酶分析法-课件

8酶分析法ppt课件8酶分析法 ppt课件1教学目的和要求教学目的和要求 l熟悉：熟悉：1酶活力的测定方法酶活力的测定方法 2酶法分析的测定方法酶法分析的测定方法l了解：酶分析法的原理了解：酶分析法的原理教学目的和要求 熟悉：2概概 述述l1.酶的概念酶的概念是生物体内产生并具有催化活是生物体内产生并具有催化活性的性的一类蛋白质一类蛋白质，由于表现出特异的催化，由于表现出特异的催化功能，因此酶被称为生物催化剂。功能，因此酶被称为生物催化剂。l2.酶的应用酶的应用：在体外进行催化反应：在体外进行催化反应l用以制造某些产品用以制造某些产品l用以去除某些物质用以去除某些物质l用以识别某种化合物用以识别某种化合物 属于属于“酶分析法酶分析法”l用以测定某种物质用以测定某种物质概 述1.酶的概念是生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质3酶分析法-课件4酶分析法-课件5概概 述述l3.酶分析法包括两种类型酶分析法包括两种类型：l一是以酶作为一是以酶作为分析对象分析对象，这类分析方法称，这类分析方法称为为“酶活力测定酶活力测定”。l二是以酶作为二是以酶作为分析手段分析手段，用以测定样品中，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，通常将用一般化学方法难于检测的物质，通常将这类分析方法称为这类分析方法称为“酶法分析酶法分析”；概 述3.酶分析法包括两种类型：64.两类酶分析法的区别两类酶分析法的区别l相同：从原理到方法相同：从原理到方法l不同：不同：酶活力测定法中酶活力测定法中，是以酶为分析是以酶为分析对象对象。使用的使用的底物底物应该应该过量过量。l酶法分析中酶法分析中，是以酶为分析是以酶为分析工具工具或分析或分析试试剂剂,被检化合物（如：被检化合物（如：底物底物）是反应的限是反应的限制因素制因素4.两类酶分析法的区别7酶法分析的优点酶法分析的优点1 用于复杂组分中结构或物理化学性质比较相近的同类物质的分离鉴定和分析。2 特异性强、干扰少、操作简单、样品和试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特点。3 通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能发生的干扰反应并设法纠正。4 可用偶联反应。5 无污染或污染很少的分析方法。酶法分析的优点1 用于复杂组分中结构或物理化学性质比较相近的8n共同点：原理和方法相同，以酶的专一高效催化某化学反应为基础，通过测定酶反应的速率或生成物浓度来检测相应物质的含量。共同点：原理和方法相同，以酶的专一高效催化某化学反应为基础，9 酶法测定的原则酶法测定的原则、酶活性的测定、酶活性的测定1 12 2、代谢物浓度的测定、代谢物浓度的测定3 3、酶底物复合物、酶底物复合物 酶法测定的原则1、酶活性的测定2、代谢物浓度的测定3、酶底10酶反应动力学酶反应动力学1 1、米氏方程、米氏方程1 1）.米氏方程米氏方程nK Km m 即即为米氏常数，米氏常数，nV Vmaxmax为最大反最大反应速速度度n当反当反应速度等于最大速度速度等于最大速度一半一半时,即即V V=1/2 =1/2 V Vmax,max,Km=S Km=S n上式表示上式表示,米氏常数是反米氏常数是反应速度速度为最大最大值的一半的一半时的的底物底物浓度。度。n因此因此,米氏常数的米氏常数的单位位为mol/Lmol/L。酶反应动力学1、米氏方程1）.米氏方程Km 即为米氏常数112 2、KmKm米氏常数意义及推导过程米氏常数意义及推导过程不同的不同的酶具有不同的具有不同的KmKm值，它是，它是酶的一个重的一个重要的特征物理常数。要的特征物理常数。KmKm值只是在固定的底物，一定的温度和只是在固定的底物，一定的温度和pHpH条条件下，一定的件下，一定的缓冲体系中冲体系中测定的，不同条件定的，不同条件下具有不同的下具有不同的KmKm值。KmKm值表示表示酶与底物之与底物之间的的亲和程度：和程度：K Km m值大大表示表示亲和程度小，和程度小，酶的催化活性低的催化活性低;K Km m值小小表示表示亲和程度大和程度大,酶的催化活性高。的催化活性高。2、Km米氏常数意义及推导过程不同的酶具有不同的Km值，它是12计算算题l要求要求酶按其最大反按其最大反应速度的速度的99%99%的速度的速度进行反行反应，求所需底物，求所需底物浓度度S S。l已知已知S S9Km,9Km,求求该酶体系的反体系的反应速度速度为何何值？l过氧化氧化氢酶的的KmKm为2.5102.5102 2mol/Lmol/L，当底，当底物物浓度度为100mmol/L100mmol/L时，求反，求反应速度达到速度达到最大速度的百分数？最大速度的百分数？计算题要求酶按其最大反应速度的99%的速度进行反应，求所需底13第一节第一节 酶活力测定法酶活力测定法l 一、基本概念一、基本概念 l 二、酶促反应的条件二、酶促反应的条件l 三、酶活力的测定方法三、酶活力的测定方法l 四、测定过程中应注意的问题四、测定过程中应注意的问题 第一节 酶活力测定法 一、基本概念 14一、基本概念一、基本概念l1.酶活力酶活力：指酶催化一定化学反应的能力。：指酶催化一定化学反应的能力。l2.酶活力的测定：酶活力的测定：是测定一个被酶所催化是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。的化学反应的速度。l3.酶活力测定的目的：酶活力测定的目的：通过酶反应速度的通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量测定，求得酶的浓度或含量一、基本概念1.酶活力：指酶催化一定化学反应的能力。15酶活力酶活力(enzyme activity)(enzyme activity)的测定的测定 l1 1酶活力酶活力l酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，l酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高；反应速率愈小，酶的活力就愈低。两者呈线性关系。l所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速测定酶的活力就是测定酶促反应的速率率。酶活力(enzyme activity)的测定 1酶活力16l酶催化的反反应应速速率率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。l在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。lV=p/t p=v t酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表17引起酶促反应速率降低的原因引起酶促反应速率降低的原因l(1)底物浓度的降低；l(2)产物浓度增加加速了逆反应的进行；l(3)产物对酶的抑制或激活作用l(4)随着时间的延长引起酶本身部分分子失活等。l因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率，反应初速率与酶量呈线性关系，因此可以用初速率来测定制剂中酶的含量。引起酶促反应速率降低的原因(1)底物浓度的降低；18检验酶反应和测定系统是否适宜的标准检验酶反应和测定系统是否适宜的标准l测得的测得的反应速度反应速度必须和必须和酶浓度酶浓度间有间有线线性的比例关系性的比例关系检验酶反应和测定系统是否适宜的标准测得的反应速度必须和酶浓度19一、基本概念一、基本概念l4.酶反应的速度：酶反应的速度：用单位时间内反应底物用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应的速的减少或产物的增加来表示，酶反应的速度愈快所表示的酶活力愈高。度愈快所表示的酶活力愈高。l5.测定酶活力的方法测定酶活力的方法：可用物理法、化学：可用物理法、化学法或酶分析法等方法。法或酶分析法等方法。一、基本概念4.酶反应的速度：用单位时间内反应底物的减少或产20一、基本概念一、基本概念l6.常用的酶分析法常用的酶分析法l第一，终点法第一，终点法l第二，取样测定法第二，取样测定法l第三，连续测定法第三，连续测定法一、基本概念6.常用的酶分析法21一、基本概念一、基本概念l7.酶的活性单位（国际单位酶的活性单位（国际单位U）：在：在25及最及最适条件下，每分钟能转化一个微摩尔适条件下，每分钟能转化一个微摩尔(mol)底物的酶量定为一个活性单位。底物的酶量定为一个活性单位。l8.酶的比活性：酶的比活性：为一毫克为一毫克(mg)酶的活性单位数酶的活性单位数目。目。一、基本概念22国际酶活力单位国际酶活力单位l1961年,国际生物化学协会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(U)来表示酶活力，规定规定为：在最适反应条件(温度25)下，每分钟内催化1微摩尔(umo1)底物转化为产物所需的酶量,定为一个酶活力单位，即l 1 U=1 umol1 U=1 umolminmin。国际酶活力单位1961年,国际生物化学协会酶学委员会提出采用23酶的比活力酶的比活力(specific activity)(specific activity)l比比活活力力:每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，l比活力=活力Umg蛋白=总活力U/总蛋白mgl有时用每g酶制剂或每m1酶制剂含有多少个活力单位来表示(Ug或Uml)。l比比活活力力大大小小的的含含义义：可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。比活力愈大，表示酶的纯度愈高。酶的比活力(specific activity)比活力:每m24活力单位活力单位(U U)与比活力与比活力lU U速度单位速度单位l l每小时催化每小时催化每小时催化每小时催化1克底物克底物克底物克底物l l每小时催化每小时催化每小时催化每小时催化1mlmlmlml某浓度溶液某浓度溶液某浓度溶液某浓度溶液l l每分钟催化每分钟催化每分钟催化每分钟催化1ug1ug1ug1ug底物底物底物底物l酶产品质量评价中常使用比活力l l单位质量单位质量单位质量单位质量酶产品中酶活力称酶产品中酶活力称比活力比活力。l u/mgu/mg酶蛋白酶蛋白 u/ml u/ml酶蛋白酶蛋白l国际单位（国际单位（IUIU）：在实验规定的条件下（）：在实验规定的条件下（2525，最适，最适pHpH、最适底物浓度时），、最适底物浓度时），1ul1ul标本，以标本，以每分钟能催化每分钟能催化1 1微摩尔底物的酶量为微摩尔底物的酶量为1 1个国际单个国际单位。位。活力单位(U)与比活力U速度单位25酶促反应速度的测定方法酶促反应速度的测定方法产物浓度变化曲线产物浓度变化曲线产物浓度变化曲线产物浓度变化曲线提提问：为什么反什么反应速度会随速度会随时间减小？减小？答案：答案：1.S降低；降低；2.酶受到受到产物抑制物抑制提提问：用哪一个速度来表示用哪一个速度来表示该酶促反促反应的速度特征呢？的速度特征呢？反应初速度反应初速度反应初速度反应初速度 V Vo o反反应初初速度表示速度表示酶活力。活力。提问：提问：仅用反应初速度大小对比酶活力行吗？仅用反应初速度大小对比酶活力行吗？答案答案：不行，不行，还与酶的加入量及条件有关。还与酶的加入量及条件有关。酶促反应速度的测定方法产物浓度变化曲线提问：为什么反应速度会26酶活力测定实例酶活力测定实例l首先首先 确定反应条件确定反应条件 20、pH=7，底物浓度，底物浓度 6g/l（过量）（过量），加入，加入2mg固体脂肪酶固体脂肪酶l第二第二 确定活力单位确定活力单位 如每小时催化如每小时催化1克底物克底物 1u=1g/hl第三第三 测算反应初速度测算反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线，量作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值出反应初速度值，换算为脂肪的消耗速度，换算为脂肪的消耗速度 如如 8g/hl第四第四 换算活力换算活力 8g/h/1g/h=8ul第五第五 计算比活计算比活 8u/2mg酶蛋白酶蛋白=4u/mg酶蛋白酶蛋白脂肪脂肪脂肪脂肪脂肪酶脂肪酶甘油甘油甘油甘油+脂肪酸脂肪酸脂肪酸脂肪酸酶活力测定实例首先 确定反应条件 20、pH=7，底27 l 活性部位 活性28 作作 业l根据所学知根据所学知识推推导出米氏方程。出米氏方程。作 业根据所学知识推导出米氏方程。29二、酶促反应的条件二、酶促反应的条件l基本要求基本要求：l反应系统中除了反应系统中除了待测酶的浓度待测酶的浓度是影响速度是影响速度的的惟一因素惟一因素外，其他因素都处于最适于酶外，其他因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平。发挥催化作用的水平。二、酶促反应的条件基本要求：30确定反应条件时应考虑确定反应条件时应考虑：（1）底物底物 选用的底物在物理化学性质上选用的底物在物理化学性质上和产物不同和产物不同。一般选用底物的浓度一般选用底物的浓度S=100 Km 一般选择一般选择Km小的作测定的底物。小的作测定的底物。确定反应条件时应考虑：31l（2）pH值值 注意选择适宜的反应注意选择适宜的反应pH值，值，并将反应维持在这一并将反应维持在这一pH值。值。l例：丙酮酸例：丙酮酸 乳酸乳酸乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（2）pH值 注意选择适宜的反应pH值，并将反应维持在32pHpH对酶反应的影响对酶反应的影响pH对酶反应的影响33 pHpH影响酶活力的原因影响酶活力的原因 l(1)过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。l(2)当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。l影响了底物的解离状态；l影响酶分子活性部位上有关基团的解离；l影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物。pH影响酶活力的原因(1)过酸或过碱可以使酶的空间结构34二、酶促反应的条件二、酶促反应的条件（3）温度温度 实验中温度变动应控制在实验中温度变动应控制在0.1以内。酶反应的温度通常选用以内。酶反应的温度通常选用25、30、37。（4）辅助因子辅助因子 为了提高酶在反应系统中为了提高酶在反应系统中的稳定性，有些也需要某些相应的物质。的稳定性，有些也需要某些相应的物质。二、酶促反应的条件（3）温度 实验中温度变动应控制在035最适温度最适温度 机理：机理：温温度导致度导致酶蛋白酶蛋白变性变性温度温度对酶反反应的影响的影响最适温度 机理：温度导致酶蛋白变性温度对酶反应的影响36温度对酶反应的影响温度对酶反应的影响l在最适温度之前，一般温度越高，反应速度就越快。l酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力要高。通常酶制剂以固体保存为佳。温度对酶反应的影响在最适温度之前，一般温度越高，反应速度就越37（5）空白和对照空白和对照 空白空白 指杂质反应和自发反应引起的变化量，指杂质反应和自发反应引起的变化量，提提供未知因素的影响供未知因素的影响 对照对照作为比较或标定的作为比较或标定的标准标准。（5）空白和对照 38三、酶活力的测定方法三、酶活力的测定方法l按取样及检测的方式按取样及检测的方式l（一）取样测定法（一）取样测定法l（二）连续测定法（二）连续测定法三、酶活力的测定方法39（一）取样测定法（一）取样测定法l1.取样测定法：取样测定法：求得单位时间内酶促求得单位时间内酶促反应变化量的方法。反应变化量的方法。l2.常用的检测方法常用的检测方法：紫外：紫外-可见分光可见分光光度法、荧光分析法等。光度法、荧光分析法等。（一）取样测定法1.取样测定法：求得单位时间内酶促反应变化量40取样测定法取样测定法 在酶反应开始后不同的时间，从反应系统在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法中取出一定量的反应液，并用适当的方法（添加酶的变性剂或使酶失活）停止其反（添加酶的变性剂或使酶失活）停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别，选用适当的检测方法进行定量分析，差别，选用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。求得单位时间内酶促反应变化量的方法。取样测定法 在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一41取样测定法取样测定法取样测定法一直沿袭至今是因为：取样测定法一直沿袭至今是因为：l不需要特殊仪器不需要特殊仪器l几乎所有酶反应都可根据产物或底几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出具体的测定方法物的化学性质找出具体的测定方法l由于色源底物和荧光源底物的发展，由于色源底物和荧光源底物的发展，可在原来的底物分子上接上相应的可在原来的底物分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。有色基团、发色基团或荧光基团。取样测定法取样测定法一直沿袭至今是因为：42l3、终止酶反应：、终止酶反应：添加酶的变性剂添加酶的变性剂l三氯醋酸：紫外光区有吸收三氯醋酸：紫外光区有吸收l高氯酸：对酸和氧化剂敏感的对象不适用高氯酸：对酸和氧化剂敏感的对象不适用3、终止酶反应：添加酶的变性剂43l4、特点：、特点：l不需要特殊仪器不需要特殊仪器l容易找到具体测定方法容易找到具体测定方法l色源底物和荧光源底物发展快色源底物和荧光源底物发展快4、特点：44（二）连续测定法（二）连续测定法l1.连续测定法连续测定法：基于底物和产物在：基于底物和产物在物理化物理化学性质上的不同学性质上的不同，在反应过程中对反应系，在反应过程中对反应系统进行直接连续检测的方法。统进行直接连续检测的方法。l2.常用的检测方法常用的检测方法（二）连续测定法1.连续测定法：基于底物和产物在物理化学性45连续测定法连续测定法l基于底物和产物在物理化学性质基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应上的不同，在反应过程中对反应系统进行连续检测的方法。系统进行连续检测的方法。连续测定法的准确性和测定效率连续测定法的准确性和测定效率比较好比较好连续测定法基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中46酶活不能反映酶的使用效果 只能用于产品质量的控制酶活不能反映酶的使用效果 只能用于产品47测定过程中应注意的问题测定过程中应注意的问题l产物的测定l反应速度的测定l测定要达到的要求测定过程中应注意的问题产物的测定48酶反应进程曲线酶反应进程曲线01 12 23 34 45 56 60 05 5101015152020t/minc/mg/mLc/mg/mL5040302010酶量酶量生化药物制剂检验程序生化药物制剂检验程序酶反应进程曲线012345605101520t/minc/m49生化药物制剂检验程序生化药物制剂检验程序酶浓度曲线的关系酶浓度曲线的关系0 00.10.10.20.20.30.30.40.40.50.50.60.60 0101020203030404050506060酶量酶量反应速率反应速率t=15t=10t=5t/min生化药物制剂检验程序酶浓度曲线的关系00.10.20.30.50酶分析法的检测方法酶分析法的检测方法酶分析法的检测方法51l最常用的方法介绍如下：最常用的方法介绍如下：l(1)(1)紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法l(2)(2)荧光分析法荧光分析法l(3)(3)旋光度法旋光度法l(4)(4)酶偶联测定法酶偶联测定法l(5)(5)其他检测法其他检测法酶分析法的检测方法酶分析法的检测方法最常用的方法介绍如下：酶分析法的检测方法52一、紫外一、紫外-可见分光光度法可见分光光度法 NADNAD+(烟烟酰酰胺胺-腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸，又又称称为为辅辅酶酶I)I)和和NADPNADP+(烟烟酰酰胺胺-腺腺嘌嘌呤呤磷磷酸酸二二核核苷苷酸酸,又又称为辅酶称为辅酶II)II)是维生素烟酰胺的衍生物，是维生素烟酰胺的衍生物，一、紫外-可见分光光度法 NAD+(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸53还原还原氧化氧化NAD+NADH在在338.5nm338.5nm与与340.5nm340.5nm之之间有一个最大吸收峰间有一个最大吸收峰300-400nm300-400nm无吸收无吸收还原氧化NAD+NADH在338.5nm与340.5nm之354丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+LDH乳酸乳酸+NAD+NAD+例例 1、例例 2、天冬氨酸天冬氨酸+a-草酰酮戊二酸草酰酮戊二酸谷氨酸谷氨酸+草酰乙酸草酰乙酸GOT草酰乙酸草酰乙酸+NADH+H+NADH+H苹果酸苹果酸+NAD+NAD+MDH丙酮酸+NADH+H+LDH乳酸+NAD+例 1、例 2、天55酶偶联测定法酶偶联测定法：是应用过量、高度专一的：是应用过量、高度专一的“偶联工具酶偶联工具酶”使被测酶反应能连续进行到某一可使被测酶反应能连续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。被测反应被测反应偶联指示反应偶联指示反应酶偶联测定法：是应用过量、高度专一的被测反应偶联指示反应56被测反应被测反应肌激酶肌激酶辅助反应辅助反应丙酮酸激酶丙酮酸激酶指示反应指示反应乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶被测反应肌激酶辅助反应丙酮酸激酶指示反应乳酸脱氢酶57二、荧光分析法二、荧光分析法三三 华勃氏呼吸仪检压法华勃氏呼吸仪检压法四、放射性同位素测定法四、放射性同位素测定法二、荧光分析法三 华勃氏呼吸仪检压法四、放射性同位素测定法58华勃氏微量呼吸仪（瓦氏呼吸仪）华勃氏微量呼吸仪（瓦氏呼吸仪）华勃氏微量呼吸仪（瓦氏呼吸仪）59五五 电化学法（电化学法（electrochemicalelectrochemical）lpHpH测测定定法法：用高灵敏度的pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化来测定酶的反应速率。l离离子子选选择择电电极极法法：测定某些酶的酶活力，用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应，如葡糖氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。五 电化学法（electrochemical）pH测定法：用60第二节第二节 酶法分析酶法分析l 一、终点测定法一、终点测定法 l 二、反应速度法二、反应速度法 第二节 酶法分析 一、终点测定法 61一、原理一、原理是在以待测物质为底物的酶反应中，如果是在以待测物质为底物的酶反应中，如果能使底物能够接近完全地转化为产物，而能使底物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又具有某种特征性质，通过且底物或产物又具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的减少量，产物的直接测定转化前后底物的减少量，产物的增加量或辅酶的变化就可以定量待测物增加量或辅酶的变化就可以定量待测物平衡法平衡法 一、原理是在以待测物质为底物的酶反应中，如果能使底物能够接近62 l用于复杂组分中结构或物理化学性质比较用于复杂组分中结构或物理化学性质比较 相近的同类物质的相近的同类物质的分离鉴定和分析分离鉴定和分析。l特异性强、干扰少、操作简单、样品和试特异性强、干扰少、操作简单、样品和试 剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特 点。点。l通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能 发生的干扰反应并设法纠正。发生的干扰反应并设法纠正。l可用偶联反应。可用偶联反应。l无污染或污染很少的分析方法。无污染或污染很少的分析方法。优优 点点 ：用于复杂组分中结构或物理化学性质比较 相近63一、终点测定法一、终点测定法l1.原理原理：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量质（第二底物）等的变化量。l2.一般采用的测定方法：一般采用的测定方法：l光吸收、荧光之类的分光光度法光吸收、荧光之类的分光光度法l测定气体产生与吸收的测压量气法（华勃氏测定气体产生与吸收的测压量气法（华勃氏呼吸仪检压法）呼吸仪检压法）l检知检知pH值变化的滴定法值变化的滴定法l同位素跟踪测定法同位素跟踪测定法一、终点测定法1.原理：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成64（一）终点法条件（一）终点法条件 l 1酶的底物特异性（专一性）酶的底物特异性（专一性）：具有高度的底：具有高度的底物专一性，有一些酶是呈族特异性；物专一性，有一些酶是呈族特异性；l 2反应的平衡反应的平衡：l酶反应若平衡十分偏向进行方向，则可方便地酶反应若平衡十分偏向进行方向，则可方便地用终点测定法检测；用终点测定法检测；l但若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或者但若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或者偏向逆方向，此时由于反应不能完全，因而反偏向逆方向，此时由于反应不能完全，因而反应就不能正确定量，解决这一问题，通常可采应就不能正确定量，解决这一问题，通常可采取一些措施。取一些措施。（一）终点法条件 1酶的底物特异性（专一性）：具有高度的65反应的平衡反应的平衡谷氨酸谷氨酸+NAD+H2Oa-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+NH+谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶NADH+丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸+NAD+乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶反应的平衡谷氨酸+NAD+H2Oa-酮戊二酸+NADH+N66l 3反应液中的酶量反应液中的酶量：要使酶反应在短时间内：要使酶反应在短时间内完成，只有使用对底物亲和性很大的酶（即完成，只有使用对底物亲和性很大的酶（即Km要小），酶用量（即要小），酶用量（即Vmax）必须大才能达到此）必须大才能达到此点。工作中，在点。工作中，在10min内反应完成内反应完成99%，则常，则常数数K以以1.0min-1为宜。为宜。l 4反应产物抑制：反应产物抑制：如果产物对反应本身有抑制如果产物对反应本身有抑制作用，则会妨碍反应进行，在这种情况下可将作用，则会妨碍反应进行，在这种情况下可将该产物除去或者和再生系统偶联等办法解决。该产物除去或者和再生系统偶联等办法解决。3反应液中的酶量：要使酶反应在短时间内完成，只有使用对67反应产物抑制反应产物抑制S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸丙酮酸激酶丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸S激酶激酶反应产物抑制S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙68（二）终点法种类（二）终点法种类l1单酶反应定量法：单酶反应定量法：（1）底物减少量的测定底物减少量的测定：在以待测物质为：在以待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近完全地底物的酶反应中，如果底物能接近完全地转化为产物，且又具有某种特征性质（例转化为产物，且又具有某种特征性质（例如特征的吸收谱带）时，则就可能简便地如特征的吸收谱带）时，则就可能简便地通过直接测定底物的减少量，而定量待测通过直接测定底物的减少量，而定量待测物。物。（二）终点法种类1单酶反应定量法：69（二）终点法种类（二）终点法种类（2）产物增加量的测定产物增加量的测定：在以被测物为底：在以被测物为底物的酶的反应中，如果底物基本上都能转物的酶的反应中，如果底物基本上都能转变为产物，而产物又具有可以专一地进行变为产物，而产物又具有可以专一地进行定量测定的性质，那么根据产物增加就能定量测定的性质，那么根据产物增加就能检知底物的量。检知底物的量。（3）辅酶变化量的测定辅酶变化量的测定：以：以NAD或或NADP为辅酶的脱氢酶反应，通过测定为辅酶的脱氢酶反应，通过测定340nm吸吸收度的变化，就能对作为相应脱氢酶底物收度的变化，就能对作为相应脱氢酶底物的物质进行定量分析。的物质进行定量分析。（二）终点法种类（2）产物增加量的测定：在以被测物为底物的酶701.羟基丙酮酸的定量测定羟基丙酮酸的定量测定羟基丙酮酸羟基丙酮酸+NADH+H+NADH+HDD甘油酸甘油酸+NAD+NAD+L-L-谷氨酸谷氨酸+NAD+NAD+H+H2 2O O甘油酸甘油酸脱氢酶脱氢酶2.L-2.L-谷氨酸谷氨酸的定量测定的定量测定a-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+NH+NADH+NH4 4+谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶1.羟基丙酮酸的定量测定羟基丙酮酸+NADH+HD甘油71l2和指示酶反应偶联的定量法和指示酶反应偶联的定量法（1）以脱氢酶为指示剂以脱氢酶为指示剂：用来作为偶联指：用来作为偶联指示剂的酶中应用得最广泛的是以示剂的酶中应用得最广泛的是以NAD或或NADP为辅酶的脱氢酶类为辅酶的脱氢酶类（2）以脱氢酶以外的酶作指示剂以脱氢酶以外的酶作指示剂：参与某：参与某些色素氧化还原的酶中有的可用作指示剂，些色素氧化还原的酶中有的可用作指示剂，反应的进行可由吸收度的变化来测定。反应的进行可由吸收度的变化来测定。2和指示酶反应偶联的定量法722 2、和指示酶反应偶联的定量法、和指示酶反应偶联的定量法以脱氢酶为指示剂以脱氢酶为指示剂1-1-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖6-6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖磷酸葡萄糖变位酶磷酸葡萄糖变位酶1 1，6-6-二磷酸葡萄糖二磷酸葡萄糖6-6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖+NADP+NADP6-6-磷酸磷酸-葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸+NADPH+H+NADPH+H+6-6-磷酸磷酸-葡萄糖脱氢酶葡萄糖脱氢酶2、和指示酶反应偶联的定量法以脱氢酶为指示剂1-磷酸-葡萄73D-2-D-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶烯醇化酶磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸+ADP+ADP丙酮酸激酶丙酮酸激酶丙酮酸丙酮酸+ATP+ATP丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸乳酸+NAD+NAD+D-2-磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶磷酸烯醇丙酮酸+AD74以脱氢酶以外的酶为指示剂以脱氢酶以外的酶为指示剂D-D-葡萄糖的定量测定葡萄糖的定量测定葡萄糖葡萄糖葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸+H+H2 2O O2 2H H2 2O O2 2 +4-+4-氨基安替比林酚氨基安替比林酚醌亚胶色素醌亚胶色素+4H+4H2 2O O葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶过氧化物酶过氧化物酶以脱氢酶以外的酶为指示剂D-葡萄糖的定量测定葡萄糖葡萄糖醛75二、反应速度法二、反应速度法反应速度法反应速度法是在一定条件下（一定是在一定条件下（一定pHpH值和温值和温度），测定反应的初速度，而反应的初速度度），测定反应的初速度，而反应的初速度与被测物质的浓度成正比关系，因此可根据与被测物质的浓度成正比关系，因此可根据初速度计算被测物质的量，也可利用标准品初速度计算被测物质的量，也可利用标准品对照法计算被测物质的量。对照法计算被测物质的量。二、反应速度法反应速度法是在一定条件下（一定pH值和温度），76特特 点点：测定速度快测定速度快试剂用量少试剂用量少成本低成本低对浊度和色素的干扰不敏感对浊度和色素的干扰不敏感不需要考虑反应是否进行完全不需要考虑反应是否进行完全特 点：测定速度快试剂用量少成本低对浊度和色素77具体测定方法具体测定方法l（一）利用作底物的测定法（一）利用作底物的测定法 l（二）利用辅酶或抑制剂作用的测定方法（二）利用辅酶或抑制剂作用的测定方法 l（三）特殊的反应速度测定法（三）特殊的反应速度测定法 具体测定方法（一）利用作底物的测定法 78（一）利用作底物的测定法（一）利用作底物的测定法l 在一定在一定pH及温度下测反应初速度。反应及温度下测反应初速度。反应时除被测物（底物）外，其他影响反应速时除被测物（底物）外，其他影响反应速度的物质均是过剩，度的物质均是过剩，反应初速度则与被测反应初速度则与被测物的浓度成正比关系物的浓度成正比关系。（一）利用作底物的测定法 在一定pH及温度下测反应初速度。反79甘油三酯甘油三酯甘油甘油+脂肪酸脂肪酸甘油甘油+ATP+ATP甘油甘油-1-1-磷酸磷酸+ADP+ADPADP+PEPADP+PEP丙酮酸丙酮酸+ATP+ATP丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+乳酸乳酸+NAD+H+NAD+H2 2O O脂肪酶脂肪酶GKPKLDH甘油三酯甘油+脂肪酸甘油+ATP甘油-1-磷酸+ADPADP80（二）利用辅酶或抑制剂作用的测定方法（二）利用辅酶或抑制剂作用的测定方法l 如被测物质可作为某种酶专一的辅酶如被测物质可作为某种酶专一的辅酶（或抑制剂），则这种物质的浓度和将其（或抑制剂），则这种物质的浓度和将其作为辅酶（或抑制剂）的酶的反应速度之作为辅酶（或抑制剂）的酶的反应速度之间有关联，因此间有关联，因此通过测定该酶的反应速度通过测定该酶的反应速度就能进行这种物质的定量。就能进行这种物质的定量。（二）利用辅酶或抑制剂作用的测定方法 如被测物质可作为某种酶81D-2D-2，3-3-二磷酸甘油酸的定量测定二磷酸甘油酸的定量测定D-3-D-3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸D-2-D-2-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸磷酸甘油酸变位酶磷酸甘油酸变位酶D-2D-2，3-3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸D-2，3-二磷酸甘油酸的定量测定D-3-二磷酸甘油酸D-282（三）特殊的反应速度测定法（三）特殊的反应速度测定法 l如果将待测物质相关的两种酶反应偶联起如果将待测物质相关的两种酶反应偶联起来，构成待测物质能够再生的循环系统，来，构成待测物质能够再生的循环系统，然后再将可作指示剂的第三种酶反应在适然后再将可作指示剂的第三种酶反应在适当的条件下与之偶联，那么当的条件下与之偶联，那么指示剂酶反应指示剂酶反应的速度应该和待测物质量之间有一定的比的速度应该和待测物质量之间有一定的比例关系。例关系。（三）特殊的反应速度测定法 如果将待测物质相关的两种酶反应偶83乙酰磷酸乙酰磷酸+CoA-SH+CoA-SH乙酰乙酰CoA+CoA+磷酸磷酸PTA柠檬酸柠檬酸+CoA-SHCoA-SH草酰乙酸草酰乙酸+乙酰乙酰CoA+HCoA+H2 2O OCS苹果酸苹果酸+NAD+NAD+NADH+NADH+草酰乙酸草酰乙酸+H+H+MDH乙酰磷酸+CoA-SH乙酰CoA+磷酸PTA柠檬酸+CoA-84作作 业业1、什么是酶法分析？与酶活力测定有何异同？2、酶的活性单位（国际单位）是什么？3、酶活力的测定方法有几种?4、简述酶法分析中的终点测定法与反应速度法。作 业1、什么是酶法分析？与酶活力测定有何异同？85