内容J 1 背景背景J 2 纤维素及纤维素酶的介绍纤维素及纤维素酶的介绍J 3 国内外纤维素酶的研究热点国内外纤维素酶的研究热点内容 1 背景1资料仅供参考,不当之处，请联系改正。研究背景研究背景n 能源危机能源危机 高油价，石油、天然气等化石燃料的枯竭,如石油大 约为11801510亿吨，大约在2050年左右枯竭，天然 气储备估计在131800152900兆立方米。年开采量维 持在 2300兆立方米，将在5765年内枯竭。煤的储量约为5600亿吨，可以供应169年。n 粮食紧缺粮食紧缺 全世界饥饿人口：10亿n纤维素乙醇纤维素乙醇 原料来源广:作物的秸秆(1.51012T/年)，大部分以焚烧的形式被处理掉，造成大量资源的浪费和环境污染。价格低：50美分/加仑（美国Novozymes公司）n 工业用酶的需求增大工业用酶的需求增大 酶的产值：1 1010美元/年 研究背景 能源危机2资料仅供参考,不当之处，请联系改正。World energy usage width chartWorld energy usage width chart3资料仅供参考,不当之处，请联系改正。汽油的价格汽油的价格汽油的价格4资料仅供参考,不当之处，请联系改正。FLAG POLICY DURING THE 1973 oil crisis 1979 1979 energy energy crisiscrisis FLAG POLICY DURING 1979 energy5资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Line at a gas station,June 15,1979 Line at a gas station,June 156资料仅供参考,不当之处，请联系改正。全球粮食危机全球粮食危机全球粮食危机7资料仅供参考,不当之处，请联系改正。粮农组织食品价格指数和农产品价格指数 粮农组织食品价格指数和农产品价格指数 8资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Straws of CropStraws of Crop9资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素的分子结构纤维素的分子结构分子量：分子量：1.51061.84106，相当于11 300个葡萄糖残基，这些纤维素分子以氢键构成平行的微晶束，约60个为1束。纤维素的弯曲模型纤维素的弯曲模型:Hermans(20世纪40年代)提出纤维素(Cellulose)是植物细胞壁的主要组分之一,占植物秸秆干质量的40%50%。纤维素(Cellulose)：是由D-吡喃型葡萄糖基经-1,4 糖苷键联结而成的直链多糖直链状大分子纤维素折迭起来，形成具有高结晶的基本构成单位，由这种基本构成单位集中起来构成微小的结构单位，再由很多的微小单位构成纤维素。Figure 1 Hermans 式纤维素的椅式结构纤维素的分子结构分子量：纤维素(Cellulose)是植物细10资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶的介绍纤维素酶的介绍F 纤维素酶纤维素酶：指由生物产生的一种多组分的混合蛋白质，在适当的条件下，能使不溶性纤维素材料水解成可溶性糖的生物催化剂的总称。F 纤维素酶的结构纤维素酶的结构 Fig.1 Model of cellulase enzyme,produced by T.fusca(禾草腥黑粉菌禾草腥黑粉菌),based on PDB structure 1JS4.催化活催化活性中心性中心到两个具有独立活性的结到两个具有独立活性的结构域构域:具有催化功能的结具有催化功能的结构域构域(Catalytic domain,(Catalytic domain,CD),CD),具有结合纤维素功具有结合纤维素功能的结构域能的结构域(Cellulose(Cellulose binding domain,CBD),binding domain,CBD),两者之间由一段高度糖基两者之间由一段高度糖基化的化的linkerlinker相连。整个分相连。整个分子呈楔形子呈楔形,球状核区表示球状核区表示包含催化位点和底物结合包含催化位点和底物结合位点的位点的CDCD区。少数没有区。少数没有CBDCBD。目前被阐明的催化结构域目前被阐明的催化结构域T.reeseiCBHT.reeseiCBH的催化域结构的催化域结构,它是由它是由/组成的筒状结构组成的筒状结构:由由5 5个个螺旋和螺旋和7 7条条链组链组成成,活性部位由两个延伸至表面的环活性部位由两个延伸至表面的环(loop)(loop)以形成一个隧以形成一个隧道状道状(tunnel)(tunnel)结构结构,长度大约长度大约2nm,2nm,包含包含4 4个结合位点个结合位点,水水解糖苷键发生在第解糖苷键发生在第2 2和第和第3 3结合位点之间。结合位点之间。纤维素酶的介绍 纤维素酶：指由生物产生的一种多组分的混合蛋白11资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶的性状纤维素酶的性状真菌纤维素酶：真菌纤维素酶：以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素；细菌纤维素酶：细菌纤维素酶：形成多酶复合体结构又称纤维小体(Cellulosome)而起作用。能够更加彻底有效降解天然纤维素。白色，溶于水，高温失活：白色，溶于水，高温失活：最适温度在4565 之间，受受二苯乙烯苷、葡萄糖酸二苯乙烯苷、葡萄糖酸-1,5-内酯等抑制内酯等抑制表表1 1 产纤维素酶菌种的特点产纤维素酶菌种的特点纤维素酶的性状真菌纤维素酶：以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维12资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶的作用机制纤维素酶的作用机制 纤维二糖酶纤维二糖酶C1酶酶C酶酶根据酶的作用方式纤维素酶分为：根据酶的作用方式纤维素酶分为：纤维素酶纤维素酶C1酶：酶：内切型酶，它从水合内切型酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于非结晶纤维素分子内部作用于-（1，4)糖苷键，生成纤维糖苷键，生成纤维糊精与纤维二糖。糊精与纤维二糖。C2酶：酶：外切酶，它从水合性纤维素外切酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于分子的非还原端作用于-（1，4)糖背糖背键，逐步切断键，逐步切断-(1,4)糖节键生成葡萄糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖生成葡萄糖 (何明清，何明清，1994)。Shoemaker、Goeran 和和Jinshce等人相继发现，内切葡萄糖酶、纤等人相继发现，内切葡萄糖酶、纤维二糖水解酶及维二糖水解酶及-葡萄糖苷酶均存葡萄糖苷酶均存在在24 个同功酶，对于这些同功个同功酶，对于这些同功酶的功能，目前尚未见有明确的阐酶的功能，目前尚未见有明确的阐述，因此酶解机理还有待进一步研述，因此酶解机理还有待进一步研究和探讨。究和探讨。目前，已发现目前，已发现70种纤维素酶。种纤维素酶。以上几种酶往往相互协同作用以上几种酶往往相互协同作用纤维素酶的作用机制 纤维二糖酶C1酶C酶根据酶的作用方式纤13资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Character of Reaction Hydrolysis of 1,4-beta-D-glycosidic linkages in cellulose,lichenin and cereal beta-D-glucans.Fig.2 Character of Hydrolysis ReactionCharacter of Reaction 14资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素的水解过程纤维素的水解过程 Fig.3 Mechanism of cellulolysis Breakage of the non-covalent in the celluloseHydrolysis of the individual cellulose it into smaller sugars Hydrolysis of disaccharides and tetrasaccharides into glucose 纤维素的水解过程 Fig.3 Mechanism of 15资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶的来源纤维素酶的来源%真菌真菌(mainly)：木霉属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium），如 绿色木霉菌(Trichoderma viride),康宁木霉菌(Trichoderma koningii),黑曲霉（Asp.niger），绳状青霉、变幻青霉等.%细菌细菌:好氧菌：如纤维单胞菌属（Cellulomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、噬胞菌属（Cytophaga）厌氧菌：厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium）、产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）等 超古菌：激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)等.%放线菌放线菌:好氧放线菌(Actinomycetales)：生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)高温单孢菌属(Thermomonospora):弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)及假诺卡氏菌属等%植物、动物及原生动物植物、动物及原生动物(little):蜗牛(snail),蟑螂(cockroaches)等.纤维素酶的来源 真菌(mainly)：16资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶的应用：纤维素酶的应用：纤维纤维素酶素酶食品生产食品生产医药医药生物生物燃料燃料造纸造纸洗涤剂洗涤剂纺织工业纺织工业纤维素酶的应用：纤维食品生产医药生物造纸洗涤剂纺织工业17资料仅供参考,不当之处，请联系改正。针对以上不知，国内外研究主要集中在以下几方面针对以上不知，国内外研究主要集中在以下几方面:1、菌种选育：构建表达具有较高酶活力的纤维素酶菌株;2、酶功能的改造：通过分子改造来提高酶的功能性;3、通过低成本发酵来生产酶制剂：添加可溶性诱导剂，如槐糖(sophorose),纤维二糖(cellobiose),乳糖(lactose)和寡糖(cellooligosaccharides)针对以上不知，国内外研究主要集中在以下几方面:1、菌种选育：18资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶在实际应用的不足纤维素酶在实际应用的不足(1)技术上：纤维素酶对温度、湿度、酸碱度十分敏感,生产 纤维素酶在保管、加工等过程中处理不当就会失活,影响应用效果。(2)标准上：纤维素酶的质量标准、校验方法标准,特别是添加纤维素酶后的产品质量标准,在我国还是空白。取得的成效与预期的目标相距甚远取得的成效与预期的目标相距甚远,原因主要有原因主要有2 2个：个：纤维素酶在实际应用的不足(1)技术上：纤维素酶对温度、湿度、19资料仅供参考,不当之处，请联系改正。今后对纤维素酶的研究会重点集中在今后对纤维素酶的研究会重点集中在:纤维素酶高产菌株选育：纤维素酶高产菌株选育：对菌株进行改造,提高菌株生产能力及酶的活性和稳定性，筛选极端条件下纤维素酶高产菌株优化发酵条件：优化发酵条件：改进发酵工艺,降低生产成本,使发酵产物易于分离纯化。纤维素酶的测定方法规范化：纤维素酶的测定方法规范化：包括规定标准菌株、标准测活方法、标准底物等。今后对纤维素酶的研究会重点集中在:纤维素酶高产菌株选育：20资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶研究现状纤维素酶研究现状Bok JD.等人从Thermotoga neapolitana中分离纯化到2个高热稳定性内切纤维素酶CelA、CelB,编码这2个内切纤维素酶的基因已经被鉴定。Bronnenmeiar将一种来源于T.maritimaMSB8的高热稳定性外切纤维素水解酶,最适温度为95,pH在6.07.5,该酶能水解微晶纤维素、羧甲基纤维素和-葡聚糖形成纤维二糖和纤维三糖。来自S.solfataricusMT4的-糖苷酶已被纯化鉴定,该酶是一个同源四聚体,85以上对各种变性剂有极高抵抗力。编码该酶的基因已在大肠杆菌中克隆和高效表达。用拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片、马铃薯或烟叶来表达热稳定性好的Acidothermus cellulolyticus endoglucanase E1。纤维素酶研究现状Bok JD.等人从Thermotoga n21资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1987年,Love在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆了最适生长温度为65的极端嗜热厌氧菌（Caldocellum saccharolyticum）的-葡萄糖苷酶,并完成测序。1996年Bergquist克隆的栖热菌耐热纤维素酶的耐热温度为70。1997年美国RB I公司开发的103酶耐热温度100,最适酶促温度7080。1998 年THOMAS克隆到Streptomyces viridosporus的内切纤维素酶基因并成功表达于Pichiapastoris 中。2000年 SPIRIDONOV尝试用放线菌（Thermobifida fusca）进行体外合成纤维素酶，发现这一过程受celR 基因调控。通过对比celR 基因突变型与野生型的差别，发现celR 为组成型表达基因，其DNA 结合活性受翻译后修饰调控。2001年VAN Solingen从湖底淤泥中筛选到了生产碱性纤维素酶的放线菌菌株，经16S rDNA 测序，初步鉴定为链霉菌属新种，并成功克隆到了纤维素酶基因cel12A，并将其利用大肠杆菌表达。1987年,Love在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆了最适生长22资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素酶的生产纤维素酶的生产液态液态发酵发酵固态发酵固态发酵生产方式生产方式胡奎娟等研究了木霉和黑曲霉混合发酵产木聚糖酶和纤维素酶，结果为：木霉和黑曲霉按4:6同时接种，在84h产纤维素酶活力达到230IU/g干物质，木聚糖酶活力达到1308IU/g干物质，与两菌纯培养相比，纤维素酶活力提高163%，木聚糖酶活力提高79.5%。邹水洋等对选育的一株康宁木(Trichoderma koningii)QF202进行液态发酵生产纤维素酶和木聚糖酶.通摇瓶培养144 h后，滤纸酶活1.49 FPU/mL、-葡萄糖苷酶活0.39 U/mL、木聚糖酶活174.10U/mL.比一种商品纤维素酶的糖化能力及总还原糖产量比商品纤维素酶分别提高了55%和40%,葡萄糖产量分别提高了33%和12%.纤维素酶的生产液态固态发酵生产方式胡奎娟等研究了木霉和黑曲霉23资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素乙醇的生产工艺纤维素乙醇的生产工艺pretreatment Cellulose materialcellulolysis sugar solution fermentation Distillation Dehydration 95%alcoholover 99.5%ethanolcellulase 纤维素乙醇的生产工艺pretreatment Cellul24资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纤维素生产乙醇及其他化工产品的关键纤维素生产乙醇及其他化工产品的关键纤维素的糖化的主要方法纤维素的糖化的主要方法n酸水解法：酸水解法中，稀酸水解所得糖化率低，高浓度强酸可有效水解纤维素，但其腐蚀性对人体有害，且所需工艺条件苛刻。n酶水解法：用纤维素酶水解纤维素，在常温、常压条件下就可以.因此，用纤维素酶降解纤维素是目前纤维素利用研究中的热点。n稀酸预处理-酶解法：美国可再生能源实验室开发的发酵工艺纤维素生产乙醇及其他化工产品的关键纤维素的糖化的主要方法25资料仅供参考,不当之处，请联系改正。参考文献：参考文献：1 Ziegler M T，Thomas S R，Danna K J.Accumulation of a thermostable endo-1,4-D-glucanase in the apoplast of Arabidopsis thaliana leaves J.Mol.Breed.，2000，6：37-46.2 Dai Z Y，Hooker B S，Anderson D B，et al.Improved plant-based production of E1 endoglucanase using potato：Expression optimization and tissue targeting J.Mol.Breed.，2000，6：277-285.3 GRAHAM L.,et al.Characteris tics of Enzymes Produced by Ruminococcus Jlavefaciens which Degrade Plant Cell Walls.Journal of General Microbiology.1979,110:21-27.4 BARBEL G.,et al.Cellulolytic Enzyme System of Thermoactinomyces sp.Grown on Microcrystalline Cellulose.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.1978,36(4):606-612.5 HARRY J.GILBERT,GEOFFREPY.H AZLEWOOD Bacterial cellulases and xylanases.Journal of General Microbiology.1993,139:187-194.6 FRE J.STUTZENBERGER.Cellulolytic Activity of Thermomonospora curvata:Optimal Assay Conditions,Partial Purification,and Product of the Cellulase.APPLiED MlcaosioLoGy.1972,24(1):83-90.7 P.0.OLUTIOLA.Cellulolytic Enzymes in Culture Filtrates of Rhizoctonia lamellifera.Journal of General Microbiology.1976,97:251-256.8 A.D.COUTTS.Factors Influencing the Production of Cellulases by Sporotrichum thermophile.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.1976,36(1):819-825.9 Mariam B.Sticklen.Feedstock Crop Genetic Engineering for Alcohol Fuels.CROP SCIENCE.2007,47:2238-2246.10 ELAINET.EVANS,et al.Investigation of an endoglucanase essential for the action of the cellulase system of Trichoderma reesei on crystalline cellulose.Journal of General Microbiology.1992,138:1639-1 646.参考文献：1 Ziegler M T，Thomas S 26资料仅供参考,不当之处，请联系改正。11 ELAINET.EVANS.Investigation of an endoglucanase essential for the action of the cellulase system of Trichoderma reesei on crystalline cellulose.Journal of General Microbiology.1992,138:1639-1 646.12 Ta-Tung Wey,et al.Molecular Cloning and Sequence Analysis of the Cellobiohydrolase I Gene from Trichoderma koningii G-39.CURRENT MICROBIOLOGY.1994,28:31-39.13 S.Zeilinger.,et al.Nucleosome transactions on the Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei)cellulase promoter cbh2 associated with cellulase induction.Mol Gen Genomics.2003,270:4655.14 T.M.WOOD,et al.Observations on the Complex Interactions Involved in the Enzymatic Hydrolysis of Cellulose.Applied Biochemistry and Biotechnology.1984,9:313-315.15 D.M.PHARR.Partial Characterization of Cx Cellulase and Cellobiase from Ripening Tomato Fruits1.Plant Physiol.1973,51:577-583.16 J.L.Wang,P.J.Gao.PCR-mediated analysis of transcription of CBH I and II genes from Trichoderma pseudokoningii and Penicillium janthinellum.Biotechnology Letters.1999,21:321324.17 BASIL J.MACRIS.Production and Characterization of Cellulase and r-Glucosidase from a Mutant of Alternaria alternata.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.1984,47(3):560-565.18 K.MAHALINGESHWABRHAA,et al.Purification and characterization of an extracellular P-glucosidase from the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile and its influence on cellulase activity.Journal of General Microbiology.1993,139:2825-2832.19 THOMAS M.WOOD,SHEILA I.McCRAE.Purification and Some Properties of the Extracellular P-D-Glucosidase of the Cellulolytic Fungus Trichoderma koningii.Journal of General Microbiology.1982,128:2973-2982.20 ERIC A.JOHNSON,et al.Saccharification of Complex Cellulosic Substrates by the Cellulase System from Clostridium thermocellum.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.1982,43(5):1125-1132.11 ELAINET.EVANS.Investigati27资料仅供参考,不当之处，请联系改正。21 C.Thrane,et al.Substrate colonization,strain competition,enzyme production in vitro,and biocontrol of Pythium ultimum by Trichoderma spp.isolates P1 and T3.European Journal of Plant Pathology.2000,106:215225.22 T.M.Wood,et al.Synergism between components of the cellulase system of the anaerobic rumen fungus NeocallimasUx frontalis and those of the aerobic fungi Penicilhum pinophilum and lrichoderma koningii in degrading crystalline cellulose.Appl Microbiol Biotechnol.1994,41:257-261.23 Lakshmikant.Cellulose degradation and cellulase activity of five cellulolytic fungi.World Journal of Microbiology and Biotechnology.1990,6:64-66.24 GEOFFIEY HALLIWELL,MOIAMMED IIAZ.Interactions between Components of the Cellulase Complex of Trichoderma koningii on Native Substrates.Arch.Mikrobiol.1 971,78:295-309.25 Sakae Shibutani,et al.Inhibition of Trichoderma ceUulase activity by a stilbene glucoside from Picea glehnii bark.J Wood Sci.2001,47:135-140.26 Shuang Zhang,et al.Molecular and biochemical characterization of Ba-EGA,a cellulase secreted by Bacillus sp.AC-1 from Ampullaria crosseans.Appl Microbiol Biotechnol.2007,75:13271334.27 Laura Fernandez de las Heras,et al.Morphological,Physiological,and Molecular Characterization of a Newly Isolated Steroid-Degrading Actinomycete,Identified as Rhodococcus ruber Strain Chol-4.Curr Microbiol.2009,59:548553.28 Xiao Ping Huang,Colin Monk.Purification and characterization of a cellulase(CMCase)from a newly isolated thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans gen.nov.,sp.Nov.World Journal of Microbiology&Biotechnology.2004,20:859230 Luis M.A.FERREIRA,et al.The cellodextrinase from Pseudomonas fluorescens subsp.Cellulosa consists of multiple functional domains.Biochem.J.1991,279,793-799.21 C.Thrane,et al.Substra28资料仅供参考,不当之处，请联系改正。谢谢29