生物效应检定法课件

中药分析中药分析中药分析中药分析 第四组第四组第四组第四组第四组第四组第四组第四组 生物效应测定法在中药中的应用发展概况方法介绍应用及价值问题及解决生生生生物物物物效效效效应应应应测测测测定定定定法法法法一、发展概况生物效应测定法生物效应测定法：以药理学为基础，生物统计为方法，运用特定的实验设计，是利用药物对于生物整体、离体器官、细胞、酶或分子等所起的作用,在严格控制的试验条件下,通过比较对照品和供试品对生物体或离体器官与组织的特定生物效应,从而控制和评价供试品质量、活性或作用强度。生物效应强度生物效应测定法的生物效应测定法的定义定义研究概况早早在在2020世世纪纪5050年年代代，我我国国医医药药学学者者就就开开始始利利用用生生物物活活性性检检测法进行中药质量控制方面的研究。测法进行中药质量控制方面的研究。19511951年年我我国国生生药药学学家家楼楼之之岑岑院院士士报报告告了了利利用用小小鼠鼠口口服服植植物物性性泻泻剂剂（大大黄黄）排排出出湿湿便便效效应应，建建立立了了泻泻下下药药的的生生物物活活性性检测方法；检测方法；19971997年年周周重重阳阳等等利利用用抗抗菌菌效效应应测测定定大大蒜蒜油油中中大大蒜蒜辣辣素素和和大大蒜新素等活性物的含量。蒜新素等活性物的含量。这这些些研研究究，为为中中药药质质量量生生物物活活性性检检测测方方法法的的建建立立奠奠定定了了基基础础，但但基基于于当当时时技技术术水水平平条条件件的的限限制制，方方法法并并不不成成熟熟，操操作作比比较较繁繁琐琐，精精密密度度和和重重现现性性不不高高，在在实实际际研研究究中中尤尤其其是是中药质量标准中没有得到推广应用。中药质量标准中没有得到推广应用。从从从从2121世纪开始，生物活性检测法在中药质量控制世纪开始，生物活性检测法在中药质量控制世纪开始，生物活性检测法在中药质量控制世纪开始，生物活性检测法在中药质量控制中有了较大的发展，一些生物活性检测技术测定中中有了较大的发展，一些生物活性检测技术测定中中有了较大的发展，一些生物活性检测技术测定中中有了较大的发展，一些生物活性检测技术测定中药含量的方法开始收入药典等法定标准中药含量的方法开始收入药典等法定标准中药含量的方法开始收入药典等法定标准中药含量的方法开始收入药典等法定标准中。20052005年版年版年版年版中国药典中国药典中国药典中国药典一部中水蛭通一部中水蛭通一部中水蛭通一部中水蛭通过计算水蛭粉过计算水蛭粉过计算水蛭粉过计算水蛭粉末的抗凝血酶末的抗凝血酶末的抗凝血酶末的抗凝血酶活性的方法进活性的方法进活性的方法进活性的方法进行含量测定行含量测定行含量测定行含量测定。消栓肠溶胶消栓肠溶胶消栓肠溶胶消栓肠溶胶囊的效价测囊的效价测囊的效价测囊的效价测定方法借鉴定方法借鉴定方法借鉴定方法借鉴了生物制品了生物制品了生物制品了生物制品中酶效价测中酶效价测中酶效价测中酶效价测定方法。定方法。定方法。定方法。张恩户等采用张恩户等采用张恩户等采用张恩户等采用体外抑菌法测体外抑菌法测体外抑菌法测体外抑菌法测定连翘及其制定连翘及其制定连翘及其制定连翘及其制剂的抗菌活性，剂的抗菌活性，剂的抗菌活性，剂的抗菌活性，用生物活性检用生物活性检用生物活性检用生物活性检测法作为连翘测法作为连翘测法作为连翘测法作为连翘及其制剂的质及其制剂的质及其制剂的质及其制剂的质量控制方法量控制方法量控制方法量控制方法。这些生物活性测定法在中药质量控制方面这些生物活性测定法在中药质量控制方面这些生物活性测定法在中药质量控制方面这些生物活性测定法在中药质量控制方面得到很好的应用，都有益于中药质量生物活性得到很好的应用，都有益于中药质量生物活性得到很好的应用，都有益于中药质量生物活性得到很好的应用，都有益于中药质量生物活性检测的进一步发展。检测的进一步发展。检测的进一步发展。检测的进一步发展。二、方法介绍生物效应的检定方法生物效应的检定方法 所谓的生物效所谓的生物效价通常是以其完价通常是以其完成某种特定的生成某种特定的生理作用的程度作理作用的程度作指标来衡量，而指标来衡量，而且标准参比物作且标准参比物作100%进行比较进行比较而得。而得。其基本思想是其基本思想是选择适当的药理选择适当的药理效应作为观测指效应作为观测指标标,得出剂量得出剂量-效应曲线、时间效应曲线、时间-效应曲线和时效应曲线和时间间-体存药量曲体存药量曲线线,从而得出药从而得出药物动力学参数物动力学参数。热力学的基本热力学的基本原理在生命现原理在生命现象以及和生命象以及和生命现象有关的物现象有关的物理现象中的应理现象中的应用用,称为生物热称为生物热力学。力学。等等药物累积量法药物累积量法又称毒理效应又称毒理效应法法,其基本原其基本原理是将血药浓理是将血药浓度多点动态测度多点动态测定与动物急性定与动物急性死死亡率测定蓄亡率测定蓄积性的方法相积性的方法相结合结合,测定药测定药物动物动力力学参数学参数。1.生物效价法生物学效价生物学效价也称“生物学利用率（Bioavailability）”。张子仪(1994)指出，生物学效价生物学效价包括消化率、代谢率、同化、有效 性和可利用率等多重涵义。有人概括，生物效价是一种计量单位，是针对药物代谢动力学来说的，通常都是单位有效量。一种营养素的生物学效价是指该营一种营养素的生物学效价是指该营养素被动物食入后，被小肠吸收并养素被动物食入后，被小肠吸收并能参与代谢过程，贮存在动物体内能参与代谢过程，贮存在动物体内的部分占食入总量的比值，可概括的部分占食入总量的比值，可概括为相对利用率和绝对利用率为相对利用率和绝对利用率生物效价法测定大黄炮制品活血化瘀功效生物效价法测定大黄炮制品活血化瘀功效效应指标为纤维蛋白原效应指标为纤维蛋白原(FIB)活血化瘀与凝血过程有密切关联，纤维活血化瘀与凝血过程有密切关联，纤维蛋白原在凝血酶的作用下生成纤维蛋白，蛋白原在凝血酶的作用下生成纤维蛋白，然后形成凝胶，这是血液凝然后形成凝胶，这是血液凝固基本过程的最后关键步骤。固基本过程的最后关键步骤。进行效价测定，记录成胶情进行效价测定，记录成胶情况及对应的纤维蛋白原剂量况及对应的纤维蛋白原剂量大黄活血化瘀效价大黄活血化瘀效价(U)=FIB 质量浓度质量浓度(mg/mL)梯度梯度 FIB 体积体积(mL)大黄供试液梯度浓度大黄供试液梯度浓度 大黄供试液体积大黄供试液体积(50 L)结果分析结果分析大黄拮抗大黄拮抗 FIB 的效果作为其的效果作为其活血化瘀功效的评价指标，活血化瘀功效的评价指标，应用于中药质量控制应用于中药质量控制例子：例子：2.药理效应法药理效应法 研究对象：研究对象：药理效应法的含义：根据药物的效应在一定条件下与体内药量呈对应关系，根据效应的变化推知体内药量的变化，进而描述药物 的体内过程。药理效应物质基础不明确，成分复杂不适合用血药浓度法等其它方法研究的药物。血药浓度法以某一单血药浓度法以某一单血药浓度法以某一单血药浓度法以某一单一的化学成分为指标一的化学成分为指标一的化学成分为指标一的化学成分为指标进行检测进行检测进行检测进行检测应用实例：应用实例：周晓铢应用药理效应法同时测定双氯芬酸钠与青风藤水提物药动学参数，实验研究表明，应用药理效应法所测得药动学参数接近于药物在体内的真实情况。对青藤碱的内在质量的评价质量的评价和临床应用临床应用起到很好的指导作用。确定量效关系。确定时效关系。拟合得到主要的药物动力学参数。进行生物等效性评价。实验步骤：实验步骤：3、生物热动力学法、生物热动力学法（1）：一切生命活动均伴随着能和物质的代谢与转化（2）：微生物的生长的能量代谢规律性、特征性明显，可被微量量热系统灵敏检视应用应用：常用于中药、药物制剂的微生物检查依据依据例子例子：肖小河等利用生物热动力学对注射剂进行无菌检查定义：定义：药物累积法又称毒理效应法，该法系在用药后不同间隔对多组动物重复用药,从而求出体存率,并据此进行药动学计算。应用实例：应用实例：1.黄衍民等以小鼠的急性死亡率为指标,测定了乌头注射液的表观药动学参数,结果表明药物的消除呈一级动力学过程并符合一室模型,为临床合理用药提供了科学依据。2.周昆等用多次给药的小鼠半数致死量法,测定了香加皮配方颗粒在体内的残存量和表观毒代动力学参数。结果发现香加皮配方颗粒体内残存量并不是随着时间而一直降低,在6,12h出现了两个高峰点,其后呈一级动力学 消除,12h以后消除相的消除半衰期t1/2=7.55h,消除速度常数K=0.0918/h。可知香加皮配方颗粒的毒性成分代谢过程较复杂,可能存在肠肝循环或毒性代谢产物生成。4.药物累积法药物累积法三、应用及价值生物效应生物效应评价技术评价技术的应用的应用中药鉴定中药鉴定安全评价安全评价质量控制质量控制质量控制质量控制质量控制质量控制 1.1.指标性成分指标性成分指标性成分指标性成分不一定是有效不一定是有效不一定是有效不一定是有效成分。成分。成分。成分。2.2.即使是有效即使是有效即使是有效即使是有效成分，其含量成分，其含量成分，其含量成分，其含量高低与质量优高低与质量优高低与质量优高低与质量优劣也不一定有劣也不一定有劣也不一定有劣也不一定有必然联系必然联系必然联系必然联系。33.指标性成分指标性成分指标性成分指标性成分不能真实地反不能真实地反不能真实地反不能真实地反映中药制剂的映中药制剂的映中药制剂的映中药制剂的稳定性变化。稳定性变化。稳定性变化。稳定性变化。4.4.指标性成指标性成指标性成指标性成分不能客观分不能客观分不能客观分不能客观地反映道地地反映道地地反映道地地反映道地药材的物质药材的物质药材的物质药材的物质内涵。内涵。内涵。内涵。现行的以现行的以现行的以现行的以指标性成分定性定量分析指标性成分定性定量分析指标性成分定性定量分析指标性成分定性定量分析为核心内容为核心内容为核心内容为核心内容的中药质量控制方法体系存在的中药质量控制方法体系存在的中药质量控制方法体系存在的中药质量控制方法体系存在很多很多很多很多局局局局限。限。限。限。板蓝根、冬虫夏草分别以精氨酸和腺苷为指标成分控制质量，但与疗效几无关系。人参人参人参茎叶中人参皂苷人参茎叶中人参皂苷含量远高于人参含量远高于人参(主主根根)，若仅以皂苷含，若仅以皂苷含量高低来量化质量，量高低来量化质量，必然得到人参茎叶优必然得到人参茎叶优于人参于人参(主根主根)的结论的结论 道地药材是历代中医评价中药材品质的“金标准”。是优质正品药材的代名词，然而以指标性成分的含量高低而论，许多道地药材的质量却不一定优于普通药材。李东垣在他多年的李东垣在他多年的李东垣在他多年的李东垣在他多年的临床经验中总结出：临床经验中总结出：临床经验中总结出：临床经验中总结出：“凡诸草木昆虫凡诸草木昆虫凡诸草木昆虫凡诸草木昆虫,产产产产之有地之有地之有地之有地,失其地则性失其地则性失其地则性失其地则性味少异。味少异。味少异。味少异。”中药特征中药特征传统中药质控方法特点传统中药质控方法特点生物效应法特点生物效应法特点中医基础理论中医基础理论指导，产地、指导，产地、杂质来源广，杂质来源广，成分复杂，有成分复杂，有效成分不明确，效成分不明确，质量控制难。质量控制难。单一或多指标单一或多指标成分定性定量成分定性定量测定，评价体测定，评价体系不全面，评系不全面，评价内容难以反价内容难以反映临床疗效与映临床疗效与中医药的整体中医药的整体观念。观念。直接反映中药直接反映中药的有效性和安的有效性和安全性，量效关全性，量效关系确切，易于系确切，易于量化评价，不量化评价，不用关注中药具用关注中药具体的物质组成体的物质组成可整体活性评可整体活性评价。价。中药质量控制中应用生物效应检定法的必要性中药质量控制中应用生物效应检定法的必要性中药质量控制中应用生物效应检定法的必要性中药质量控制中应用生物效应检定法的必要性 肖小河等以物质基础相对清楚的黄连为例，从最简单的抑菌活性出发，比较化学和生物方法表征黄连质量的差异性，探讨生物检定方法控制中药质量的必要性。一般认为，生物碱是黄连的药效物质，其中小檗碱含量最高，因此药典以小檗碱作为质控指标。从表从表1中可以看出，小檗碱含量随黄连生长中可以看出，小檗碱含量随黄连生长年限延长而降低，生长期越短的黄连质量反年限延长而降低，生长期越短的黄连质量反而而“越好越好”，这与传统认为黄连，这与传统认为黄连46年采收为年采收为宜不一致。宜不一致。但以生物检定方法来评价，四年后的但以生物检定方法来评价，四年后的黄连抑菌效果明显优于二年生者黄连抑菌效果明显优于二年生者。从从图图1可以直观看出生长年限长的黄连可以直观看出生长年限长的黄连使大肠杆菌生长代谢曲线延后使大肠杆菌生长代谢曲线延后，抑制抑制作用强。作用强。由此可见，即使是物质基础相对较清楚的 黄连，现行的主要基于指标性成分含量测定的质控模式也难以准确表征其质量，更何况大多数中药物质基础还不明确，所测的化学成分仅仅是指标性成分与药效关联不大甚至没有关联。因此，目前主要基于化学定性定量分析的质控模式亟待完善和提高，而直接关切有效性和安全性的生物检定方法可能是解决问题的出路。1.1.直接关切中药的有效性直接关切中药的有效性和安全性。和安全性。3.3.量效关系确切，可量化量效关系确切，可量化的效价值为临床用药剂量的效价值为临床用药剂量的规范化提供参考依据。的规范化提供参考依据。2.2.突出中药学的药效学作突出中药学的药效学作用，直接关切中药用药的用，直接关切中药用药的有效性，安全性。有效性，安全性。4.4.不用关注中药具体的物不用关注中药具体的物质组成，不受物质基础研质组成，不受物质基础研究进程的限制，符合中药究进程的限制，符合中药物质基础研究现状。物质基础研究现状。生物效应法生物效应法控制中药质控制中药质量的优势量的优势符合中药特点克服传统质控缺点拥有独特优势生物效生物效应法的应法的研究具研究具有实在有实在意义意义四、问题及解决问题一 生物活性测定与中药的“功能主治”只能部分相关而不能完全一致。而且，现有的生物活性测定方法只能对中药的某种或某些主要功效进行验证研究,或在现有相对成熟的药效学实验中选取一种或几种方法和指标进行,难以完全真实地反映药物所有的功效。现有主要生物效应有:酶活力、抗病毒、抗炎、抗菌活性等。但由于很多中药的作用不是单一的,而是复合的。而我们要做的就是寻找把这些复合作用进行生物效应评价的方法，建立药物生物效应评价法的标准体系。我们可以尝试将生物离体模型与生物整体相结合进行试验，用数学的方法相关联，寻找适合的评价标准体系。解决解决问题二 生物活性测定方法学建立中生物活性测定方法学建立中标准品的选择标准品的选择 由于中药及中药注射剂成分复杂由于中药及中药注射剂成分复杂,而在生而在生物检定法中规定物检定法中规定,尽量采用基本同质的标准尽量采用基本同质的标准品以测定供试品的相对效价品以测定供试品的相对效价,首选中药标准首选中药标准品品,并且大部分中药标准品都没有标定其效并且大部分中药标准品都没有标定其效价价,这就更增加了标准品选择的难度这就更增加了标准品选择的难度。解决 尝试对中药标准品效价单位进行定义尝试对中药标准品效价单位进行定义 利用生物活性测定法测定药物的效价时利用生物活性测定法测定药物的效价时,要求要求已知标准品的理论效价已知标准品的理论效价,才能测定出供试品的测得才能测定出供试品的测得效价。而由于中药标准品均没有标识其理论效价效价。而由于中药标准品均没有标识其理论效价值值,这就成了生物活性测定法用于中药质量控制的这就成了生物活性测定法用于中药质量控制的障碍障碍,因此可利用西药理论效价标识的方法因此可利用西药理论效价标识的方法,尝试尝试建立针对相应活性的中药标准品的效价单位建立针对相应活性的中药标准品的效价单位,将大将大大推动中药标准品的发展。大推动中药标准品的发展。能否用西药或中药中能否用西药或中药中能否用西药或中药中能否用西药或中药中的指标成分作为其标的指标成分作为其标的指标成分作为其标的指标成分作为其标准品还有待进一步的准品还有待进一步的准品还有待进一步的准品还有待进一步的研究研究研究研究？问题三 生物测定方法存在一定因生物个体差异生物测定方法存在一定因生物个体差异而引起的误差而引起的误差,精密度和重现性较差精密度和重现性较差,因而因而对实验方法对实验方法、观察指标观察指标、限值剂量的设计限值剂量的设计要求较高要求较高,需要多次验证需要多次验证,才能建立一种相才能建立一种相对成型的方法和指标对成型的方法和指标。解决 对实验相关性和重复性进行严格要求对实验相关性和重复性进行严格要求 相关性，选取与药物的临床疗效有高度相关性，选取与药物的临床疗效有高度相关性的指标；重复性，由于生物活性法相关性的指标；重复性，由于生物活性法所用生物可能会因个体差异造成重复性差所用生物可能会因个体差异造成重复性差应在实验过程中在严格规定的条件下，保应在实验过程中在严格规定的条件下，保证实验的稳定性和可重复性；灵敏性，要证实验的稳定性和可重复性；灵敏性，要求所选指标与药物浓度有良好的量效求所选指标与药物浓度有良好的量效关关系，系，并且能随药物并且能随药物剂剂量的变化有显著变化量的变化有显著变化。特异反应剔除和缺项补足特异反应剔除和缺项补足特异反应剔除和缺项补足特异反应剔除和缺项补足特异反特异反应剔除和缺剔除和缺项补足足 特异反特异反应剔除剔除 在同一在同一剂量量组内的各个反内的各个反应中，如出中，如出现个个别特大或特小的反特大或特小的反应，应按下法判断其是否可以剔除。按下法判断其是否可以剔除。方法如下，将各数值按大小排列如下：方法如下，将各数值按大小排列如下：缺项补足缺项补足 因反应值被剔除或因故反应值缺失造成缺项，致m不等时,根据实验设计类型做缺项补足，使各剂量组的反应个数m相等。方法1：随机设计 对缺失数据的剂量组，以该组的反应均值补入，缺1个反应补1个均值,缺2个反应补2个均值。方法2：随机区组设计 结语 中药质量控制和评价是保证中药有效性和安全性的重要前提，是制约中药现代化发展的关键科学问题之一，也一直是中医药研究的难点和热点。现行的中药质量控制模式和方法仅能控制部分指标性成分的一致性和稳定性，不能直接反映有效性和安全性，难以完全、有效控制中药的质量。中药的有效性最终还是落实到生药的生物效应,所以生物效应评价法是中药药效相关性研究不可缺少的手段。建立一种有代表性的生物效应评价方法从新的角度对中药品种进行鉴定,评价其质量,结合传统的指标性组分含量测定和化学指纹图谱等定性定量分析,综合评价,建立生物效应法与化学指纹图谱关联分析的中药有效成分筛选方法和质量评价体系,作为一种辅助手段,用于从生物效应角度区别不同品种以及同一品种不同产地的药材,保证药材质量,确定其安全性、有效性、稳定性。确保临床使用更加安全、有效,最终为创新药物研制、提取物、相关产品二次开发提供一定的科学依据。谢谢谢谢谢谢谢谢