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第六章第六章(下下)水产动物病原的检测技术水产动物病原的检测技术重要内容重要内容免疫血清的制备一一.选择免疫动物选择免疫动物 二二.免疫方法免疫方法 三三.动物采血法动物采血法 四四.免疫血清的纯化免疫血清的纯化 五五.抗血清的鉴定与保存抗血清的鉴定与保存 能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。(一一).).抗原与动物种属关系：差异越远越好；抗原与动物种属关系：差异越远越好；(二二).).动物的个体状况：适龄、健壮、正常、动物的个体状况：适龄、健壮、正常、体重合乎要求；体重合乎要求；(三三).).抗原的性质：不同动物种类对同一免疫抗原的性质：不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；原有不同的免疫应答；(四四).).按免疫血清用量和要求：选择不同物。按免疫血清用量和要求：选择不同物。一一.选择免疫动物选择免疫动物(一一).).免疫原的注射剂量免疫原的注射剂量 (二二).).免疫间隔时间：首次与二次尤为重要，免疫间隔时间：首次与二次尤为重要，整个免疫过程整个免疫过程5 5至至8 8次。次。(三三).).免疫途径：免疫反应产生速度依次为静免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌脉腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌 二二.免疫方法免疫方法1.1.颈动脉放血法：羊、兔最常用的方法颈动脉放血法：羊、兔最常用的方法 2.2.静脉采血法静脉采血法：羊、兔，小鼠断尾或眼球：羊、兔，小鼠断尾或眼球 3.3.心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡三三.动物采血法动物采血法四四.免疫血清的纯化免疫血清的纯化(一一)特异性抗体的纯化特异性抗体的纯化1.亲合层析法：将交叉抗原交联到亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose4B上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱，上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体。杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，杂抗原则与杂抗体结合，接加到免疫血清中，杂抗原则与杂抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。五五.抗血清的鉴定与保存抗血清的鉴定与保存(一一一一).).抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定 (二二二二).).抗体特异性鉴定：抗体特异性鉴定：抗体特异性鉴定：抗体特异性鉴定：细菌类抗原的抗体用凝集试验细菌类抗原的抗体用凝集试验细菌类抗原的抗体用凝集试验细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验 (三三三三).).抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法 (四四四四).).抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好 l l(五五)抗血清的保存抗血清的保存l ll l1.4保存：可保存保存：可保存36个月个月l ll l2.低温保存：低温保存：-20-40可保存可保存23年年l ll l3.冰冻干燥保存：可保存冰冻干燥保存：可保存35年年第一节第一节 免疫学检测免疫学检测l l免疫凝集试验免疫凝集试验l l免疫沉淀试验免疫沉淀试验l l与补体相关的试验与补体相关的试验l l酶联免疫试验酶联免疫试验l l荧光免疫技术荧光免疫技术l l免疫电镜技术免疫电镜技术一、免疫凝集试验一、免疫凝集试验l l凝集反应是指凝集反应是指颗粒性抗原颗粒性抗原如细菌、细胞等与相如细菌、细胞等与相应抗体在电解质存在条件下的结合，出现肉眼应抗体在电解质存在条件下的结合，出现肉眼可见的凝集现象。细菌凝集反应被广泛应用于可见的凝集现象。细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反应的细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。（一）直接凝集试验（一）直接凝集试验（一）直接凝集试验（一）直接凝集试验（directagglutinationdirectagglutination）l l玻片法定性多定性多定性多定性多l l试管凝集法定量多定量多定量多定量多颗粒性抗原抗体颗粒性抗原抗体颗粒性抗原抗体颗粒性抗原抗体 凝集凝集凝集凝集 可溶性抗原相应抗体可溶性抗原相应抗体可溶性抗原相应抗体可溶性抗原相应抗体不凝集不凝集不凝集不凝集 可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原无关载体抗体无关载体抗体无关载体抗体无关载体抗体凝集凝集凝集凝集 常用载体常用载体常用载体常用载体 RBCRBC-聚苯乙烯乳胶聚苯乙烯乳胶聚苯乙烯乳胶聚苯乙烯乳胶 活性碳活性碳活性碳活性碳 胶体金胶体金胶体金胶体金 A.无菌生理盐水无菌生理盐水B.抗原抗原(颗粒抗原颗粒抗原)C.抗体抗体（二）间接凝集试验（二）间接凝集试验（二）间接凝集试验（二）间接凝集试验（indirectagglutinationindirectagglutination）l l将将将将已知可溶性抗原已知可溶性抗原已知可溶性抗原已知可溶性抗原吸附于或耦联于一种与免疫无关的吸附于或耦联于一种与免疫无关的吸附于或耦联于一种与免疫无关的吸附于或耦联于一种与免疫无关的载体表面，形成致敏颗粒，再与相应抗体作用而出现载体表面，形成致敏颗粒，再与相应抗体作用而出现载体表面，形成致敏颗粒，再与相应抗体作用而出现载体表面，形成致敏颗粒，再与相应抗体作用而出现的凝集现象称为间接凝集试验，也称为被动凝集试验。的凝集现象称为间接凝集试验，也称为被动凝集试验。的凝集现象称为间接凝集试验，也称为被动凝集试验。的凝集现象称为间接凝集试验，也称为被动凝集试验。常用于吸附抗原的载体颗粒有动物的红细胞、聚苯乙常用于吸附抗原的载体颗粒有动物的红细胞、聚苯乙常用于吸附抗原的载体颗粒有动物的红细胞、聚苯乙常用于吸附抗原的载体颗粒有动物的红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等。吸附抗原的颗粒称为致敏颗粒。烯乳胶、活性炭等。吸附抗原的颗粒称为致敏颗粒。烯乳胶、活性炭等。吸附抗原的颗粒称为致敏颗粒。烯乳胶、活性炭等。吸附抗原的颗粒称为致敏颗粒。该法十分敏感，可用已知可溶性抗原致敏的载体颗粒该法十分敏感，可用已知可溶性抗原致敏的载体颗粒该法十分敏感，可用已知可溶性抗原致敏的载体颗粒该法十分敏感，可用已知可溶性抗原致敏的载体颗粒检测微量存在的相应抗体。检测微量存在的相应抗体。检测微量存在的相应抗体。检测微量存在的相应抗体。（三）间接血凝试验（三）间接血凝试验（三）间接血凝试验（三）间接血凝试验（indirectindirecthemagglutinationhemagglutination）l l间接血凝试验是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成间接血凝试验是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成间接血凝试验是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成间接血凝试验是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成为致敏载体，再与相应的抗体（或抗原）结合，出现可见为致敏载体，再与相应的抗体（或抗原）结合，出现可见为致敏载体，再与相应的抗体（或抗原）结合，出现可见为致敏载体，再与相应的抗体（或抗原）结合，出现可见的血凝现象，也称为被动血凝试验。的血凝现象，也称为被动血凝试验。的血凝现象，也称为被动血凝试验。的血凝现象，也称为被动血凝试验。l l红细胞包被上抗原，用以检测抗体的血凝试验称为红细胞包被上抗原，用以检测抗体的血凝试验称为红细胞包被上抗原，用以检测抗体的血凝试验称为红细胞包被上抗原，用以检测抗体的血凝试验称为正向间正向间正向间正向间接血凝试验接血凝试验接血凝试验接血凝试验（PassivePassive HemagglutinationHemagglutination Test Test）l l红细胞包被上抗体，用以检测抗原的血凝试验称为红细胞包被上抗体，用以检测抗原的血凝试验称为红细胞包被上抗体，用以检测抗原的血凝试验称为红细胞包被上抗体，用以检测抗原的血凝试验称为反向间反向间反向间反向间接血凝试验接血凝试验接血凝试验接血凝试验（ReverseReverse passive passive HemagglutinationHemagglutination Test Test）。）。）。）。l l如果先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）如果先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）如果先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）如果先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，再加入用抗原或抗体致敏的红细胞，则能抑制原先混合，再加入用抗原或抗体致敏的红细胞，则能抑制原先混合，再加入用抗原或抗体致敏的红细胞，则能抑制原先混合，再加入用抗原或抗体致敏的红细胞，则能抑制原先的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。（四）协同凝集试验（四）协同凝集试验(Co-agglutination)l l金色葡萄球菌细胞壁中的蛋白质成份金色葡萄球菌细胞壁中的蛋白质成份金色葡萄球菌细胞壁中的蛋白质成份金色葡萄球菌细胞壁中的蛋白质成份A A（SPASPA）能与人和多种哺乳动物血清的能与人和多种哺乳动物血清的能与人和多种哺乳动物血清的能与人和多种哺乳动物血清的IgGIgG类抗体的类抗体的类抗体的类抗体的FcFc段段段段结合，成为致敏颗粒。特异性结合，成为致敏颗粒。特异性结合，成为致敏颗粒。特异性结合，成为致敏颗粒。特异性IgGIgG的的的的FcFc段与段与段与段与SPASPA结合后，其结合后，其结合后，其结合后，其F(ab)2F(ab)2段暴露在葡萄球菌菌体表面，段暴露在葡萄球菌菌体表面，段暴露在葡萄球菌菌体表面，段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍保持抗体活性，当与相应的抗原反应时，可借仍保持抗体活性，当与相应的抗原反应时，可借仍保持抗体活性，当与相应的抗原反应时，可借仍保持抗体活性，当与相应的抗原反应时，可借助特异性抗体助特异性抗体助特异性抗体助特异性抗体F(ab)2F(ab)2段与相应抗原互相连结而呈段与相应抗原互相连结而呈段与相应抗原互相连结而呈段与相应抗原互相连结而呈现凝集现象。在该种凝集反应中，金色葡萄球菌现凝集现象。在该种凝集反应中，金色葡萄球菌现凝集现象。在该种凝集反应中，金色葡萄球菌现凝集现象。在该种凝集反应中，金色葡萄球菌成为成为成为成为IgGIgG的载体，故称协同凝集试验。的载体，故称协同凝集试验。的载体，故称协同凝集试验。的载体，故称协同凝集试验。二、免疫沉淀试验二、免疫沉淀试验l l沉淀反应是指沉淀反应是指沉淀反应是指沉淀反应是指可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组（细菌培养滤液、细胞或组（细菌培养滤液、细胞或组（细菌培养滤液、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在适当条件下织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在适当条件下织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在适当条件下织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在适当条件下发生结合而出现沉淀的现象。发生结合而出现沉淀的现象。发生结合而出现沉淀的现象。发生结合而出现沉淀的现象。l l反应中的抗原称为反应中的抗原称为反应中的抗原称为反应中的抗原称为沉淀原沉淀原沉淀原沉淀原（precipitinogenprecipitinogen），可以），可以），可以），可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素沉淀素沉淀素沉淀素（precipitinprecipitin）。）。）。）。l l液相沉淀反应液相沉淀反应液相沉淀反应液相沉淀反应（fluidphaseprecipitationfluidphaseprecipitation）环状沉淀（环状沉淀（环状沉淀（环状沉淀（ringprecipitationringprecipitation）絮状沉淀（絮状沉淀（絮状沉淀（絮状沉淀（flocculationflocculation）免疫浊度测定（免疫浊度测定（免疫浊度测定（免疫浊度测定（immuno-turbidimetryimmuno-turbidimetry）。l l凝胶扩散试验凝胶扩散试验凝胶扩散试验凝胶扩散试验（geldiffusiongeldiffusion）单向琼脂扩散（单向琼脂扩散（单向琼脂扩散（单向琼脂扩散（singlediffusionsinglediffusion）双向琼脂扩散（双向琼脂扩散（双向琼脂扩散（双向琼脂扩散（doublediffusiondoublediffusion）l l凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳（gelgelimmunoelectrophoresisimmunoelectrophoresis）（一）环状沉淀试验（一）环状沉淀试验l l将已知的抗血清加入到小口径试管的底部，然后将已将已知的抗血清加入到小口径试管的底部，然后将已将已知的抗血清加入到小口径试管的底部，然后将已将已知的抗血清加入到小口径试管的底部，然后将已适当稀释的待检抗原溶液小心地加在抗血清的表面，适当稀释的待检抗原溶液小心地加在抗血清的表面，适当稀释的待检抗原溶液小心地加在抗血清的表面，适当稀释的待检抗原溶液小心地加在抗血清的表面，使两种液体成为分界面清晰的两层。使两种液体成为分界面清晰的两层。使两种液体成为分界面清晰的两层。使两种液体成为分界面清晰的两层。l l室温下静置数分钟，若抗原与抗体相对应，则在液面室温下静置数分钟，若抗原与抗体相对应，则在液面室温下静置数分钟，若抗原与抗体相对应，则在液面室温下静置数分钟，若抗原与抗体相对应，则在液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。l l本法主要用于抗原的定性试验，如鉴别血迹性质、细本法主要用于抗原的定性试验，如鉴别血迹性质、细本法主要用于抗原的定性试验，如鉴别血迹性质、细本法主要用于抗原的定性试验，如鉴别血迹性质、细菌血清型鉴定和沉淀素的效价滴定等。试验时出现白菌血清型鉴定和沉淀素的效价滴定等。试验时出现白菌血清型鉴定和沉淀素的效价滴定等。试验时出现白菌血清型鉴定和沉淀素的效价滴定等。试验时出现白色沉淀环的最高抗原稀释倍数即为该抗血清的沉淀价。色沉淀环的最高抗原稀释倍数即为该抗血清的沉淀价。色沉淀环的最高抗原稀释倍数即为该抗血清的沉淀价。色沉淀环的最高抗原稀释倍数即为该抗血清的沉淀价。（二）絮状沉淀试验（二）絮状沉淀试验l l可溶性抗原与相应抗血清在试管内或凹玻片上混合，可溶性抗原与相应抗血清在试管内或凹玻片上混合，可溶性抗原与相应抗血清在试管内或凹玻片上混合，可溶性抗原与相应抗血清在试管内或凹玻片上混合，出现肉眼可见的混浊沉淀或絮状沉淀，即为阳性反应。出现肉眼可见的混浊沉淀或絮状沉淀，即为阳性反应。出现肉眼可见的混浊沉淀或絮状沉淀，即为阳性反应。出现肉眼可见的混浊沉淀或絮状沉淀，即为阳性反应。当抗原抗体比例最适时，沉淀物出现最快，混浊度最当抗原抗体比例最适时，沉淀物出现最快，混浊度最当抗原抗体比例最适时，沉淀物出现最快，混浊度最当抗原抗体比例最适时，沉淀物出现最快，混浊度最大；当抗原过剩或抗体过剩时，出现后带或前带现象。大；当抗原过剩或抗体过剩时，出现后带或前带现象。大；当抗原过剩或抗体过剩时，出现后带或前带现象。大；当抗原过剩或抗体过剩时，出现后带或前带现象。l l通常用固定抗体稀释抗原法（通常用固定抗体稀释抗原法（通常用固定抗体稀释抗原法（通常用固定抗体稀释抗原法（操作法）或固定抗原稀操作法）或固定抗原稀操作法）或固定抗原稀操作法）或固定抗原稀释抗体法（释抗体法（释抗体法（释抗体法（操作法），以检测抗原或抗体的最适比例。操作法），以检测抗原或抗体的最适比例。操作法），以检测抗原或抗体的最适比例。操作法），以检测抗原或抗体的最适比例。本法敏感性不高，在疾病诊断上的应用日趋减少。本法敏感性不高，在疾病诊断上的应用日趋减少。本法敏感性不高，在疾病诊断上的应用日趋减少。本法敏感性不高，在疾病诊断上的应用日趋减少。（三）免疫浊度法（三）免疫浊度法l l可溶性抗原和抗体在液相中特异性结合，形成一定大小的可溶性抗原和抗体在液相中特异性结合，形成一定大小的可溶性抗原和抗体在液相中特异性结合，形成一定大小的可溶性抗原和抗体在液相中特异性结合，形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。l l当反应液中固定抗体或抗原的浓度，在一定线性范围内，当反应液中固定抗体或抗原的浓度，在一定线性范围内，当反应液中固定抗体或抗原的浓度，在一定线性范围内，当反应液中固定抗体或抗原的浓度，在一定线性范围内，反应液的浊度会随着抗原或抗体量的增加而呈正比例增大，反应液的浊度会随着抗原或抗体量的增加而呈正比例增大，反应液的浊度会随着抗原或抗体量的增加而呈正比例增大，反应液的浊度会随着抗原或抗体量的增加而呈正比例增大，与一系列的标准品对照，就可计算出样品中的抗原或抗体与一系列的标准品对照，就可计算出样品中的抗原或抗体与一系列的标准品对照，就可计算出样品中的抗原或抗体与一系列的标准品对照，就可计算出样品中的抗原或抗体的量。的量。的量。的量。l l免疫浊度法可分为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法两种。免疫浊度法可分为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法两种。免疫浊度法可分为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法两种。免疫浊度法可分为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法两种。前者需用专门的浊度计，测定的是单纯散射光，后者可用前者需用专门的浊度计，测定的是单纯散射光，后者可用前者需用专门的浊度计，测定的是单纯散射光，后者可用前者需用专门的浊度计，测定的是单纯散射光，后者可用分光光度计（或比色计）和其它自动分析仪，测定的是溶分光光度计（或比色计）和其它自动分析仪，测定的是溶分光光度计（或比色计）和其它自动分析仪，测定的是溶分光光度计（或比色计）和其它自动分析仪，测定的是溶液吸光度。液吸光度。液吸光度。液吸光度。l l本法与双向单扩散法有高度的一致性，且敏感性高，操作本法与双向单扩散法有高度的一致性，且敏感性高，操作本法与双向单扩散法有高度的一致性，且敏感性高，操作本法与双向单扩散法有高度的一致性，且敏感性高，操作简单快速，不足之处在于抗血清用量略多于扩散法。简单快速，不足之处在于抗血清用量略多于扩散法。简单快速，不足之处在于抗血清用量略多于扩散法。简单快速，不足之处在于抗血清用量略多于扩散法。（四）免疫扩散（四）免疫扩散(immunodiffusion)l l1、单向琼脂扩散、单向琼脂扩散l l2、火箭电泳单向琼脂扩散电场、火箭电泳单向琼脂扩散电场l l3、双向琼脂扩散、双向琼脂扩散l l4、对流免疫电泳双向琼脂扩散电泳、对流免疫电泳双向琼脂扩散电泳1、单向琼脂扩散、单向琼脂扩散2、火箭电泳单向琼脂扩散电场、火箭电泳单向琼脂扩散电场l l原理原理l l抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，可用来检测不变，峰的高度与抗原量呈正比，可用来检测标本中的抗原含量。标本中的抗原含量。3、双向琼脂扩散、双向琼脂扩散l l抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，叫做免抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，叫做免抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，叫做免抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，叫做免疫扩散反应（疫扩散反应（疫扩散反应（疫扩散反应（immunodiffusionimmunodiffusion）。将抗原与其相应）。将抗原与其相应）。将抗原与其相应）。将抗原与其相应抗体放在凝胶（如琼脂）平板中的邻近孔内，使它们抗体放在凝胶（如琼脂）平板中的邻近孔内，使它们抗体放在凝胶（如琼脂）平板中的邻近孔内，使它们抗体放在凝胶（如琼脂）平板中的邻近孔内，使它们互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即出现乳白色的沉淀线，称为双向免疫扩散试验。此即出现乳白色的沉淀线，称为双向免疫扩散试验。此即出现乳白色的沉淀线，称为双向免疫扩散试验。此即出现乳白色的沉淀线，称为双向免疫扩散试验。此方法是由方法是由方法是由方法是由OuchterlonyOuchterlony所提出，因此又称所提出，因此又称所提出，因此又称所提出，因此又称Ouchter-lonyOuchter-lony技术。技术。技术。技术。l l若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。因此，利就能产生相应数量的分离的沉淀线。因此，利就能产生相应数量的分离的沉淀线。因此，利就能产生相应数量的分离的沉淀线。因此，利用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。l l沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远，因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之的浓度；反之的浓度；反之的浓度；反之,可测定抗体的效价。可测定抗体的效价。可测定抗体的效价。可测定抗体的效价。4、对流免疫电泳双向琼脂扩散、对流免疫电泳双向琼脂扩散电泳电泳l l对流电泳（对流电泳（对流电泳（对流电泳（counterimmunoelectrophoresiscounterimmunoelectrophoresis）是一）是一）是一）是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原在碱性缓冲液内加入抗体，通电后，抗原在碱性缓冲液内加入抗体，通电后，抗原在碱性缓冲液内加入抗体，通电后，抗原在碱性缓冲液(pH8.2)(pH8.2)中中中中带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，且在其等电点附近，向正极的位移小，而分子量大，且在其等电点附近，向正极的位移小，而分子量大，且在其等电点附近，向正极的位移小，而分子量大，且在其等电点附近，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需只需只需只需1 1小时左右即可观察结果。小时左右即可观察结果。小时左右即可观察结果。小时左右即可观察结果。三、与补体相关的试验三、与补体相关的试验l l补体（补体（补体（补体（complementcomplement，C C）是存在于脊椎动物血清和组织）是存在于脊椎动物血清和组织）是存在于脊椎动物血清和组织）是存在于脊椎动物血清和组织液中一组具有酶原活性的蛋白质。液中一组具有酶原活性的蛋白质。液中一组具有酶原活性的蛋白质。液中一组具有酶原活性的蛋白质。l l补体性质不稳定，室温下很快失活，补体性质不稳定，室温下很快失活，补体性质不稳定，室温下很快失活，补体性质不稳定，室温下很快失活，0 01010下下下下3 34d4d失失失失活。经活。经活。经活。经5656作用作用作用作用30min30min即失活。在生理状态下，血清中补即失活。在生理状态下，血清中补即失活。在生理状态下，血清中补即失活。在生理状态下，血清中补体大多以无活性的酶前体形式存在。当它们被某些物质激体大多以无活性的酶前体形式存在。当它们被某些物质激体大多以无活性的酶前体形式存在。当它们被某些物质激体大多以无活性的酶前体形式存在。当它们被某些物质激活后，可发生连锁的酶促反应，表现出各种生物学活性如活后，可发生连锁的酶促反应，表现出各种生物学活性如活后，可发生连锁的酶促反应，表现出各种生物学活性如活后，可发生连锁的酶促反应，表现出各种生物学活性如溶菌杀菌、细胞毒、调理吞噬、免疫吸附、中和溶解病毒溶菌杀菌、细胞毒、调理吞噬、免疫吸附、中和溶解病毒溶菌杀菌、细胞毒、调理吞噬、免疫吸附、中和溶解病毒溶菌杀菌、细胞毒、调理吞噬、免疫吸附、中和溶解病毒和炎性介质等作用。涉及补体的实验方法大致分为两大类，和炎性介质等作用。涉及补体的实验方法大致分为两大类，和炎性介质等作用。涉及补体的实验方法大致分为两大类，和炎性介质等作用。涉及补体的实验方法大致分为两大类，一类为直接对补体活性和各组分含量的测定；另一类为有一类为直接对补体活性和各组分含量的测定；另一类为有一类为直接对补体活性和各组分含量的测定；另一类为有一类为直接对补体活性和各组分含量的测定；另一类为有补体参与，用已知抗体（或抗原）检测相应抗原（或抗体）补体参与，用已知抗体（或抗原）检测相应抗原（或抗体）补体参与，用已知抗体（或抗原）检测相应抗原（或抗体）补体参与，用已知抗体（或抗原）检测相应抗原（或抗体）的实验。的实验。的实验。的实验。（一）溶解试验（一）溶解试验l l含有抗原的靶细胞与相应抗体结合后，如为无含有抗原的靶细胞与相应抗体结合后，如为无核细胞（如红细胞）则被溶解，如果是有核细核细胞（如红细胞）则被溶解，如果是有核细胞（如肿瘤细胞）则被杀伤，而少数细菌可被胞（如肿瘤细胞）则被杀伤，而少数细菌可被溶解，多数细菌则被杀伤而失去活性。溶解，多数细菌则被杀伤而失去活性。l l1 1溶血试验（溶血试验（溶血试验（溶血试验（hemolysishemolysistesttest）l l红细胞（如绵羊红细胞）与相应抗体结合后，在有补红细胞（如绵羊红细胞）与相应抗体结合后，在有补红细胞（如绵羊红细胞）与相应抗体结合后，在有补红细胞（如绵羊红细胞）与相应抗体结合后，在有补体存在时，红细胞被溶解，称为溶血试验。参加反应体存在时，红细胞被溶解，称为溶血试验。参加反应体存在时，红细胞被溶解，称为溶血试验。参加反应体存在时，红细胞被溶解，称为溶血试验。参加反应的抗体称为溶血素。的抗体称为溶血素。的抗体称为溶血素。的抗体称为溶血素。l l2 2被动溶血试验（被动溶血试验（被动溶血试验（被动溶血试验（passivepassivehemolysishemolysistesttest）l l红细胞吸附抗原后，在相应抗体和补体存在下，出现红细胞吸附抗原后，在相应抗体和补体存在下，出现红细胞吸附抗原后，在相应抗体和补体存在下，出现红细胞吸附抗原后，在相应抗体和补体存在下，出现红细胞溶解反应，称之为被动溶血试验。本方法与直红细胞溶解反应，称之为被动溶血试验。本方法与直红细胞溶解反应，称之为被动溶血试验。本方法与直红细胞溶解反应，称之为被动溶血试验。本方法与直接溶血试验的主要区别在于红细胞与抗原孵育后，红接溶血试验的主要区别在于红细胞与抗原孵育后，红接溶血试验的主要区别在于红细胞与抗原孵育后，红接溶血试验的主要区别在于红细胞与抗原孵育后，红细胞吸附了抗原而被致敏，其它与溶血试验相同。细胞吸附了抗原而被致敏，其它与溶血试验相同。细胞吸附了抗原而被致敏，其它与溶血试验相同。细胞吸附了抗原而被致敏，其它与溶血试验相同。l l3 3溶菌试验（溶菌试验（溶菌试验（溶菌试验（BacteriolysisBacteriolysistesttest）l l革兰氏阴性菌在相应抗体和补体作用下，可引起菌体革兰氏阴性菌在相应抗体和补体作用下，可引起菌体革兰氏阴性菌在相应抗体和补体作用下，可引起菌体革兰氏阴性菌在相应抗体和补体作用下，可引起菌体的溶解死亡，这与溶菌酶的溶菌反应有区别，故将由的溶解死亡，这与溶菌酶的溶菌反应有区别，故将由的溶解死亡，这与溶菌酶的溶菌反应有区别，故将由的溶解死亡，这与溶菌酶的溶菌反应有区别，故将由抗体和补体引起的溶菌反应称为抗体和补体引起的溶菌反应称为抗体和补体引起的溶菌反应称为抗体和补体引起的溶菌反应称为免疫溶菌反应免疫溶菌反应免疫溶菌反应免疫溶菌反应。实际。实际。实际。实际上，这种免疫溶菌反应通常以细菌是否受到损伤、繁上，这种免疫溶菌反应通常以细菌是否受到损伤、繁上，这种免疫溶菌反应通常以细菌是否受到损伤、繁上，这种免疫溶菌反应通常以细菌是否受到损伤、繁殖是否受到抑制、菌数（菌落）是否减少作为指标。殖是否受到抑制、菌数（菌落）是否减少作为指标。殖是否受到抑制、菌数（菌落）是否减少作为指标。殖是否受到抑制、菌数（菌落）是否减少作为指标。有时将试管内的溶菌反应称为有时将试管内的溶菌反应称为有时将试管内的溶菌反应称为有时将试管内的溶菌反应称为杀菌反应杀菌反应杀菌反应杀菌反应（bacteiocidalbacteiocidalreactionreaction）。）。）。）。（二）补体结合试验（二）补体结合试验（complementfixationtest,CFT）l l补体结合试验是利用抗原抗体复合物可与补体结合，而单补体结合试验是利用抗原抗体复合物可与补体结合，而单补体结合试验是利用抗原抗体复合物可与补体结合，而单补体结合试验是利用抗原抗体复合物可与补体结合，而单独的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血系统为指示独的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血系统为指示独的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血系统为指示独的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血系统为指示剂，用已知抗原（或抗体）来检测未知抗体（或抗原）。剂，用已知抗原（或抗体）来检测未知抗体（或抗原）。剂，用已知抗原（或抗体）来检测未知抗体（或抗原）。剂，用已知抗原（或抗体）来检测未知抗体（或抗原）。CFTCFT包括两种系统，分两个阶段进行。包括两种系统，分两个阶段进行。包括两种系统，分两个阶段进行。包括两种系统，分两个阶段进行。l l第一系统为待检系统：抗原第一系统为待检系统：抗原第一系统为待检系统：抗原第一系统为待检系统：抗原+抗体抗体抗体抗体+补体。如果抗原与抗体补体。如果抗原与抗体补体。如果抗原与抗体补体。如果抗原与抗体相对应，则能特异性结合并固定补体；否则，补体不被结相对应，则能特异性结合并固定补体；否则，补体不被结相对应，则能特异性结合并固定补体；否则，补体不被结相对应，则能特异性结合并固定补体；否则，补体不被结合，仍游离于溶液中。合，仍游离于溶液中。合，仍游离于溶液中。合，仍游离于溶液中。l l第二系统为指示系统：绵羊红细胞第二系统为指示系统：绵羊红细胞第二系统为指示系统：绵羊红细胞第二系统为指示系统：绵羊红细胞+溶血素，作为第一系溶血素，作为第一系溶血素，作为第一系溶血素，作为第一系统抗原与抗体是否相对的指示剂。如果第一系统中抗原与统抗原与抗体是否相对的指示剂。如果第一系统中抗原与统抗原与抗体是否相对的指示剂。如果第一系统中抗原与统抗原与抗体是否相对的指示剂。如果第一系统中抗原与抗体特异性结合，固定了补体，则再加入绵羊红细胞与溶抗体特异性结合，固定了补体，则再加入绵羊红细胞与溶抗体特异性结合，固定了补体，则再加入绵羊红细胞与溶抗体特异性结合，固定了补体，则再加入绵羊红细胞与溶血素时，由于缺乏补体，不会发生溶血反应，此为血素时，由于缺乏补体，不会发生溶血反应，此为血素时，由于缺乏补体，不会发生溶血反应，此为血素时，由于缺乏补体，不会发生溶血反应，此为CFTCFT阳阳阳阳性。若抗原与抗体不相对应，则补体不被结合，仍游离于性。若抗原与抗体不相对应，则补体不被结合，仍游离于性。若抗原与抗体不相对应，则补体不被结合，仍游离于性。若抗原与抗体不相对应，则补体不被结合，仍游离于溶液中，而被随后加入的绵羊红细胞与溶血素复合物固定、溶液中，而被随后加入的绵羊红细胞与溶血素复合物固定、溶液中，而被随后加入的绵羊红细胞与溶血素复合物固定、溶液中，而被随后加入的绵羊红细胞与溶血素复合物固定、激活，导致红细胞溶解，此为激活，导致红细胞溶解，此为激活，导致红细胞溶解，此为激活，导致红细胞溶解，此为CFTCFT阴性。阴性。阴性。阴性。四、酶联免疫试验四、酶联免疫试验l l酶联免疫试验是利用抗原抗体反应的高度特异酶联免疫试验是利用抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，进行对抗原或抗性和酶促反应的高度敏感性，进行对抗原或抗体的检测，是一种定性和定量的综合性技术。体的检测，是一种定性和定量的综合性技术。l l直接法、间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。直接法、间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ngng/ml/ml水平水平（一）直接法（一）直接法(二二)间接法间接法（三）双抗体夹心法（三）双抗体夹心法（四）竞争法（四）竞争法五、荧光免疫技术五、荧光免疫技术l l（一）原理（一）原理l l荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，以发态而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。波长较照射光长的荧光。六、免疫电镜技术六、免疫电镜技术l l（一）铁蛋白抗体法（一）铁蛋白抗体法（一）铁蛋白抗体法（一）铁蛋白抗体法l l铁蛋白是从组织（主要是肝脏和脾脏）中提取的铁蛋白是从组织（主要是肝脏和脾脏）中提取的铁蛋白是从组织（主要是肝脏和脾脏）中提取的铁蛋白是从组织（主要是肝脏和脾脏）中提取的一种含铁蛋白，铁蛋白可通过双功能试剂如二异一种含铁蛋白，铁蛋白可通过双功能试剂如二异一种含铁蛋白，铁蛋白可通过双功能试剂如二异一种含铁蛋白，铁蛋白可通过双功能试剂如二异氰酸间二甲苯、二异氰酸甲苯和二氟氰酸间二甲苯、二异氰酸甲苯和二氟氰酸间二甲苯、二异氰酸甲苯和二氟氰酸间二甲苯、二异氰酸甲苯和二氟-二硝基苯砜二硝基苯砜二硝基苯砜二硝基苯砜等与抗体结合。抗体与抗原反应后，在电镜下结等与抗体结合。抗体与抗原反应后，在电镜下结等与抗体结合。抗体与抗原反应后，在电镜下结等与抗体结合。抗体与抗原反应后，在电镜下结合铁蛋白的抗体部位呈黑色，因而能极精确地显合铁蛋白的抗体部位呈黑色，因而能极精确地显合铁蛋白的抗体部位呈黑色，因而能极精确地显合铁蛋白的抗体部位呈黑色，因而能极精确地显示出抗原所在部位。铁蛋白抗体法在细胞膜表面示出抗原所在部位。铁蛋白抗体法在细胞膜表面示出抗原所在部位。铁蛋白抗体法在细胞膜表面示出抗原所在部位。铁蛋白抗体法在细胞膜表面抗原标记研究中广泛应用，既可用于透视电镜、抗原标记研究中广泛应用，既可用于透视电镜、抗原标记研究中广泛应用，既可用于透视电镜、抗原标记研究中广泛应用，既可用于透视电镜、扫描电镜，也可用于冷冻蚀刻复型。扫描电镜，也可用于冷冻蚀刻复型。扫描电镜，也可用于冷冻蚀刻复型。扫描电镜，也可用于冷冻蚀刻复型。l l（二）酶标记抗体法（二）酶标记抗体法（二）酶标记抗体法（二）酶标记抗体法l l在免疫电镜中，用于标记的酶主要有辣根过氧化物酶在免疫电镜中，用于标记的酶主要有辣根过氧化物酶在免疫电镜中，用于标记的酶主要有辣根过氧化物酶在免疫电镜中，用于标记的酶主要有辣根过氧化物酶（HRPHRP），因为其具有稳定性强、反应特异性高和分），因为其具有稳定性强、反应特异性高和分），因为其具有稳定性强、反应特异性高和分），因为其具有稳定性强、反应特异性高和分子量小、易于穿透组织和细胞等优点。组织标本经甲子量小、易于穿透组织和细胞等优点。组织标本经甲子量小、易于穿透组织和细胞等优点。组织标本经甲子量小、易于穿透组织和细胞等优点。组织标本经甲醛溶液固定后，漂洗去除甲醛溶液，再切成厚醛溶液固定后，漂洗去除甲醛溶液，再切成厚醛溶液固定后，漂洗去除甲醛溶液，再切成厚醛溶液固定后，漂洗去除甲醛溶液，再切成厚20m20m的薄片，即可用酶标记抗体或其它间接染色法处理，的薄片，即可用酶标记抗体或其它间接染色法处理，的薄片，即可用酶标记抗体或其它间接染色法处理，的薄片，即可用酶标记抗体或其它间接染色法处理，反应显色后，按常规电镜脱水、包埋、切片、染色和反应显色后，按常规电镜脱水、包埋、切片、染色和反应显色后，按常规电镜脱水、包埋、切片、染色和反应显色后，按常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。在电镜下，本法不如铁蛋白抗体法清晰。观察。在电镜下，本法不如铁蛋白抗体法清晰。观察。在电镜下，本法不如铁蛋白抗体法清晰。观察。在电镜下，本法不如铁蛋白抗体法清晰。l l（三）重金属标记抗体法（三）重金属标记抗体法（三）重金属标记抗体法（三）重金属标记抗体法l l除铁蛋白抗体和酶标记抗体法外，还有重金属标除铁蛋白抗体和酶标记抗体法外，还有重金属标除铁蛋白抗体和酶标记抗体法外，还有重金属标除铁蛋白抗体和酶标记抗体法外，还有重金属标记抗体法。由于在超微结构水平上研究抗原抗体记抗体法。由于在超微结构水平上研究抗原抗体记抗体法。由于在超微结构水平上研究抗原抗体记抗体法。由于在超微结构水平上研究抗原抗体反应的标记物如铁蛋白和反应的标记物如铁蛋白和反应的标记物如铁蛋白和反应的标记物如铁蛋白和HRPHRP分子量较大，不是分子量较大，不是分子量较大，不是分子量较大，不是较理想的标记物，而醋酸铀的分子量较小，且铀较理想的标记物，而醋酸铀的分子量较小，且铀较理想的标记物，而醋酸铀的分子量较小，且铀较理想的标记物，而醋酸铀的分子量较小，且铀原子具有电子致密性，能非特异性地结合在整个原子具有电子致密性，能非特异性地结合在整个原子具有电子致密性，能非特异性地结合在整个原子具有电子致密性，能非特异性地结合在整个抗体分子上，故醋酸铀是一种较好的电镜标记物。抗体分子上，故醋酸铀是一种较好的电镜标记物。抗体分子上，故醋酸铀是一种较好的电镜标记物。抗体分子上，故醋酸铀是一种较好的电镜标记物。用醋酸铀标记抗体时，必需先将抗原与抗体结合用醋酸铀标记抗体时，必需先将抗原与抗体结合用醋酸铀标记抗体时，必需先将抗原与抗体结合用醋酸铀标记抗体时，必需先将抗原与抗体结合以保护抗体的特异性结合部位，再用铀原子标记以保护抗体的特异性结合部位，再用铀原子标记以保护抗体的特异性结合部位，再用铀原子标记以保护抗体的特异性结合部位，再用铀原子标记抗体后，将抗原抗体分开，除去抗原成分，即得抗体后，将抗原抗体分开，除去抗原成分，即得抗体后，将抗原抗体分开，除去抗原成分，即得抗体后，将抗原抗体分开，除去抗原成分，即得未失去免疫反应性的铀标记抗体。未失去免疫反应性的铀标记抗体。未失去免疫反应性的铀标记抗体。未失去免疫反应性的铀标记抗体。l l另一种可标记抗体的重金属是胶体金。胶体金在碱性另一种可标记抗体的重金属是胶体金。胶体金在碱性另一种可标记抗体的重金属是胶体金。胶体金在碱性另一种可标记抗体的重金属是胶体金。胶体金在碱性条件下带负电荷，与抗体相吸附，从而将抗体标记。条件下带负电荷，与抗体相吸附，从而将抗体标记。条件下带负电荷，与抗体相吸附，从而将抗体标记。条件下带负电荷，与抗体相吸附，从而将抗体标记。吸附胶体金的抗体可离心沉淀。吸附胶体金的抗体可离心沉淀。吸附胶体金的抗体可离心沉淀。吸附胶体金的抗体可离心沉淀。5nm5nm以上的胶体金颗以上的胶体金颗以上的胶体金颗以上的胶体金颗粒也存在对组织细胞穿透力差的缺点，故主要用标记粒也存在对组织细胞穿透力差的缺点，故主要用标记粒也存在对组织细胞穿透力差的缺点，故主要用标记粒也存在对组织细胞穿透力差的缺点，故主要用标记细胞膜表面抗原，而细胞膜表面抗原，而细胞膜表面抗原，而细胞膜表面抗原，而1nm1nm胶体金颗粒和银增强染色的胶体金颗粒和银增强染色的胶体金颗粒和银增强染色的胶体金颗粒和银增强染色的出现，极大地推动了胶体金标记技术在包埋前免疫染出现，极大地推动了胶体金标记技术在包埋前免疫染出现，极大地推动了胶体金标记技术在包埋前免疫染出现，极大地推动了胶体金标记技术在包埋前免疫染色中的应用。免疫胶体金法可分为直接法、间接法、色中的应用。免疫胶体金法可分为直接法、间接法、色中的应用。免疫胶体金法可分为直接法、间接法、色中的应用。免疫胶体金法可分为直接法、间接法、金标记抗原检查法和链霉抗生物素金标记抗原检查法和链霉抗生物素金标记抗原检查法和链霉抗生物素金标记抗原检查法和链霉抗生物素金法，最常用的金法，最常用的金法，最常用的金法，最常用的是间接法是间接法是间接法是间接法 第二节第二节 PCRPCR技术技术l l一、一、PCR原理原理l l多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）简称）简称PCR技术，是在模板技术，是在模板DNA、引物和、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。聚合酶的酶促反应。PCR技术技术的特异性取决于引物和模板的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。结合的特异性。l l反应分三步进行：反应分三步进行：反应分三步进行：反应分三步进行：变性（变性（变性（变性（denaturationdenaturation）：通过加）：通过加）：通过加）：通过加热使热使热使热使DNADNA双螺旋的氢键断裂形成单链双螺旋的氢键断裂形成单链双螺旋的氢键断裂形成单链双螺旋的氢键断裂形成单链DNADNA；l l退火（退火（退火（退火（anneallingannealling）：当温度突然降低时由于模板）：当温度突然降低时由于模板）：当温度突然降低时由于模板）：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物量分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物量分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物量分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物量大大多于模板大大多于模板大大多于模板大大多于模板DNADNA，使引物和其互补的模板在局部形，使引物和其互补的模板在局部形，使引物和其互补的模板在局部形，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板成杂交链，而模板成杂交链，而模板成杂交链，而模板DNADNA双链之间互补的机会较少；双链之间互补的机会较少；双链之间互补的机会较少；双链之间互补的机会较少；l l延伸（延伸（extension）：在）：在DNA聚合酶和聚合酶和4种种脱氧核糖核苷三磷酸底物及脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在条件下，存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链链延伸反应。以上延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量片段得到大量复制，数量可达到复制，数量可达到2106-7拷贝。拷贝。l l经过变性、退火和延伸一个循环，目的经过变性、退火和延伸一个循环，目的经过变性、退火和延伸一个循环，目的经过变性、退火和延伸一个循环，目的DNADNA数增加一数增加一数增加一数增加一倍，经过倍，经过倍，经过倍，经过n n次循环后，目的次循环后，目的次循环后，目的次循环后，目的DNADNA的数量为的数量为的数量为的数量为2n-2n2n-2n。PCRPCR扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定。在反应的初始阶段，原来的所决定。在反应的初始阶段，原来的所决定。在反应的初始阶段，原来的所决定。在反应的初始阶段，原来的DNADNA担负着起始担负着起始担负着起始担负着起始模板的作用，随着循规蹈矩环次数的增加，由引物介模板的作用，随着循规蹈矩环次数的增加，由引物介模板的作用，随着循规蹈矩环次数的增加，由引物介模板的作用，随着循规蹈矩环次数的增加，由引物介导延伸的片段急剧增加而成为主要模板。因此，绝大导延伸的片段急剧增加而成为主要模板。因此，绝大导延伸的片段急剧增加而成为主要模板。因此，绝大导延伸的片段急剧增加而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物多数扩增产物将受到所加引物多数扩增产物将受到所加引物多数扩增产物将受到所加引物55末端的限制，最终扩末端的限制，最终扩末端的限制，最终扩末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物增产物是介于两种引物增产物是介于两种引物增产物是介于两种引物55之间的之间的之间的之间的DNADNA片段。片段。片段。片段。图6-5PCR原理示意图二、PCR条件的优化l l（一）（一）（一）（一）PCRPCR反应的缓冲液反应的缓冲液反应的缓冲液反应的缓冲液l lPCRPCR反应中，缓冲液是一个重要的影响因素，特别是反应中，缓冲液是一个重要的影响因素，特别是反应中，缓冲液是一个重要的影响因素，特别是反应中，缓冲液是一个重要的影响因素，特别是其中的其中的其中的其中的MgMg2+2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率。能影响反应的特异性和扩增片段的产率。能影响反应的特异性和扩增片段的产率。能影响
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