耐药结核病诊断新技术课件

耐药结核病诊断新技术耐药结核病诊断新技术耐药结核病诊断新技术耐药结核病诊断新技术主要内容一、概述二、基因芯片技术三、熔解曲线技术2020/11/142主要内容一、概述2020/11/142全球范围内结核病疫情全球范围内结核病疫情严重严重 患病率高：新发患者1040万/年，其中有120万（11%）HIV患者；死亡率高：每年死亡人数达140万（13.46%），HIV/TB:死亡人数40万（33.33%）；耐药率高：48万新发的MDR-TB病例和10万耐利福平结核病（RR-TB）病例；接受MDR检测、报告和治疗的MDR-TB不足1/3，接受治疗的MDR-TB治愈成功率只有50%2016年全球结核病报告年全球结核病报告2020/11/143全球范围内结核病疫情严重2016年全球结核病报告2020/12020/11/1442020/11/1442015年全球估计MDR-TB患者数2020/11/1452015年全球估计MDR-TB患者数2020/11/145结核病快速及时诊断是结核病防控重要因素2020/11/146结核病快速及时诊断是结核病防控重要因素2020/11/14灵敏准确操作简便检测时间短闭管检测检测位点全面对新型耐药检测技术的要求2020/11/147灵敏准确操作简便检测时间短闭管检测检测位点全面对新型耐药检测2020/11/1482020/11/148基因芯片技术2020/11/149基因芯片技术2020/11/149结核病耐药与基因64-68%rpsL基因突变70%embB基因突变70%65%耐药基因93%95%95%rpoB基因突变利福平异烟肼50-70%katG基因突变5-10%inhA基因突变6-13%ahpC基因启动子区域突变链霉素乙胺丁醇 多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产生耐药2020/11/1410结核病耐药与基因64-68%rps L 基因突变70%e2020/11/14112020/11/1411基因芯片（原理）激光共焦扫描仪软件判读样品制备仪杂交仪 基因芯片方法是基于结核杆菌的利福平和异烟肼耐药基因芯片方法是基于结核杆菌的利福平和异烟肼耐药性相关的性相关的rpoB/katG/inhArpoB/katG/inhA的基因位点发生突变，通过的基因位点发生突变，通过PCRPCR扩增、和固定于尼龙膜上的寡核苷酸探针进行杂交、扫描，扩增、和固定于尼龙膜上的寡核苷酸探针进行杂交、扫描，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和结核菌检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和结核菌耐药性耐药性。基因芯片仪和试剂获国家SFDA和欧盟CE认证122020/11/1412基因芯片（原理）激光共焦扫描仪软件判读样品制备仪杂交仪 基因芯片法2020/11/1413基因芯片法2020/11/14132020/11/14142020/11/1414利福平的耐药位点利福平的耐药位点2020/11/1415利福平的耐药位点2020/11/1415同时鉴定MTC与21种NTM2020/11/1416同时鉴定MTC与21种NTM2020/11/1416非结核分枝杆菌2020/11/1417非结核分枝杆菌2020/11/1417在国内在国内4个省的个省的4个地市级个地市级CDC进行了评估。进行了评估。2020/11/1418在国内4个省的4个地市级CDC进行了评估。2020/11/1结核病和非结核的诊断2020/11/1419结核病和非结核的诊断2020/11/1419特特 点点标本：菌株、涂阳痰标本标本：菌株、涂阳痰标本 时间：约时间：约8 8小时小时优点：高通量优点：高通量灵敏度、特异度高灵敏度、特异度高2020/11/1420特 点标本：菌株、涂阳痰标本 2020/11/142国家结核病参比实验室推荐建议基因芯片可以用于:可疑耐药结核病患者筛查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验推荐理由:在我国获得注册证书；国内研究显示其敏感性和特异性较好；民族品牌数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；可能使用层级:地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）2020/11/1421国家结核病参比实验室推荐建议基因芯片可以用于:推荐理由:可探针熔解曲线技术2020/11/1422探针熔解曲线技术2020/11/1422工作原理 在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定，当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。Tm2020/11/1423工作原理 在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tv96%利福平耐药突变发生在利福平耐药突变发生在rpoB507-533共共81bp区域内区域内利福平耐药突变检测体系示意图根据靶序列熔点的根据靶序列熔点的变变化，化，检测检测rpoB基因基因 是否含有突是否含有突变变，获获得利福平耐得利福平耐药药信息信息2020/11/142496%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区根据不同的根据不同的Tm值可以判断出值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变可能不同的碱基发生突变2020/11/1425根据不同的Tm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变22020/11/14262020/11/1426根据不同的根据不同的Tm值可以判断出值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变可能不同的碱基发生突变2020/11/1427根据不同的Tm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变2异烟肼耐药突变检测体系示意图通过检测通过检测 katG315、inhA 启动子和、启动子和、ahpC 启动子区、启动子区、inhA94、密码子的突变、密码子的突变与否确定样品对异烟肼的耐药性。与否确定样品对异烟肼的耐药性。2020/11/1428异烟肼耐药突变检测体系示意图通过检测 katG315、inh根据不同的根据不同的Tm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变2020/11/1429根据不同的Tm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变20根据不同的根据不同的Tm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变2020/11/1430根据不同的Tm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变20乙胺丁醇乙胺丁醇链霉素链霉素氟喹诺酮氟喹诺酮每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的熔点,软件可以自动地给出突变类型,即使发生不均一突变的情况,也可以分辨出来.2020/11/1431乙胺丁醇链霉素氟喹诺酮每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的步骤二加入1-96个提取样本到检测管中步骤三集成多重PCR和结果自动报告步骤一自动提取1-24份样本操作流程总耗时约3小时，手工操作时间约15分钟2020/11/1432步骤二步骤三步骤一操作流程总耗时约3小时，手工操作时间约15（一）DNA提取40 min高质量的样本DNA2020/11/1433（一）DNA提取40 min高质量的样本DNA2020/1（二）加入PCR反应管2020/11/1434（二）加入PCR反应管2020/11/1434（三）PCR过程和自动判读2020/11/1435（三）PCR过程和自动判读2020/11/1435痰标本纯化DNA qPCR 检测结果 靶序列扩增曲线：靶序列扩增曲线：内参扩增曲线内参扩增曲线：不同标本的内参扩增结果一致，显示纯化后的DNA溶液对扩增无抑制。高纯度模板DNA是分子检测可靠性的关键！2020/11/1436痰标本纯化DNA qPCR 检测结果 靶序列扩增曲线：临床试验结果此外，在北京胸科医院、广州胸科医院、沈阳胸科医院、乌鲁木齐胸科医院、山东省胸科医院、河南省CDC、厦门市CDC等单位进行临床应用或验证，均获得满意结果。2020/11/1437临床试验结果此外，在北京胸科医院、广州胸科医院、沈阳胸科医院探针熔解曲线技术耐多药检测的评估2020/11/1438探针熔解曲线技术耐多药检测的评估2020/11/1438技术比较2020/11/1439技术比较2020/11/14392020/11/14402020/11/1440谢谢！谢谢！