核酸分离纯化课件

2024/7/212024/7/22 核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。分子生物学与疾病诊断。2024/7/23 核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则(一)保持核酸分子一级结构的完整性1 意义 遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。2 分离核酸原则：温度不要过高；控制一定的pH值范围(pH值5-9);保持一定的离子强度;减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。2024/7/24(二)防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；2024/7/25 DNA酶（酶（DNase）抑制剂）抑制剂1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性，如EDTA-Na2等。2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。2024/7/26 RNA酶酶(RNase)抑制剂抑制剂 RNase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活。RNase除胞内（内源性）还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中（外源性）。RNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键；RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。Rnase不需要二价阳离子激活。2024/7/27 去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。对外源性的可用DEPC。2024/7/28常用的RNase抑制剂：DEPC(焦碳酸二乙酯)粘性液体，高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。很强的核酸酶抑制剂。与蛋白的His结合使蛋白变性。使用注意：易降解，保存在4 或液氮中；提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿372 h。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=2024/7/29对内源性RNase：选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）。如：Trizol内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。2024/7/210分离提取核酸的主要步骤分离提取核酸的主要步骤 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法）2024/7/211细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母各种组织细胞破碎方法2024/7/212 (1)高速组织捣碎机捣碎 (2)玻璃匀浆器匀浆 (3)超声波处理法 (4)液氮研磨法 (5)化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）细胞的破碎2024/7/213 核酸的分离与纯化 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 它物质分离。非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、不需要的核酸分子、试剂和溶液。核蛋白的解聚核蛋白的解聚 核酸与蛋白质的结合力主要是静电吸引力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。2024/7/214 常用DNA提取方法1、加入10倍体积的缓冲液：10mM Tris-HCl(pH7.4)；150mM NaCl；10mM EDTA；0.5%SDS。NaCl破坏核酸-蛋白质间的静电引力，使氢键破坏，核蛋白解聚；EDTA破坏细胞膜、敖合Ca2+，使DNase失活；SDS可破坏细胞膜、抑制核酸酶，可使核酸从蛋白质上游离出来。2024/7/2152、酚/氯仿抽提：酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相(DNA)分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。2024/7/216使用酚时应注意使用酚时应注意 1.酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。2.酚具有很强的结合水的能力，因此在使用前需要用pH8.0的10mM Tris-HCl饱和，之后加入抗氧化剂-巯基乙醇和8-羟基喹啉。3.酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。2024/7/217核酸的沉淀核酸的沉淀 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点优点：改变核酸的溶解缓冲液；改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。2024/7/218核酸沉淀的盐类及浓度核酸沉淀的盐类及浓度盐盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。2024/7/219有机沉淀剂有机沉淀剂（1）乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。2024/7/220（2）异丙醇）异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。2024/7/221（3）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG）优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。2024/7/222精胺精胺 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理：原理：精胺与精胺与DNA结合后，使结合后，使DNA在溶液中结构凝在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化分开，达到纯化DNA的目的。的目的。2024/7/223核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀的温度和时间 一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响共沉淀，影响以后的实验。一般使用以后的实验。一般使用0冰水，冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。样品足可达到实验要求。2024/7/224 RNA的提取的提取 1.以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇等的变性溶液裂解细胞。2.在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液（RNA处于上层水相）。3.通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。该法是目前实验室最常用的。2024/7/225mRNA的分离纯化的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴。利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。2024/7/2265m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A)+RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin-磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁磁珠分离法纯化磁珠分离法纯化poly(A)+RNA的原理的原理2024/7/227Oligo(dT)-纤维柱层析2024/7/228核酸的鉴定核酸的鉴定1.浓度鉴定：紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm（蛋白280nm）。荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度与溶液中核酸的含量呈正比（目测）。溴化乙锭：是一种诱变剂并有中度毒性，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套!2024/7/229 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱2024/7/230EB与与DNA的结合的结合2024/7/2312.纯度鉴定：（1）紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与降低均提示不纯。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8。若：A260/A2801.8，有RNA杂质，用RNase消化；A260/A2801.7，有杂蛋白，重复抽提纯化步骤；A260/A2302.0，可能有盐未除尽。注：既含蛋白质又含RNA，DNA溶液比值为1.8的情况。2024/7/232 DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于：50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20-35g/ml寡核苷酸判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0纯RNA的A260/A280比值为1.7-2.0；D260/OD230比值应大于2.0。2024/7/233 紫外光度法测定DNA在A260nm的光吸收值。取15ul DNA样品加ddH2O 至3ml，分别于260、280、230nm处比色并记录。计算DNA浓度：g/ml（l）OD260稀释倍数50（/1000）紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。RNA样品浓度：g/ml（l）=OD260稀释倍数40/10002024/7/234溴乙锭荧光法测定核酸的含量溴乙锭荧光法测定核酸的含量 原理：原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度度DNA溶液作标准对照，可比较出被测溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。计水平。2024/7/2353.完整性鉴定：琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。2024/7/236对RNA：一般28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。总RNA电泳图谱2024/7/237核酸的保存核酸的保存DNA：1、短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的pH与DNA 贮存有关，pH为8时，可减少DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。2、长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。2024/7/238RNA：（1）RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)加入2倍体积的乙醇中，-70 保存；（2）在RNA溶液中，加1滴氯仿或0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70，可保存数年。(3)长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中。