植物分子生物学植物基因的同源克隆培训课件

植物分子生物学植物基因的同源克隆拟分离的基因在目标植物上没有报导过,然而在其它植物上有过报导，在genebank上搜索已分离出的该基因的核苷酸序列或氨基酸序列，通过序列同源性比较找出该基因的保守区，并在该保守区内设计寡核苷酸引物，通过扩增得到目标植物该基因的保守区片段，再通过基因组文库筛选获得该基因的全长，或通过cDNA文库筛选和（RapidAmplificationofcDNAends)获得该基因的cDNA全长。2植物分子生物学植物基因的同源克隆植物基因同源克隆的策略1.植物基因组DNA的提取与纯化保守区引物设计PCR扩增基因保守区片段构建基因组文库基因文库筛选基因全长的获得3植物分子生物学植物基因的同源克隆2.植物总RNA的提取与纯化逆转录cDNA保守区引物设计PCR扩增构建cDNA文库保守区cDNA片段设计RACE引物5/-RACE3/-RACEcDNA文库筛选基因的cDNA全长4植物分子生物学植物基因的同源克隆植物基因组DNA的提取与纯化1.CTAB法:提取缓冲液为100mMTris-HCl(pH8.0)1.4MNaCl，20mMEDTA(pH8.0)，2%（W/V）CTAB。2.SDS法：提取缓冲液为100-200mMTris-HCl(pH8.0)，0.25-0.5MNaCl，25-50mMEDTA(pH8.0)，0.5-2.0%（W/V）SDS（单独加）。5植物分子生物学植物基因的同源克隆植物DNA的提取方法6植物分子生物学植物基因的同源克隆植物DNA提取的必经步骤7植物分子生物学植物基因的同源克隆1.破碎细胞壁:液氮研磨。2.裂解细胞：CTAB（CetylTrimethylAmmoniumBromige，十六烷基三甲基溴化铵)或SDS(SodiumDodecylSulfate，十二烷基磺酸钠）裂解膜结构，EDTA螯合核酸酶中的Mg2+，65保温30-60min 钝化内源核酸酶。3.去除多酚类、多糖等次生物质。4.去除蛋白质：用酚、酚与氯仿（1:1）、氯仿与异戊醇（24:1）抽提；5MKAc（pH7.5)沉淀蛋白质；蛋白酶K水解蛋白质。5.沉淀核酸：0.6-1.0倍体积冰冷的异丙醇；2倍体积的无水乙醇；70%乙醇清洗沉淀中的无机离子。6.除RNA：用RNase消化；用LiCl沉淀RNA。7.浓缩DNA：0.1倍体积3MNaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀。8.溶解DNA沉淀：0.1或1TE(pH8.0）或无菌双蒸水。8植物分子生物学植物基因的同源克隆植物DNA提取的难点1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕褐色。2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共沉淀。这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和TaqDNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的失败。9植物分子生物学植物基因的同源克隆多酚、多糖与其它次生物质的去除10植物分子生物学植物基因的同源克隆1.材料的选择与处理：新鲜、幼嫩嫩芽、嫩叶、幼苗；叶片的饥饿处理：4黑暗处理1-2天，消耗淀粉和多糖。在研磨后用-20预冷的丙酮抽提2次。2.在细胞裂解之前分离细胞核（两步法）除多糖和多酚：研磨：破坏细胞壁，释放果胶类多糖细胞器与核膜保持完整 加入核分离缓冲液（不含去垢剂）混匀 低速离心去上清（多糖、酚类）加入含去垢剂的核裂解液。3.调整提取缓冲液的组成除多糖和多酚：NaCl：浓度为0.7M时，RNA与DNA溶于CTAB，而多糖不溶解，CTAB与多糖和残留的蛋白质形成复合物，通过氯仿或酚抽提停留在界面上，容易去除；浓度为0.4M时，核酸沉淀。CTAB：常用2.0%，多糖含量高的可提高至3.0%。pH值：通常为8.0，低pH（5.5）能避免酚类物质的电离和随后的氧化。11植物分子生物学植物基因的同源克隆4.在提取缓冲液中加入抗氧化剂除多酚：-巯基乙醇、抗坏血酸纳、半胱氨酸、二硫苏糖醇等提供巯基（-SH），与酚类物质竞争氧，防止酚氧化成醌，-巯基乙醇：常用0.1-2.0%，酚类高的可用至5.0%。有的在提取缓冲液中加入PPO的抑制剂如0.1%(W/V)DIECAdiethyldithiocarbamicacid。5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚：PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭：0.1-0.3%（W/V）。12植物分子生物学植物基因的同源克隆6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中；在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。7.CTAB/NaCl溶液（4.1%NaCl，10%CTAB）提取与氯仿/异戊醇抽提法除多糖：将DNA样品中的NaCl浓度调整到0.7M，加入0.1V的CTAB/NaCl溶液，混匀后用氯仿/异戊醇抽提，直到白色界面（多糖与其他大分子污染物）消失为止。13植物分子生物学植物基因的同源克隆8.使用糖苷水解酶：在DNA的粗提液中同时加入RNase和糖苷水解酶（如caylaseM3），在去除RNA的同时，也除去果胶类多糖。9.柱层析法除多糖：RPC-5反向柱层析；SyphacrylS-1000柱层析，结合PEG8000沉淀DNA相结合。10.稀释DNA样品：2ngDNA模板/反应。11.CsCl（氯化铯）梯度离心。14植物分子生物学植物基因的同源克隆植物总RNA的提取15植物分子生物学植物基因的同源克隆植物总RNA提取的必经步骤1.破碎植物组织细胞。2.核蛋白变性释放出RNA。3.抑制内外源RNase的活性。4.将RNA、DNA、蛋白质及其它细胞物质分开。16植物分子生物学植物基因的同源克隆植物总RNA提取的常见方法1.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白质并抑制RNase活性，经过多次酚/氯仿抽提后，再沉淀RNA。2.苯酚法：用SDS变性蛋白并并抑制RNase活性，经过多次酚/氯仿抽提去除蛋白、多糖、色素等杂质后，再用NaAc和乙醇沉淀RNA。3.LiCl沉淀法：0.8MLiCl会特异沉淀RNA。4.CTAB法。17植物分子生物学植物基因的同源克隆植物总RNA提取的难点1.内外源RNase的污染。2.多酚类物质的干扰3.蛋白质的干扰4.多糖的干扰18植物分子生物学植物基因的同源克隆创造一个无RNase的环境19植物分子生物学植物基因的同源克隆1.器械的消毒：用0.1%DEPC二乙基焦碳酸盐（DiethylPyrocarbonate)浸泡处理2hr以上，然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250）干热消毒4hr以上或200干热消毒过夜。2.溶液的消毒：除Tris-HCl外，所有溶液应加DEPC至终浓度为0.05-0.1%，处理过夜后高压灭菌。3.整个操作过程应在超净工作台上进行，且应戴手套操作。4.所有操作应在冰上进行。20植物分子生物学植物基因的同源克隆植物总RNA提取过程中主要试剂的作用21植物分子生物学植物基因的同源克隆1.DEPC：与RNase的组氨酸结合，使蛋白质变性。与0.1-1mg/ml肝素联合使用，具有极强的RNase抑制效果。它在Tris中易分解形成CO2和乙醇，使pH值下降。2.阴离子去垢剂：SDS，Sarkosyl，脱氧胆酸钠（DOC）解聚核酸与蛋白质的结合，在高浓度钾离子存在时，形成SDS-蛋白质的复合物沉淀。3.胍盐、-巯基乙醇：是解偶剂，破坏蛋白质的二硫键。4.RNasin：是RNase的一种非竞争性抑制剂，不能与7.0M尿素混合使用。22植物分子生物学植物基因的同源克隆5.氧钒核糖核苷复合物：与RNase结合形成过渡态类似物。使用浓度为10mM。6.酚、氯仿：使蛋白质变性。7.多胺、蛋白酶K、共聚酪氨酸-谷氨酸：抑制RNase的活性。8.LiCl：RNA的选择性沉淀剂。23植物分子生物学植物基因的同源克隆植物总RNA提取过程中多酚类物质干扰的排除24植物分子生物学植物基因的同源克隆1.在提取缓冲液中加入还原剂：-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、半胱氨酸、硼氢化钠（NaBH4)。过夜沉淀RNA时加入1%-巯基乙醇。2.研磨时加入螯合剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO-N=基在pH8.0以下时有结合多酚的能力。3.用-70的丙酮抽提冷冻研磨的植物材料。4.降低提取缓冲液的pH值（5.5）。5.使用Tris-硼酸缓冲液（0.2M）。6.在提取缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）和肝素。7.用LiCl或CaCl2、50%2-丁氧乙醇选择性沉淀RNA。25植物分子生物学植物基因的同源克隆植物总RNA提取过程中多糖干扰的排除26植物分子生物学植物基因的同源克隆1.低浓度乙醇沉淀多糖法：在提取缓冲液中或在RNA水溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度为10-30%，可以沉淀多糖，RNA留在上清液中。一般在匀浆液中或匀浆上清液中加入终浓度为10%的无水乙醇，在RNA的水溶液中加入终浓度为30%的无水乙醇，以沉淀多糖。2.醋酸钾沉淀多糖法：在匀浆液中加入1/5-1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）或加入1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）以沉淀多糖；在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾（pH4.8）以沉淀多糖。27植物分子生物学植物基因的同源克隆3.调整提取缓冲液中NaCl的浓度：1.0-2.0M。4.将酚/氯仿抽提的上清液稀释使钠离子浓度为80mM，然后加入0.4倍体积的2-丁氧乙醇沉淀多糖。28植物分子生物学植物基因的同源克隆植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除29植物分子生物学植物基因的同源克隆1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制RNase的活性。2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯酚、胍、SDS、CTAB等）。3.利用蛋白酶K降解蛋白质。4.利用苯酚、氯仿抽提。5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。30植物分子生物学植物基因的同源克隆植物DNA和RNA的检测31植物分子生物学植物基因的同源克隆1.凝胶电泳：琼脂糖浓度为0.7-1.0%，胶用1TAE或1或0.5TBE电泳缓冲液配制，加入0.5g/ml溴化乙锭（EB），平板胶厚度为3-5mm。上样缓冲液：溴酚蓝，DNA或RNA样品：2-5l，电压：4-5V/cm，时间：2040min。2.紫外吸收法：波长为260nm、280nm时的吸收值，1OD260=50g/ml双链DNA，1OD260=40g/ml单链DNA或RNA。单链DNA：浓度C（g/ml）=OD260/0.027，双链DNA：浓度C（g/ml）=OD260/0.020，单链RNA：浓度C（g/ml）=OD260/0.025。DNA纯品：/OD260/OD280=1.8-1.9，RNA纯品：OD260/OD280=1.9-2.0，低于此值，说明有蛋白质或酚类污染。32植物分子生物学植物基因的同源克隆木奈基因组DNA粗提液电泳图33植物分子生物学植物基因的同源克隆木奈基因组DNA纯化电泳图34植物分子生物学植物基因的同源克隆木奈总RNA粗提液电泳图35植物分子生物学植物基因的同源克隆木奈总RNA纯化电泳图36植物分子生物学植物基因的同源克隆木奈果肉总RNA电泳图37植物分子生物学植物基因的同源克隆植物基因的同源克隆38植物分子生物学植物基因的同源克隆植物基因保守区片段的克隆39植物分子生物学植物基因的同源克隆植物基因序列同源性的比较40植物分子生物学植物基因的同源克隆植物基因同源序列的搜寻41植物分子生物学植物基因的同源克隆进入GeneBank：美国国家生物技术信息中心（national centre for biotechnology information,NCBI)，网址为www.ncbi.nim.nig.gov。42植物分子生物学植物基因的同源克隆43植物分子生物学植物基因的同源克隆NCBI的使用在search选项中选择nucleotide,在For选项中输入所要搜寻基因的名称,按go,就可搜寻genebank中已经克隆的基因的序号、基因名称、注册号；双击BD085077.Polyphenoloxidas.gi:22630687就显示基因的全部内容，在display选项中选择genebank。44植物分子生物学植物基因的同源克隆搜寻到基因的内容LOCUSBD0850771319bpDNAlinearPAT27-AUG-2002DEFINITIONPolyphenoloxidasegenesfrombanana,tobaccoandpineapple.ACCESSIONBD085077VERSIONBD085077.1GI:22630687KEYWORDSJP2001525677-A/9.SOURCEAnanascomosus.ORGANISMAnanascomosusEukaryota;Viridiplantae;Streptophyta;Embryophyta;Tracheophyta;Spermatophyta;Magnoliophyta;Liliopsida;Commelinidaeincertaesedis;Bromeliaceae;Ananas.REFERENCE1(bases1to1319)AUTHORSRobinson,S.P.TITLEPolyphenoloxidasegenesfrombanana,tobaccoandpineappleJOURNALPatent:JP2001525677-A911-DEC-2001;COMMONWEALTHSCIENTIFICANDINDUSTRIALRESEARCHORGANISATIONCOMMENTOSPineapplePNJP2001525677-A/9PD11-DEC-2001PF19-MAY-1998JP1998549703PR19-MAY-1997AUPO6849PISIMONPIERSROBINSONPCC12N15/53,A01H1/00,A01H5/00CCPolyphenoloxidasegenesfrombanana,tobaccoandpineappleFHKeyLocation/QualifiersFTCDS(1).(1053).FEATURESLocation/Qualifierssource1.1319/organism=Ananascomosus/db_xref=taxon:4615BASECOUNT332a347c406g234t45植物分子生物学植物基因的同源克隆基因序列同源性的比较基因序列同源性的比较双击DNAMAN图标，打开DNAMAN的页面，双击工具栏中的空白文档图标，在文件菜单中选择open选项，打开genebank中基因的内容，或直接双击打开图标，打开genebank中基因的内容。46植物分子生物学植物基因的同源克隆将genebank的基因序列转变成seq文件选中genebank中的基因序列，按复制或ctr+C，双击DNAMAN工具栏中的空白文档图标，按粘贴或ctr+V，把基因序列粘到DNAMAN上，先从edit菜单中点击SelectAll，然后点击SequenceFormat，弹出对话框，单击确定；先从sequence菜单选择Loadsequence，然后选择display选项，在File菜单中选择saveas，输入文件名，在其后加上“.seq”。47植物分子生物学植物基因的同源克隆序列同源性的比较从Sequence菜单中点击Alignment，选择multiplesequencealignment，弹出对话框，点击Add中的file，输入两个以上的基因序列，单击确定，出现序列同源性高低的结果，单击on，选择mono-tree，单击on，在进化树上出现同源性数值。48植物分子生物学植物基因的同源克隆ORIGIN1ttgccgttttggaattgggacgcgccggggggcatgcagatcccggccatctacgccgac61gcttcgtccccgctctacgacaagctgcgcaatgcgaagcaccagccgccgactttggtc121gacctcgactacaacggcaccgacccgaccttcacccctgagcagcagatcgcccacaac181ctcaccatcatgtaccgacaggtgatatccggcgggaagacgccggagttgtttatgggc241gcggcgtaccgcgcgggcgacgcgccagacccgggcgcaggcactctagagctcgtgccg301cacaacacgatgcatttgtggaccggcgaccccaaccaacccaacgacgaagacatgggc361acgttctacgcggcggcgcgggaccccatcttcttcgcccaccacggcaacgtcgaccgc421atgtggtacgtgtggcggaaactcgggggcacgcaccgcgatttcaccgaccccgactgg481ctcaacgcgtccttcctcttctacgacgagaacgcgcagctcgtccgcgtcaaagtaaag541gactgcttgagcgccgacgcgctgcggtacacgtaccaggacgtcgacatcccgtggatc601agtgcgaagccgacgccgaagaaaacaccggggggcgctgcgccttccacgacagaggct661atatttccggtggtgctggataagccggtgagctctacggtggcgaggccgaagacgggg721aggagtactggggaggaggaggtgttggtggtggagggaatcgagctggacaaggacgtg781gccgtgaagttcgacgtgtatataaacgcgccggacaacgaaggggtggggccggaggcg841agcgagttcgcagggagcttcgtccaggtgccgcacaagcacaagaaggggaagaaggag901aaggcgaggattaaaacgacgctcaggctcgggataacggacctgctcgaggacatcggc961gccgaggacgacgagagcgtgctcgtcacgctcgtgccgaggataggcgaggggttggtc1021aaggttggtgggctaaggatcgatttctccaagtgatcagcagcaaattaactatacatg1081aaagtaaaaaaaattgcatttacctacctatagaagagaataaatgcgtatgtaatctgc1141cccatttgtcacttttaatttctcgagcgtgttctgaatgagagttgcatgcatgcgcgc1201agccataatgcctggtatagtgtagtagtttaggcgtggatacgtataacgtacgtatgc1261atgtataaggaataatgatgagtttactatgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa/Revised:July5,2002.Disclaimer|WritetotheHelpDeskNCBI|NLM|NIH49植物分子生物学植物基因的同源克隆多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术50植物分子生物学植物基因的同源克隆PCR扩增引物设计51植物分子生物学植物基因的同源克隆1.引物序列应位于基因的高度保守区内，且与非扩增区域无同源性，提高PCR的特异性。2.引物的长度以15-30bp为宜，常用23-25bp。3.引物的碱基应尽可能随机分布，避免出现几个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40-75%之间，常用50-55%。52植物分子生物学植物基因的同源克隆4.引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的应无回文结构。5.上下游引物不应有互补序列，特别是3/端应避免互补，以免形成引物二聚体。6.引物的5/端碱基无严格限制，可加上内切酶位点、启动子序列或其他序列（最多可加10个碱基），便于对PCR产物进行分析和克隆。53植物分子生物学植物基因的同源克隆7.引物3/端的头1-2个碱基会影响TaqDNA聚合酶的延伸效率，影响PCR的扩增效率和特异性，一般PCR的引物3/末端的碱基最好是C、G，其次为T，不用A，因为末位为A，错配时引发链合成效率大大降低，末位为T，错配时也能引发链的合成。8.引物的3/端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免引物的3/末端不应终止于密码子的简并碱基。9.尽量采用植物偏好的密码子或在高度简并位点用dI代替。54植物分子生物学植物基因的同源克隆植物偏爱的密码子55植物分子生物学植物基因的同源克隆氨基酸密码子氨基酸密码子Gly(G)GAAIle(I)ATCGlu(E)GAGThr(T)ACCAsp(D)GAT Trp(W)TGGVal(V)GTT Cys(C)TGCAla(A)GCTTyr(Y)TACArg(R)AGGLeu(L)CTTSer(S)TCT Phe(F)TTCLys(K)AAGGln(Q)CAAAsn(N)AACHis(H)CACMet(M)ATG Pro(P)CCA56植物分子生物学植物基因的同源克隆用DNAMAN设计PCR引物57植物分子生物学植物基因的同源克隆在Primer菜单中点击Self-complementarity，弹出对话框，显示nocomplementarityfound，说明引物无自身互补，关闭对话框，打开序列同源性比较的结果，检查对应的每个碱基是否存在简并，在简并位置上使用I或偏爱密码子或简并密码，将引物序列转变成.seq文件，保存到特定位置，到此，上游引物设计完成。58植物分子生物学植物基因的同源克隆将下游的经设计和确定的序列转变成.seq文件，保存；打开该序列，选定，在Sequence菜单中点击loadsequence，然后点击Display和Rev.Compl.Sequence，在Primer菜单中选择TwoPrimerComplimentarity和SecondPrimerFomInput，输入上游引物序列，点击OK，显示两个引物的互补情况，在3/端不应出现连续4个的互补，关闭对话框，将下游引物转变成.seq文件，保存。59植物分子生物学植物基因的同源克隆PCR反应的全过程1.高温变性:94下双链DNA通过热变性使其氢键断裂解离成两条单链。2.低温退火：当温度降到引物Tm以下时,引物与模板互补序列杂交。3.中温延伸：当温度升高到72时，模板在dNTP、Taq DNA Polymerase、Mg2+存在下，以引物为起始，沿着5/3/方向延伸。60植物分子生物学植物基因的同源克隆61植物分子生物学植物基因的同源克隆PCR反应体系的组成1.10PCRBuffer（Mg2+plus):100mMTris-HCl，pH8.3；500mMKCl；0.1%geltin；15mMMgCl2。2.MgCl2:母液15mM或25mM，工作浓度1.5-5.0mM。3.dNTP:母液10mM或2mM，工作浓度200M。4.引物：母液10M或20M，工作浓度0.1-1.0M。5.TaqDNApolymerse:1-3U。6.模板DNA：1-500ng。62植物分子生物学植物基因的同源克隆PCR反应体系63植物分子生物学植物基因的同源克隆20l反应体系10PCRBuffer（Mg2+-free）:2lMgCl2(15mM):2ldNTP(10mM):0.3l5/-Primer(10M):0.25l3/-Primer(10M):0.25lDNA模板：10-250ngTaqDNApolymerase:1-2UddH2O:加至20l64植物分子生物学植物基因的同源克隆50l反应体系10PCRBuffer（Mg2+-free）:5lMgCl2(15mM):3ldNTP(10mM):0.6l5/-Primer(10M):0.5l3/-Primer(10M):0.5lDNA模板：10-250ngTaqDNApolymerase:1-2UddH2O:加至50l65植物分子生物学植物基因的同源克隆100l反应体系10PCRBuffer:10lMgCl2(15mM):10l（1.5-2.5mM）dNTP(10mM):10l(各为200)5/-Primer(10M):1l（0.1-0.5）3/-Primer(10M):1l（0.1-0.5）TaqDNApolymerase(5.0U/l）：3-5U基因组DNA模板：10-250ngddH2O:加至100l66植物分子生物学植物基因的同源克隆942-5min9430-40s退火温度1min25-40cycles721-2min727-10min4保存PCR反应条件67植物分子生物学植物基因的同源克隆PCR反应条件的选择1.初变性：945min。2.预变性：9430-45s。3.退火：退火温度（55-72）一般选择比理论Tm低5-10（常用5左右）。4.延伸：一般为70-75（常用72），扩增长度为1-2kb时延伸时间为1min，大于2kb时可适当延长至5-10min，引物长度小于16bp，可采用使延伸温度缓慢上升到70-75，在最后一轮循环后在70-75(72)延伸10min。5.循环数：25-30个循环。68植物分子生物学植物基因的同源克隆常用的PCR反应条件94初变性5min，9430s、5530s、721min，25-30个循环，7210min后 4停止反应。69植物分子生物学植物基因的同源克隆PCR条件的优化1.Mg2+浓度的优化：范围：0.5mM-10mM。采用二步法优化：第一步0.55.0mM，梯度为0.5mM；第二步梯度为0.2或0.3mM。2.热启动PCR：在第一个循环的温度升高到Tm值后加入Taq酶；使用热激活的AmpliTaqGold酶；使用含TaqStartAntibody的Taq酶。3.TD-PCR（TouchdownPCR)4.SD-PCR(StepdownPCR)70植物分子生物学植物基因的同源克隆1.TD-PCR:适用于引物是根据氨基酸序列设计或同源扩增多基因家族成员；退火温度的范围：大于Tm值几度到低于Tm值十几度，跨越15左右。温度降幅为0.5-1，每个温度进行2个循环，最后在低于Tm值10（50）进行10-15个循环。2.SD-PCR：设置7个2一变的步骤或5个3一变的步骤，每个水平的循环数为4。71植物分子生物学植物基因的同源克隆木奈PPO基因保守区片段的PCR产物72植物分子生物学植物基因的同源克隆RT-PCR（ReverseTranscriptionPCR)73植物分子生物学植物基因的同源克隆逆转录反应74植物分子生物学植物基因的同源克隆逆转录酶1.AMV（AvianMyeloblastosisVirus)逆转录酶：来源于禽成髓细胞性白血病病毒，最适温度为42，具有RNase H活性，焦磷酸钠会增加其逆转录效率。用量：20U/gRNA。2.MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus)逆转录酶：来源于莫洛尼鼠白血病病毒，最适温度为37，具有RNase H活性，焦磷酸钠会降低其逆转录效率。用量：200U/gRNA。Superscrip逆转录酶：无RNase H活性。Mu-MLV逆转录酶。75植物分子生物学植物基因的同源克隆逆转录的引物1.Oligo(dT)182.六聚体随机引物3.基因特异引物。76植物分子生物学植物基因的同源克隆植物目的基因的RT-PCR扩增77植物分子生物学植物基因的同源克隆逆转录反应：1）先将200l的RNase-free的PCR管中放在冰上按下列顺序加入：RNase-freeddH2O6lOligo(dT)18(0.5g/l)1l总RNA（1.15g/l）5l总体积为12l，总RNA大约为5g，加完后混匀，离心3-5s。2）放70水浴保温5min，放冰上冷却后，离心3-5s，又放回冰上，依次加入：5RT-Buffer4l10mMdNTP2lRNaseinhibitor(20U/l)1l混匀后，离心3-5s，放70水浴保温5min，放冰上冷却后，加入1lM-MLVReverseTranscritse(200U/l)。3）放42水浴保温60min。4）放冰上冷却后，离心3-5s，放70水浴保温5min，放冰上冷却后，离心3-5s，取5l电泳，120V，20min，其余放-20保存备用。78植物分子生物学植物基因的同源克隆以cDNA为模板，对基因保守区cDNA进行PCR扩增：50l体系cDNA2l10PCRBuffer(含Mg2+)5l10mMdNTP1lHMPP1(10M)2lHMPP2(10M)2lTaqDNAPolymerase(5U/l)0.5l无菌ddH2O37.5lPCR反应条件：942min；30cyclesof941min，511min，721.5min；7210min；4保存。取10l电泳，120V，20min。79植物分子生物学植物基因的同源克隆木奈PPO基因保守区cDNA的PCR扩增产物80植物分子生物学植物基因的同源克隆cDNA末端的快速扩增技术（RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE）81植物分子生物学植物基因的同源克隆5/-RACE82植物分子生物学植物基因的同源克隆83植物分子生物学植物基因的同源克隆5/-RACE引物84植物分子生物学植物基因的同源克隆85植物分子生物学植物基因的同源克隆5/RACE引物设计86植物分子生物学植物基因的同源克隆1.GC含量大于50%，退火温度大于58C2.3/端不能以A结尾3.GSP1尽可能靠近poly(A)4.GSP2与GSP3之间的间隔至少大于50bp5.4.GSP2、GSP3与AUAP不能在3/端有4个以上的互补配对6.扩增cDNA全长应在ATG上游设计5/端引物，在终止密码子的下游设计3/端引物7.GSP1、GSP2、GSP3均为反向基因特异引物8.一般两个正向引物AAP与AUAP，AAP与GSP2配对，AUAP与GSP3配对87植物分子生物学植物基因的同源克隆AAP与AUAP的序列AAP的序列：5/-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3/。AUAP的序列：5/-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3/。88植物分子生物学植物基因的同源克隆cDNA第一链的合成：在PCR管中加入GSP12.5pmol、总RNA1-5g，无RNA酶水加至15.5l，混匀，放70水浴保温5min，放冰上冷却后，离心；依次加入10XPCRbuffer2.5l、25mMMgCl22.5l、10mMdNTPmix1l、0.1MDTT2.5l总体积为24l混匀，离心；42C保温1min，加入1lSuperScript.IIRT，混匀，离心；42C保温1hr；70C保温15min，离心；放入37C；加入1lRNasemix，混匀，离心；37C保温30min，离心；-20C保存90植物分子生物学植物基因的同源克隆逆转录产物的纯化预先将binglingsolution放室温，将100l无菌水放65C预热；在逆转录产物中加入120lbinglingsolution（6MNaI)；将混合物转到GLASSMAXspincartridge中，13000g离心20s；取出柱子将离心管中的液体转入到新的离心管中保存，将柱子放回到原离心管中；向柱子中加入0.4ml4C预冷的1Xwashbuffer，13000g离心20s；去掉液体，重复洗3次；用400l70%乙醇（4C预冷）洗2次，去掉70%乙醇，13000g离心1min；将柱子转移到新的离心管中加入50l65C预热的无菌水，13000g离心20s洗脱cDNA。91植物分子生物学植物基因的同源克隆cDNA的加尾反应在离心管中依次加入无RNA酶水6.5l、5Xtailingbuffer5l、2mMdCTP2.5l、纯化的cDNA10l，总体积为24l，混匀，离心；放94C保温2-3min，置冰上1min，离心；放冰上，加1lTdT，混匀，37C保温10min；65C保温10min，离心。92植物分子生物学植物基因的同源克隆第一轮PCR：将PCR仪预先调到94C；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水31.5l、10XPCRbuffer5l、25mMMgCl23l、10mMdNTPmix1l、10MGSP22l、AbridgedAnchorPrimer(10M)2l、dC-tailedcDNA5l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNApolymerase(5U/l)，混匀，离心；PCR反应；取5-20l电泳。93植物分子生物学植物基因的同源克隆巢式PCR将PCR仪预先调到94C；取5l第一次PCR产物加入到495lTE（pH8.0)中稀释；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水31.5l、10XPCRbuffer5l、25mMMgCl23l、10mMdNTPmix1l、10MGSP32l、AUAPorUAP(10M)2l、dilutionofprimaryPCRproduct5l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNApolymerase(5U/l)，混匀，离心；PCR反应；取5-20l电泳。94植物分子生物学植物基因的同源克隆3-RACE95植物分子生物学植物基因的同源克隆96植物分子生物学植物基因的同源克隆97植物分子生物学植物基因的同源克隆3-RACE的逆转录的逆转录cDNA第一链的合成：在PCR管中加入总RNA1-5g、无RNA酶水加至11l，加入1l10mMAP，混匀，离心；放70水浴保温10min，放冰上冷却1min，离心；依次加入10XPCRbuffer2.5l、25mMMgCl22.5l、10mMdNTPmix1l、0.1MDTT2.5l总体积为24l混匀，离心；42C保温2-5min；加入1lSuperScript.IIRT，混匀，离心；42C保温50min；70C保温15min，离心；放冰上；加入1lRNaseH，混匀，离心；37C保温20min，离心；-20C保存98植物分子生物学植物基因的同源克隆3-RACE第一轮第一轮PCR将PCR仪预先调到94C；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水36.5l、10XPCRbuffer5l、25mMMgCl23l、10mMdNTPmix1l、10MGSP11l、AUAPPrimer(10M)1l、cDNA5l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNApolymerase(5U/l)，混匀，离心；PCR反应；取10-20l电泳。GSP1和GSP2为基因正向引物。99植物分子生物学植物基因的同源克隆巢式PCR将PCR仪预先调到94C；取5l第一次PCR产物加入到495lTE（pH8.0)中稀释；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水36.5l、10XPCRbuffer5l、25mMMgCl23l、10mMdNTPmix1l、10MGSP21l、AUAP(10M)1l、dilutionofprimaryPCRproduct2l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNApolymerase(5U/l)，混匀，离心；PCR反应；取10-20l电泳。100植物分子生物学植物基因的同源克隆全长cDNA的获得cDNA第一链的合成：在PCR管中加入0.5g/lOligo(dT)12-181l、总RNA1g、10mMdNTPmix1l，无RNA酶水加至12l，混匀，放65水浴保温5min，放冰上冷却后，离心；依次加入5XFirst-strandBuffer4l、0.1MDTT2l、1lRNaseOUTTMRecombinantRibonucleaseInhibitor(40U/l),混匀，离心；42C保温1min，加入1lSuperScript.IIRT(200U/l)，混匀，离心；42C保温50min；70C保温15min，离心；放入37C；加入1lRNaseH，混匀，离心；37C保温20min，离心；-20C保存101植物分子生物学植物基因的同源克隆全长cDNA的扩增将PCR仪预先调到94C；将0.2ml离心管放冰上，依次加入无菌水37.5l、10XPCRbuffer（含Mg2+)5l、10mMdNTPmix1l、10M上游引物2l、10M下游引物2l、cDNA2l，总体积为49.5l，加入0.5lTaq DNApolymerase(5U/l)，混匀，离心；PCR反应；取10-20l电泳。102植物分子生物学植物基因的同源克隆谢谢各位103植物分子生物学植物基因的同源克隆