肝病病理形态特点及免疫组化染色体会课件

肝病病理形肝病病理形态特点及免疫特点及免疫组化染化染色体会色体会肝病病理形态特点及免疫组化染色体会肝病病理形态特点及免疫组化1肝穿刺标本检查和处理原则肝穿刺标本检查和处理原则.肉眼观察肉眼观察 肝穿刺标本呈完整园柱状，长度肝穿刺标本呈完整园柱状，长度 典型的慢性肝炎肝纤维化标本呈竹节状外观典型的慢性肝炎肝纤维化标本呈竹节状外观肝硬化的穿刺标本，呈不规则碎块肝硬化的穿刺标本，呈不规则碎块2肝穿刺标本检查和处理原则.肉眼观察 2.石蜡切片石蜡切片 每张玻片上应放置超过个连续组织切片，有助于肝纤维化每张玻片上应放置超过个连续组织切片，有助于肝纤维化的病理诊断。的病理诊断。3.石蜡切片 3.染色染色 除常规染色供病理诊断用之外，根据条件除常规染色供病理诊断用之外，根据条件和需要作以下特殊染色：和需要作以下特殊染色：网状纤维染色，网状纤维染色，三色染色，三色染色，胶原纤维染色胶原纤维染色(或免疫组化或免疫组化 )4.染色 除常规染色供病理诊断用之外，根据条件4 5 5各种病因引起肝纤维的病理学特点各种病因引起肝纤维的病理学特点与与分期分期.慢性肝炎肝纤维化慢性肝炎肝纤维化 (方案）方案）6各种病因引起肝纤维的病理学特点与分期6活动性纤维间隔静止性纤维间隔活动性纤维间隔静止性纤维间隔7活动性纤维间隔静止性纤维间隔72.2.脂肪性肝病肝纤维化脂肪性肝病肝纤维化 3.3.穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液小叶中央区纤维化窦周纤维化小叶中央区纤维化窦周纤维化8脂肪性肝病肝纤维化 小叶中央区纤维化.肝糖原累积病肝纤维肝糖原累积病肝纤维 9.肝糖原累积病肝纤维 9.病病 红氨酸()染色,铜被染成深绿色10.病 红氨酸()染色,铜被染成深绿色10.血色病血色病 穿刺肝组织因含有大量含穿刺肝组织因含有大量含铁血黄素沉着呈火焰红色铁血黄素沉着呈火焰红色肝细胞普鲁氏蓝染色阳性11.血色病 肝细胞普鲁氏蓝染色阳性11.自身免疫性肝炎肝纤维化（）自身免疫性肝炎肝纤维化（）门管区肝细胞呈花环状排列门管区肝细胞呈花环状排列 ，表现为数个水样变，表现为数个水样变性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环状结构。状结构。12.自身免疫性肝炎肝纤维化（）12.原发性胆汁性肝硬化（）原发性胆汁性肝硬化（）期（间隔期）出现自身抗体期（间隔期）出现自身抗体()()，纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性期（肝硬化）期（肝硬化）静止静止 纤维间隔内无炎症或轻度炎症纤维间隔内无炎症或轻度炎症 活动活动 .13.原发性胆汁性肝硬化（）13.血吸虫性肝纤维化血吸虫性肝纤维化 14.血吸虫性肝纤维化 14肝癌()15肝癌()15肝癌病理诊断常用免疫组化和特染肝癌病理诊断常用免疫组化和特染 线粒体相关抗原，与无关对胎儿和成人肝细胞高度特异 (:阳性率）16肝癌病理诊断常用免疫组化和特染 16阳性率：1717:型染色长条分枝，管壁纤细，管腔狭窄，分布均匀弥漫.而非癌肝组织内极少见.18:18:,上皮性肿瘤标志物19:19:胆管型:肝细胞 胆管上皮，：最好的标志物20:20：:毛细胆管，转移性肝癌：:毛细胆管特异标志物之一21：21:胃肠道腺癌的主要标志物转移性腺癌：22:22:抗人上皮相关抗原转移性腺癌：:胃癌肝转移23:抗人上皮相关抗原23:胞质型，胞核型阳性胞质型，核周型阳性24:胞质型，胞核型阳性胞质型，核周型阳性24黏液染色：酸性黏多糖：兰色（胆管腺瘤腔内黏液）中性黏多糖,糖原：红色（假腺管型)25黏液染色：25免疫组织化学染色的几点体会免疫组织化学染色的几点体会一、组织和细胞标本制备一、组织和细胞标本制备目的：目的：()最大限度地保存组织结构。最大限度地保存组织结构。()最大限度地保存抗原性。最大限度地保存抗原性。注意事项：在选择组织处理方法前，先根据实验目注意事项：在选择组织处理方法前，先根据实验目的，参考抗体说明，确定组织处理方式的，参考抗体说明，确定组织处理方式(冰冻冰冻?石石蜡蜡?)。26免疫组织化学染色的几点体会一、组织和细胞标本制备26.取材（）原则：尽可能新鲜，动物标本可选（）原则：尽可能新鲜，动物标本可选 用动脉灌注固定。用动脉灌注固定。（）取材部位：尽量包括病灶和正常组（）取材部位：尽量包括病灶和正常组 织交界处，避免选择坏死组织。织交界处，避免选择坏死组织。（）避免挤压：受挤压组织不但影响（）避免挤压：受挤压组织不但影响 切片的观察，还造成非特异性切片的观察，还造成非特异性 免疫组化组织着色。免疫组化组织着色。27.取材（）原则：尽可能新鲜，动物标本可选27.固定根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。容器要大容器要大,固定液要宽余固定液要宽余.固定时间既要考虑充分固定固定时间既要考虑充分固定,又不能太长又不能太长(依组织块依组织块厚薄大小从至天厚薄大小从至天,太长可溶性抗原会渗漏太长可溶性抗原会渗漏,阳性会阳性会减弱甚至转阴减弱甚至转阴.选择最合适的固定剂选择最合适的固定剂,如用福尔马林如用福尔马林,必须用缓冲福必须用缓冲福尔马林尔马林28.固定根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新鲜.制备蜡块冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋温石蜡包埋,如无低温石蜡如无低温石蜡,可将组织块尽可可将组织块尽可能修薄能修薄,以缩短脱水、透明、包埋时间以缩短脱水、透明、包埋时间,尽可尽可能保存组织内抗原稳定。能保存组织内抗原稳定。29.制备蜡块冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋,如.制备冰冻切片冷冻包埋能较好保存抗原,新鲜与已固定材料均适合于冷冻包埋、切片。防止冰结晶!预处理:目的是减少组织中的水分以减少冰结晶的产生,方法是将已固定、冲洗的组织块放入蔗糖缓冲液内冰箱过夜,再将组织块埋于包埋剂速冻:目的是使温度很快下降迅速通过冰点,防止冰结晶产生。30.制备冰冻切片冷冻包埋能较好保存抗原,新鲜与已固定材料均适合速冻方法液液氮氮法法:将将包包埋埋的的组组织织块块投投入入液液氮氮数数秒秒,等等组组织织块块冻冻结结后后,立立即即移移入入低低温温冰冰箱箱(装装入入封封口口塑塑料料袋袋内内密密封封)或或放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片;干干冰冰丙丙酮酮法法:将将丙丙酮酮注注入入小小型型广广口口保保温温瓶瓶或或保保温温杯杯内内,逐逐渐渐加加入入干干冰冰至至饱饱和和不不再再冒冒泡泡为为止止,温温度度可可达达;将将装装有有异异戊戊烷烷的的小小烧烧杯杯缓缓慢慢置置入入干干冰冰丙丙酮酮饱饱和和液液中中;然然后后将将包包埋埋的的组组织织块块投投入入异异戊戊烷烷内内速速冻冻半半分分至至一一分钟。分钟。31速冻方法液氮法:将包埋的组织块投入液氮数秒,等组织块冻结后,免疫组化染色后的衬染常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果阳性信号在细胞核阳性信号在细胞核,切勿衬染细胞核切勿衬染细胞核!细胞质衬染亮绿细胞质衬染亮绿,但退色较快但退色较快,可改用坚固绿可改用坚固绿()染染,则保存时间较长则保存时间较长32免疫组化染色后的衬染常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果阳性封固和保存封固和保存绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用以外的底物应注意有色沉固，但如用以外的底物应注意有色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固物如明胶、甘油缓冲液等。物如明胶、甘油缓冲液等。酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。33封固和保存绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用以外的底一一.常用免疫组织化学方法常用免疫组织化学方法免疫荧光免疫荧光:用于培养细胞效果较好用于培养细胞效果较好,石蜡切片因常有自发荧光石蜡切片因常有自发荧光,背景背景荧光较强荧光较强,用时要注意用时要注意 (异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素)用用 光激发光激发 滤片观察滤片观察,呈翠绿色呈翠绿色 (四乙基罗达明四乙基罗达明)用光激发用光激发,滤片观察滤片观察,呈橘红色呈橘红色 (四甲基异硫氰酸罗达明四甲基异硫氰酸罗达明)用用 光激发滤片观察光激发滤片观察,呈红色呈红色 用光激发用光激发,滤片观察滤片观察,呈红色呈红色 直接免疫荧光法直接免疫荧光法:间接免疫荧光法间接免疫荧光法 双重荧光染色双重荧光染色34一.常用免疫组织化学方法34.免疫组织化学免疫组织化学常用方法:或 (二步法)35.免疫组织化学常用方法:35世纪年（）()3636世纪年代（）许世民 （亲和免疫组化）37世纪年代（）许世民 （亲和免疫组化）37年代中期：()(,)简称二步法 含 38年代中期：()38如何做好免疫组化染色?什么才是高质量的免疫组化染色什么才是高质量的免疫组化染色?阳性信号突出阳性信号突出无背景染色无背景染色切片平整切片平整无破裂碎无破裂碎,无污秽无污秽39如何做好免疫组化染色?什么才是高质量的免疫组化染色?39做好免疫组化染色几点体会.组织细胞处理:固定剂 固定时间 速冻防冰结晶 白片质量好:平整,无破裂碎,无污秽 防脱片:玻片绝对干净 涂粘合剂:白胶 多聚赖氨酸 铬明矾明胶液 甲醛明胶液 贴片后冷风吹干或 烘干 40做好免疫组化染色几点体会.组织细胞处理:40.抗体:特异性,高效价,亲合力,适度稀释度.石蜡切片 抗原修复 ()蛋白酶消化:胰蛋白酶 胰糜蛋白酶 链霉蛋白酶 蛋白酶 胃蛋白酶 消化不足 修复失败,假阴性或信号弱 消化过度 结构破环,脱片 ()热修复:微波照射 高压加热 水浴加热 ()微波蛋白酶消化 注意点:固定时间长,消化时间或热修复时间适当延长 酶生产厂家不一,或批号不一,消化时间可能也不一 热修复的介质要选合适,必须要加钙螯合剂 预实验摸最佳方案 41.抗体:特异性,高效价,亲合力,适度稀释度41阳性结果的判断阳性结果的判断“边界效应”引起假阳性均匀一致的着色,假阳性可能极大根据阳性信号的分布:核抗原应该在核内,有时胞质也可阳性;膜抗原应在细胞膜,有时胞质也可阳性;胞质抗原应在细胞质.转录因子或核内受体应在核内或胞质内.如出现异常分布,则假阳性可能很大.42阳性结果的判断“边界效应”引起假阳性42谢谢观赏谢谢观赏谢谢观赏43