肺癌靶点检测研究进展培训课程课件

肺癌靶点检测研究进展肺癌靶点检测研究进展1优选肺癌靶点检测研究进展优选肺癌靶点检测研究进展22007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合基因EML4EML4ALKvariant1HELP1496981WDBasic14961059110581620TMKinaseALKEML4-ALKNMP-ALKNature2007;448:56172007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合类型，并证实为肺癌的驱动基因。并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。2007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合基因E3Permanentproliferation&inhibitionofapotosisEML4-ALKfusionproteinsilencedbycrizotinibProliferation&survivaluponligandbindingtoALKALK融合突融合突变在蛋白水平的在蛋白水平的变化化配体配体ALK受体受体细胞外细胞内正常正常ALK信号信号细胞外永久扩增和凋亡抑制永久扩增和凋亡抑制细胞外克唑替尼抑制克唑替尼抑制EML4-ALK融合蛋白融合蛋白病理性病理性ALK信号信号克唑替尼克唑替尼作用模式作用模式配体与配体与ALK结合后，结合后，扩增和存活扩增和存活由于与EML4融合，ALK激酶区异常激活多效蛋白?肝素结合细胞因子?Permanentproliferation&inhi随着ALK靶向抑制剂的发现，ALK基因越来越多的受到重视2007,Soda&Mano首次发现EML4-ALK基因2009,AliceT.Shaw首次出现EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的称谓，并将其定义为NSCLC的独特亚型2010,KwakEL:证实克唑替尼治疗有效，但仍沿用EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的称谓Soda M,et al.Nature 2007;448(7153):561-566.Shaw AT,et al.J Clin Oncol 2009;27:4247-4253.Kwak EL,et al.N Engl J Med 2010;363:1693-1703.随着ALK靶向抑制剂的发现，ALK基因越来越多的受到重视205NSCLC临床病理分型的演变AdenocarcinomaSquamous-cellcarcinomaLargecellcarcinoma组织分型CurrentStandardofNSCLCCareNon-squamousNSCLC分型现状SquamousEGFRWTEGFRMuSquamousEGFRMuKRASMuALK+Othernon-squamousWTSquamous2012NCCN2014NCCNEGFRMuALK+KRASMuOthernon-squamousWTSquamousROS1+2010NCCNNCCNGuidelines,NSCLC,Version4.2014HornL,etal.ClinOncol.2009驱动基因分型早期NSCLC临床病理分型的演变AdenocarcinomaSq6NSCLC分子分型与治疗决策密切相关HER2EGFRmutantsALKROS/RETb-rafK-rasChemotherapyandPCIAdenoLCC/NOSSCCSCLCK-rasNSCLC分子分型与治疗决策密切相关HER2EGFRmut7腺癌/大细胞癌/NOS应该进行EGFR及ALK检测34%(39/116,AC,WTEGFR)ShawAT,etal.SodaM,etal.Nature2007;448(7153):561-566.本图由LukasBubendorf提供Othernon-squamousWT克唑替尼一线治疗亚裔患者，中位PFS达到13.Permanentproliferation&inhibitionofapotosis什么样的人群需要进行ALK检测？Fei-YuNiu,Yi-LongWu.PublicationsSodaM,etal.Minca,etal.JClinOncol2009;27:4247-4253.OptiviewDABIHCDetectionFei-YuNiu,Yi-LongWu.并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。ALK阳性非小细胞肺癌有哪些特点？ALK阳性非小细胞肺癌有哪些特点？腺癌/大细胞癌/NOS应该进行EGFR及ALK检测ALK阳性8ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征特征EGFR突变EML4/ALK组织学腺癌TTF1+腺癌TTF1+亚型非粘液型粘液型吸烟状态不吸烟不吸烟人种东亚所有人种发病年龄66岁52岁性别女性无差异ShawAT,etal.JClinOncol2009;27:4247-4253.85.4%的ALK阳性NSCLC年龄65岁(PROFILE1007)ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征特征EGFR突变9ChemotherapyandPCIAmoyDxEML4-ALK融合基因检测试剂盒RT-PCRNSCLC年龄65岁CFDA获批的三种诊断方法CFDA获批的三种诊断方法NCCNGuidelines,NSCLC,Version4.本图由LukasBubendorf提供与EGFR突变人群相比，ALK融合人群年龄更轻Adenocarcinoma2013,24:2589-2593VENTANAIHC试剂设计ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征ChemotherapyandPCIShawAT,etal.在低于51岁的人群中，ALK阳性率高于EGFR阳性率，可达18.OptiviewDABIHCDetectionALKbreak-apartFISHassayWong,etal.JClinOncol2009;27:4247-4253.Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性但仍沿用EML4-ALK阳性什么样的人群需要进行ALK检测？AdenocarcinomaArchPatholLabMed.2013,24:2589-2593PROFILE1007亚裔或者中国患者，ORR维持在70%以上；Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性SodaM,etal.2007,Soda&Mano对于晚期NSCLC、腺癌或者含腺癌成分的其他类型肺癌，应在诊断的同时常规进行表皮生长因子（EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突变检测，检测前应有送检标本的质控（包括亚型确认及样本量确认）。Squamous-cellcarcinomaVentanaIHC的原理:PROFILE1005Othernon-squamousWT使用具有高度敏感性和特异性的一抗D5F3CFDA获批的三种诊断方法Annalsofoncology.与EGFR突变人群相比，ALK融合人群年龄更轻ALK阳性患者的中位年龄比EGFR阳性患者中位年龄小15岁ChemotherapyandPCIJClinOnc10低年龄组ALK阳性率高于EGFR在低于51岁的人群中，ALK阳性率高于EGFR阳性率，可达18.5%，所以对于年轻患者来说，在标本限制的情况下建议先检测ALK靶点。ScientificReports;LiZhang,2014低年龄组ALK阳性率高于EGFR在低于51岁的人群中，ALK11中国中国ALK突变的发生率有多高？突变的发生率有多高？AuthorAuthorALK incidenceALK incidencePublicationsPublicationsZhang X,Wu YL et al.11.6%(12/103)Mol Cancer 2009Wong,et al.(Hongkong)4.9%(13/265)Cancer 2009Li H,Chen HQ,et al.3.0%(7/230 smokers,ACsmokers,AC)Lung Cancer 2012Sun Y,Chen H,Ji H,et al.5.8%(3/52 surgical AC,non-smokerssurgical AC,non-smokers)JCO 2010Wu SG,Yang PC,et al.(Taiwan)34%(39/116,AC,WT EGFRAC,WT EGFR)JTO 2012Rikova K,et al4.7%(6/137)Cell 2007Wang Z,Wang J,et al.9.7%(11/113,Stage IVStage IV)Oncology 2012Ren S,Zhou C,et al.9.6%(10/104,Female,AC,non-Female,AC,non-smokersmoker)Cell Biochem Biophys.2012;Cancer 2012早期患者（手术标本）ALK阳性率4.5%，晚期患者ALK阳性率8%-10%，胸水标本的ALK阳性率可达11%。中国ALK突变的发生率有多高？AuthorALKincid12Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性NCCNGuidelines,NSCLC,Version4.VentanaIHC(2)2014;9:631638IHC阳性=FISH阳性全自动VENTANAIHC优势一Permanentproliferation&inhibitionofapotosis并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。什么样的人群需要进行ALK检测？AnnalsofOncology2013;CFDA获批的三种诊断方法WangZ,WangJ,etal.少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行EGFR/ALK检测定义为NSCLC的独特亚型LungCancer2012腺癌/大细胞癌/NOS应该进行EGFR及ALK检测OptiviewAmplificationKit亚裔或者中国患者，ORR维持在70%以上；NSCLC年龄65岁Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性配体与ALK结合后，扩增和存活6%(10/104,Female,AC,non-smoker)JClinOncol2009;27:4247-4253.不同人种中克唑替尼的疗效的差异不同人种中克唑替尼的疗效的差异ID患者数患者数ORR(%)PFS（月）（月）所有所有亚裔裔(%)所有所有非非亚裔裔亚裔裔中国中国所有所有非非亚裔裔亚裔裔中国中国PROFILE100114941(28)60.854.876.9-9.7-PROFILE100525993(36)59.8547073.98.1-PROFILE1007347157(45)65-74.7757.77.18.1-PROFILE1014343157(46)747270-10.9-13.6-Fei-YuNiu,Yi-LongWu.OncoTargetsandTherapy2May2015亚裔或者中国患者，裔或者中国患者，ORR维持在持在70%以上；克以上；克唑替尼替尼一一线治治疗亚裔患者，中位裔患者，中位PFS达到达到13.6个月个月Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并13什么样的人群需要进行ALK检测？什么样的人群需要进行ALK检测？14更更新新内容内容2011版版2015版版对临床床实践影响践影响诊断断病理报告内容未提及分子病理诊断结果诊断内容包括肿瘤部位、组织学亚型、累及范围（支气管、胸膜、脉管、神经、伴随病变类型、肺内播散灶、淋巴结转移情况等）、切缘及必要的特殊染色、免疫免疫组化化结果或分子果或分子检测结果果。包含的信息应满足临床分期的需要，并给出pTNM分期。规范范诊断：断：标准NSCLC诊断需尽可能注明EGFR&ALK基因状态（如：右肺上叶腺癌T3N2M1（骨）-IV期 ALK融合基因阳性）NSCLC驱动基因检测未推荐EGFR&ALK检测对于晚期NSCLC、腺癌或者含腺癌成分的其他类型肺癌，应在在诊断的同断的同时常常规进行表皮生行表皮生长因子因子（EGFR）和）和间变性淋巴瘤激性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突）等基因突变检测，检测前应有送检标本的质控（包括亚型确认及样本量确认）。检测标本类型包括活检组织、细胞学标本和细胞蜡快，检测方法推荐使用获得国家食品药品监督管理总局批准的检测方法或试剂。常常规检测：晚期NSCLC诊断同时，需常规检测EGFR&ALK基因状态（特殊情况除外）非小非小细胞肺癌靶向个体化胞肺癌靶向个体化诊疗策略更新要点策略更新要点P71P69更新内容2011版2015版对临床实践影响诊断病理报告内容15腺癌腺癌/大细胞癌大细胞癌/NOS应该进行应该进行EGFR及及ALK检测检测少吸烟少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行进行EGFR/ALK检测检测为了识别出已经有有效药物治疗的罕见驱动基因靶点，NCC指南强烈推荐强烈推荐对肿瘤病人进行更广谱更广谱的肿瘤驱动基因肿瘤驱动基因检测，或为病人推荐可获得的临床研究。广谱的驱动基因筛查是改善NSCLC预后的关键Version4.2016强调分子分子检测的重要性的重要性腺癌/大细胞癌/NOS应该进行EGFR及ALK检测少吸烟/小16如何检测ALK融合突变？如何检测ALK融合突变？CFDA获批的三种诊断方法ALKbreak-apartFISHassay(AbbottMolecular,Vysisprobes)ALKimmunohistochemistry(RocheVentana)SplitIsolated redAmoyDxEML4-ALK融合基因检测试剂盒RT-PCR（厦门艾德）CFDA获批的三种诊断方法ALKbreak-apartF荧光原位杂交（FISH）5ALKEML43阳性阳性（分离 倒位）2p23-215ALKEML43倒位（70）基因融合阴性阴性两个信号之间的距离小于2个信号直径 12 Mb本图由Lukas Bubendorf提供荧光原位杂交（FISH）5ALKEML43阳性（分离实时逆转录法（RT-PCR）原理逆转录酶（AMV）催化合成cDNA第一条链加入PCR成分用Takara Ex TaqTM HS合成cDNA第二条链扩增cDNART-PCR试剂盒的原理试剂盒的原理EML4ALK上游引物下游引物融合点检测探针20实时逆转录法（RT-PCR）原理逆转录酶（AMV）催化合成cVENTANAIHC试剂设计ALK融合蛋白融合蛋白:无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表达较低VentanaIHC的原理的原理:使用具有高度敏感性和特异性的一抗D5F3全自动仪操作，充分保证特异性独有Optiview扩增技术，充分保证敏感性D5F3rabbittmonoclonalantibodyOptiviewDABIHCDetectionOptiviewAmplificationKitVENTANAIHC试剂设计ALK融合蛋白:D5F3r2101+2+3+NegPosPosPosCST-IHCVentana-IHCPosVentana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性-创建一个创建一个“二元二元”的判读系统的判读系统J.Ying,et al.Annals of Oncology 2013;01+2+3+NegPosPosPosCST-IHCVent22VentanaVentana IHCIHC与与FISHFISH检测结果比果比较FISH总数敏感性特异性一致率阳性阴性VentanaIHC(1)阳性46753100%98.20%98.40%阴性0377377VentanaIHC(2)阳性3103194%100%99.10%阴性2198200VentanaIHC(2)阳性32032100%100%100%阴性0217217VentanaIHC(3)阳性4024291%96%94%阴性45357VentanaIHC(4)阳性1801890%100%99.60%阴性2503505VentanaIHC(5)阳性63265100%98.4%98.9%阴性0131131(1)Jinghui Wang,et al.PLoS ONE 2014 9(7):e101551(1)Jinghui Wang,et al.PLoS ONE 2014 9(7):e101551(2)Eugen C.Minca,et al.(2)Eugen C.Minca,et al.J Mol Diagn 2013,15:341-346J Mol Diagn 2013,15:341-346(3)(3)Murry W.Wynes,et al.J Thorac Oncol.2014;9:631638 Murry W.Wynes,et al.J Thorac Oncol.2014;9:631638(4)Greta,et al.Arch Pathol Lab Med.doi:10.5858/arpa.2013-0388-OA(4)Greta,et al.Arch Pathol Lab Med.doi:10.5858/arpa.2013-0388-OA（5 5）J.Ying;et al.Annals of oncology.2013,24:2589-2593J.Ying;et al.Annals of oncology.2013,24:2589-2593VentanaIHC与FISH检测结果比较FISH总数敏感23全自动VENTANA IHC优势一判读标准简单，仅存在阴性 or 阳性的判读IHC 阳性=FISH 阳性全自动VENTANAIHC优势一判读标准简单，仅存在阴性AmoyDxEML4-ALK融合基因检测试剂盒RT-PCR5%，晚期患者ALK阳性率8%-10%，胸水标本的ALK阳性率可达11%。中国ALK突变的发生率有多高？MolCancer2009ShawAT,etal.ShawAT,etal.ALK阳性非小细胞肺癌有哪些特点？PLoSONE20149(7):e101551AdenocarcinomaCFDA获批的三种诊断方法NSCLC年龄65岁ZhangX,WuYLetal.NCCNGuidelines,NSCLC,Version4.荧光原位杂交（FISH）ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征全自动VENTANAIHC优势一NSCLC年龄65岁IsolatedredPublicationsSquamous-cellcarcinomaRenS,ZhouC,etal.AnnalsofOncology2013;ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征ClinOncol.CFDA获批的三种诊断方法Fei-YuNiu,Yi-LongWu.克唑替尼一线治疗亚裔患者，中位PFS达到13.PROFILE1001SodaM,etal.PROFILE1007VentanaIHC的原理:NEnglJMed2010;363:1693-1703.ClinOncol.无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白2010,KwakEL:规范诊断：标准NSCLC诊断需尽可能注明EGFR&ALK基因状态（如：右肺上叶腺癌T3N2M1（骨）-IV期ALK融合基因阳性）中国ALK突变的发生率有多高？MolCancer2009ZhangX,WuYLetal.JThoracOncol.VentanaIHC(3)荧光原位杂交（FISH）广谱的驱动基因筛查是改善NSCLC预后的关键5%，晚期患者ALK阳性率8%-10%，胸水标本的ALK阳性率可达11%。NCCNGuidelines,NSCLC,Version4.但仍沿用EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的称谓，并将其多效蛋白?肝素结合细胞因子?SodaM,etal.PROFILE1005NSCLC年龄65岁克唑替尼一线治疗亚裔患者，中位PFS达到13.Othernon-squamousWT(AbbottMolecular,Vysisprobes)Nature2007;448(7153):561-566.5%，晚期患者ALK阳性率8%-10%，胸水标本的ALK阳性率可达11%。2013-0388-OA由于与EML4融合，ALK激酶区实时逆转录法（RT-PCR）原理腺癌/大细胞癌/NOS应该进行EGFR及ALK检测VentanaIHC(5)少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行EGFR/ALK检测ShawAT,etal.2012;Cancer2012如何检测ALK融合突变？NCCNGuidelines,NSCLC,Version4.并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。优选肺癌靶点检测研究进展PLoSONE20149(7):e101551SodaM,etal.Wong,etal.ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征SodaM,etal.SodaM,etal.IsolatedredLungCancer2012少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行EGFR/ALK检测6%(12/103)Wong,etal.但仍沿用EML4-ALK阳性荧光原位杂交（FISH）5%，所以对于年轻患者来说，在标本限制的情况下建议先检测ALK靶点。Annalsofoncology.EML4-ALK融合蛋白克唑替尼一线治疗亚裔患者，中位PFS达到13.PLoSONE20149(7):e101551Othernon-squamousWT亚裔或者中国患者，ORR维持在70%以上；PLoSONE20149(7):e1015512013-0388-OA随着ALK靶向抑制剂的发现，ALK基因越来越多的受到重视Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性用TakaraExTaqTMHS合成cDNA第二条链Proliferation&survivaluponligandbindingtoALK少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行EGFR/ALK检测全自动VENTANAIHC优势一对于晚期NSCLC、腺癌或者含腺癌成分的其他类型肺癌，应在诊断的同时常规进行表皮生长因子（EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突变检测，检测前应有送检标本的质控（包括亚型确认及样本量确认）。中国ALK突变的发生率有多高？2014;9:631638并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。ChemotherapyandPCIAnnalsofOncology2013;克唑替尼一线治疗亚裔患者，中位PFS达到13.2009,AliceT.Minca,etal.并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。荧光原位杂交（FISH）PLoSONE20149(7):e1015512007,Soda&ManoALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征SodaM,etal.用TakaraExTaqTMHS合成cDNA第二条链JMolDiagn2013,15:341-346CellBiochemBiophys.ALKimmunohistochemistry与EGFR突变人群相比，ALK融合人群年龄更轻Annalsofoncology.ChemotherapyandPCINature2007;448:5617Nature2007;448(7153):561-566.ZhangX,WuYLetal.Wong,etal.ALK阳性NSCLC具有鲜明的临床及病理特征NSCLC临床病理分型的演变配体与ALK结合后，扩增和存活Ventana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。规范诊断：标准NSCLC诊断需尽可能注明EGFR&ALK基因状态（如：右肺上叶腺癌T3N2M1（骨）-IV期ALK融合基因阳性）ALK阳性非小细胞肺癌有哪些特点？Isolatedred2014;9:631638ALK阳性非小细胞肺癌有哪些特点？PROFILE1005ChemotherapyandPCIWong,etal.少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行EGFR/ALK检测JClinOncol2009;27:4247-4253.2009,AliceT.本图由LukasBubendorf提供并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。Wong,etal.Squamous-cellcarcinomaWong,etal.配体与ALK结合后，扩增和存活2013-0388-OA(Hongkong)Othernon-squamousWTVentana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性Permanentproliferation&inhibitionofapotosisKwakEL,etal.少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行EGFR/ALK检测2013,24:2589-25935%，晚期患者ALK阳性率8%-10%，胸水标本的ALK阳性率可达11%。全自动VENTANAIHC优势二NSCLC分子分型与治疗决策密切相关OptiviewDABIHCDetectionPublications荧光原位杂交（FISH）ALK融合突变在蛋白水平的变化Wong,etal.CellBiochemBiophys.无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白Adenocarcinoma优选肺癌靶点检测研究进展6%(12/103)并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。NCCNGuidelines,NSCLC,Version4.2009,AliceT.ChemotherapyandPCIPLoSONE20149(7):e101551MolCancer2009Wong,etal.克唑替尼一线治疗亚裔患者，中位PFS达到13.PublicationsFei-YuNiu,Yi-LongWu.SodaM,etal.LungCancer2012但仍沿用EML4-ALK阳性LungCancer2012使用具有高度敏感性和特异性的一抗D5F3Annalsofoncology.AmoyDxEML4-ALK融合基因检测试剂盒RT-PCR2009,AliceT.2010,KwakEL:全自动VENTANA IHC优势二全自动检测，避免操作流程中的误差，可重复性好AmoyDxEML4-ALK融合基因检测试剂盒RT-PC